CN112868530A - 一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法 - Google Patents

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CN112868530A CN202110342407.2A CN202110342407A CN112868530A CN 112868530 A CN112868530 A CN 112868530A CN 202110342407 A CN202110342407 A CN 202110342407A CN 112868530 A CN112868530 A CN 112868530A
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卓仁英
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韩小娇
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Abstract

本发明公开了一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法，步骤包括：获得灰胡杨幼叶和茎段，农杆菌侵染叶片外植体，外植体的抗性筛选，外植体的继代培养，外植体的生根培养，转基因植株的移土培养。可实现灰胡杨的转基因植株的快速培育，为灰胡杨功能基因的研究和育种奠定基础，为创制培育出镉高积累的灰胡杨新种质提供技术支撑。

Description

一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法
技术领域
本发明属于生物技术和现代农业技术领域，具体地说，涉及一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法。
背景技术
灰胡杨具有造林和育苗成活率高、生长快、树干形通直圆满、抗溃疡病和抗天牛，还有较强的重金属镉离子富集能力，具有较好的经济价值和生态价值，是营造速生丰产林的首选树种。
利用组织培养技术，离体杨树幼叶能形成不定芽，经诱导生根后成长为再生植株。现有杨树组织培养和转基因体系仅适合于青杨组背景的NL895或者白杨组背景的84K，无法满足胡杨组背景的灰胡杨组培和遗传转化的要求。
发明内容
有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法，以灰胡杨幼叶和茎段作为基因受体材料，通过农杆菌介导的遗传转化再生体系具有方法简单，可靠性高，易操作的特点，将为现代生物技术应用于灰胡杨品种改良开辟新的途径。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法，包括以下步骤：
步骤1、获得灰胡杨幼叶和茎段：用灰胡杨无菌苗培养基培养灰胡杨幼苗获得叶片和茎段；在超净台中，用无菌剪刀将灰胡杨无菌幼苗完全展开叶剪下置于湿润的滤纸；
步骤2、农杆菌侵染叶片外植体：吸取含有目的基因质粒pK2GW7-CAD的农杆菌菌液于YM固定培养基划粗线，28℃的温度条件下培养48～60h，至菌体完全复苏长成光滑圆润的菌落；用无菌药勺刮取菌体，并用侵染液将菌液浓度OD600稀释至0.3～0.6；将置于湿滤纸上的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染12min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，加叶片置于两片干滤纸间吸干残留菌液，将叶片正面朝上，均匀摆放在放共培养培养基上；封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；
步骤3、外植体的抗性筛选：将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；5d后将叶片转移至新的分化培养基上；每14d更换一次分化培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基；
步骤4、外植体的继代培养：将外植体愈伤组织分化出的芽转移至含有壮苗培养基培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；每14d更换一次培养基，直至芽伸长2～4cm；
步骤5、外植体的生根培养
当培养基中的芽伸长至2～4cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；2～3周，见到幼根，将生根幼苗移至生长培养基；至根生长丰富见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；
步骤6、转基因植株的移土培养：
转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，转移至培养土中生长；将转基因幼苗从生长培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，稍压实；光照培养1～2周，转基因苗适应环境后，慢慢将培养瓶盖移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；适应外界环境后将幼苗移植到普通培养基质中生长。
可选地，灰胡杨无菌苗培养基为：WPM+BA0.1-0.3mg/L+NAA0.05-0.15mg/L+TDZ0.01-0.05mg/L+蔗糖25-35g/L+琼脂5-10g/L，pH5.8。
可选地，所述步骤1中的无菌苗培养基培养灰胡杨幼苗的培养温度23-28℃，每天光照14-18小时。
可选地，所述步骤1中的灰胡杨叶片和茎段选择灰胡杨幼叶第3至4叶和茎段，叶片长度为25-35毫米、茎段长度为30-40毫米。
可选地，所述步骤2中的划线培养的培养基为YM培养基+50mg/L含卡那霉素+25mg/L利福平，28℃培养3天；侵染液中添加乙酰丁香酮浓度为100μmol/L。
可选地，所述步骤3中的分化培养基具体的配置方法为：称取WPM盐2.41g，30g蔗糖，0.2mg/L BA，0.1mg/L NAA，0.01mg/LTDZ加蒸馏水至1L，完全溶解后加1M KOH溶液，将pH调至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min冷却至60℃，加Hyg至终浓度2.5mg/L，加入cef至终浓度300mg/L。
可选地，所述步骤4中的所述壮苗培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入BA至终浓度0.1mg/L，加入IBA至终浓度0.25mg/L，pH调节至5.8，高温灭菌冷却后加潮霉素至终浓度6mg/L，加入头孢霉素至终浓度300mg/L。
可选地，所述步骤5中的生根培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入IBA至终浓度0.1mg/L，pH调节至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min。
可选地，所述步骤5中的生长培养基组成为：WPM+蔗糖25-35g/L+琼脂5-10g/L，pH5.8。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
本发明可实现灰胡杨的转基因植株的快速培育，为灰胡杨功能基因的研究和育种奠定基础，为创制培育出镉高积累的灰胡杨新种质提供技术支撑。本发明各个步骤和参数之间协同作用，进一步提高了转基因的效率。本发明方法操作简便易行，成本低廉，适合广泛使用，具有巨大的科研价值、经济价值和生态价值。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明灰胡杨无菌苗茎段利用本发明的方法在分化培养基上诱导丛生芽；
图2是本发明灰胡杨无菌苗茎段利用本发明的方法诱导的阳性丛生芽转入壮苗培养基；
图3是本发明灰胡杨无菌苗茎段利用本发明的方法伸长的丛生芽在生根培养基诱导生根；
图4是本发明灰胡杨无菌苗茎段利用本发明的方法生根的阳性苗被转入无菌土培育。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法，以灰胡杨幼叶和茎段作为基因受体材料进行农杆菌介导，从而获得转基因植株，包括以下步骤：
步骤1、获得灰胡杨幼叶和茎段：用灰胡杨无菌苗培养基培养灰胡杨幼苗获得叶片和茎段，培养温度23-28℃，每天光照14-18小时；在超净台中，用无菌剪刀将灰胡杨无菌幼苗完全展开叶剪下置于湿润的滤纸，防止失水，具体为：用无菌手术刀将叶片横向划2-3下但不断；选取灰胡杨幼叶第3至4叶和茎段，叶片长度为25-35毫米、茎段长度为30-40毫米；
其中，灰胡杨无菌苗培养基为：
WPM+BA0.1-0.3mg/L+NAA0.05-0.15mg/L+TDZ0.01-0.05mg/L+蔗糖25-35g/L+琼脂5-10g/L，pH5.8。
步骤2、农杆菌侵染叶片外植体：
吸取含有目的基因质粒pK2GW7-CAD(Qiu et al.,2018)的农杆菌菌保于YM固定培养基划粗线，28℃的温度条件下培养48～60h，至菌体完全复苏长成光滑圆润的菌落；用无菌药勺刮取菌体，并用侵染液将菌液浓度OD600稀释至0.3～0.6；将置于湿滤纸上的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染12min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，加叶片置于两片干滤纸间吸干残留菌液，将叶片正面朝上，均匀摆放在放共培养培养基上；封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；
其中，划线培养的培养基为YM培养基+50mg/L含卡那霉素+25mg/L利福平，28℃培养3天；侵染液中添加乙酰丁香酮浓度为100μmol/L。
步骤3、外植体的抗性筛选
将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；为保证分化培养基的营养成分和抗性效价满足叶片的生长和抗性筛选，5d后将叶片转移至新的分化培养基上；每14d更换一次分化培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基；
所述分化培养基具体的配置方法为：称取WPM盐2.41g，30g蔗糖，0.2mg/L BA，0.1mg/L NAA，0.01mg/LTDZ加蒸馏水至1L，完全溶解后加1M KOH溶液，将pH调至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min冷却至60℃左右，加潮霉素(hygromycin)至终浓度2.5mg/L，加入头孢霉素(Cefotaxime)至终浓度300mg/L。cef作为抗生素可以有效地抑制农杆菌过度繁殖造成的不利影响。
步骤4、外植体的继代培养
为促进外植体愈伤组织分化出的芽进一步生长和伸长发育，将其转移至含有壮苗培养基培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；为保证培养基的营养成分和抗性效价满足芽的伸长生长和抗性筛选，每14d更换一次培养基，直至芽伸长2～4cm；
所述壮苗培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入BA至终浓度0.1mg/L，加入IBA至终浓度0.25mg/L，pH调节至5.8，高温灭菌冷却后加Hyg至终浓度6mg/L，加入cef至终浓度300mg/L。
步骤5、外植体的生根培养
当培养基中的芽伸长至2～4cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；2～3周，可以见到幼根，将生根幼苗移至生长培养基；至根生长丰富可见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；
所述生根培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入IBA至终浓度0.1mg/L，pH调节至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min。
生长培养基组成为：WPM+蔗糖25-35g/L+琼脂5-10g/L，pH 5.8。
步骤6、转基因植株的移土培养：
转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，可转移至培养土中生长；将转基因幼苗从生长培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，稍压实；光照培养1～2周，转基因苗适应环境后，慢慢将培养瓶盖移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；适应外界环境后可将幼苗移植到普通培养基质中生长。
外植体的选择对转化效率有着重要影响，无菌苗的苗龄，外植体的类型，大小以及在培养基上的放置方向都对转化效率有影响；因此我们选择在完全展开无菌幼苗叶片，划2-3刀但不断，并正面朝上放置于培养基上，此时期的叶片木质化程度较低，且农杆菌对外植体的毒害作用也较小，极大的提高了灰胡杨的遗传转化效率。
实施例1
一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法，以灰胡杨幼叶和茎段作为基因受体材料进行农杆菌介导，从而获得转基因植株，包括以下步骤：
步骤1、获得灰胡杨幼叶和茎段：用灰胡杨无菌苗培养基培养灰胡杨幼苗获得叶片和茎段，培养温度25℃，每天光照16小时；在超净台中，用无菌剪刀将灰胡杨无菌幼苗完全展开叶剪下置于湿润的滤纸，具体为：用无菌手术刀将叶片横向划2-3下但不断；选取灰胡杨幼叶第3至4叶和茎段，叶片长度为30毫米、茎段长度为35毫米；
其中，灰胡杨无菌苗培养基为：
WPM+BA0.2mg/L+NAA0.10mg/L+TDZ0.01mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。
步骤2、农杆菌侵染叶片外植体：
吸取含有目的基因质粒pK2GW7-CAD的农杆菌菌液于YM固定培养基划粗线，28℃的温度条件下培养54h，至菌体完全复苏长成光滑圆润的菌落；用无菌药勺刮取菌体，并用侵染液将菌液浓度OD600稀释至0.3～0.6；将置于湿滤纸上的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染12min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，加叶片置于两片干滤纸间吸干残留菌液，将叶片正面朝上，均匀摆放在放共培养培养基上；封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；
其中，划线培养的培养基为YM培养基+50mg/L含卡那霉素+25mg/L利福平，28℃培养3天；侵染液中添加乙酰丁香酮浓度为100μmol/L。
步骤3、外植体的抗性筛选
将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；为保证分化培养基的营养成分和抗性效价满足叶片的生长和抗性筛选，5d后将叶片转移至新的分化培养基上；每14d更换一次分化培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基；
所述分化培养基具体的配置方法为：称取WPM盐2.41g，30g蔗糖，0.2mg/L BA，0.1mg/L NAA，0.01mg/LTDZ加蒸馏水至1L，完全溶解后加1M KOH溶液，将pH调至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min冷却至60℃左右，加Hyg至终浓度2.5mg/L，加入cef至终浓度300mg/L。cef作为抗生素可以有效地抑制农杆菌过度繁殖造成的不利影响。
步骤4、外植体的继代培养：
为促进外植体愈伤组织分化出的芽进一步生长和伸长发育，将其转移至含有壮苗培养基培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；为保证培养基的营养成分和抗性效价满足芽的伸长生长和抗性筛选，每14d更换一次培养基，直至芽伸长2～4cm；
所述壮苗培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入BA至终浓度0.1mg/L，加入IBA至终浓度0.25mg/L，pH调节至5.8，高温灭菌冷却后加Hyg至终浓度6mg/L，加入cef至终浓度300mg/L。
步骤5、外植体的生根培养
当培养基中的芽伸长至2～4cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；2～3周，可以见到幼根，将生根幼苗移至生长培养基；至根生长丰富可见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；
所述生根培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入IBA至终浓度0.1mg/L，pH调节至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min。
生长培养基组成为：WPM+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，pH 5.8。
步骤6、转基因植株的移土培养：
转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，可转移至培养土中生长；将转基因幼苗从生长培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，稍压实；光照培养1～2周，转基因苗适应环境后，慢慢将培养瓶盖移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；适应外界环境后可将幼苗移植到普通培养基质中生长。
实施例2
一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法，以灰胡杨幼叶和茎段作为基因受体材料进行农杆菌介导，从而获得转基因植株，包括以下步骤：
步骤1、获得灰胡杨幼叶和茎段：用灰胡杨无菌苗培养基培养灰胡杨幼苗获得叶片和茎段，培养温度23℃，每天光照18小时；在超净台中，用无菌剪刀将灰胡杨无菌幼苗完全展开叶剪下置于湿润的滤纸，具体为：用无菌手术刀将叶片横向划2-3下但不断；选取灰胡杨幼叶第3至4叶和茎段，叶片长度为25毫米、茎段长度为40毫米；
其中，灰胡杨无菌苗培养基为：
WPM+BA0.1mg/L+NAA0.15mg/L+TDZ0.01mg/L+蔗糖35g/L+琼脂5g/L，pH5.8。
步骤2、农杆菌侵染叶片外植体：
吸取含有目的基因质粒pK2GW7-CAD的农杆菌菌液于YM固定培养基划粗线，28℃的温度条件下培养48h，至菌体完全复苏长成光滑圆润的菌落；用无菌药勺刮取菌体，并用侵染液将菌液浓度OD600稀释至0.3～0.6；将置于湿滤纸上的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染12min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，加叶片置于两片干滤纸间吸干残留菌液，将叶片正面朝上，均匀摆放在放共培养培养基上；封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；
其中，划线培养的培养基为YM培养基+50mg/L含卡那霉素+25mg/L利福平，28℃培养3天；侵染液中添加乙酰丁香酮浓度为100μmol/L。
步骤3、外植体的抗性筛选
将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；为保证分化培养基的营养成分和抗性效价满足叶片的生长和抗性筛选，5d后将叶片转移至新的分化培养基上；每14d更换一次分化培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基；
所述分化培养基具体的配置方法为：称取WPM盐2.41g，30g蔗糖，0.2mg/L BA，0.1mg/L NAA，0.01mg/LTDZ加蒸馏水至1L，完全溶解后加1M KOH溶液，将pH调至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min冷却至60℃左右，加Hyg至终浓度2.5mg/L，加入cef至终浓度300mg/L。cef作为抗生素可以有效地抑制农杆菌过度繁殖造成的不利影响。
步骤4、外植体的继代培养：
为促进外植体愈伤组织分化出的芽进一步生长和伸长发育，将其转移至含有壮苗培养基培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；为保证培养基的营养成分和抗性效价满足芽的伸长生长和抗性筛选，每14d更换一次培养基，直至芽伸长2～4cm；
所述壮苗培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入BA至终浓度0.1mg/L，加入IBA至终浓度0.25mg/L，pH调节至5.8，高温灭菌冷却后加Hyg至终浓度6mg/L，加入cef至终浓度300mg/L。
步骤5、外植体的生根培养
当培养基中的芽伸长至2～4cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；2～3周，可以见到幼根，将生根幼苗移至生长培养基；至根生长丰富可见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；
所述生根培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入IBA至终浓度0.1mg/L，pH调节至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min。
生长培养基组成为：WPM+蔗糖25-35g/L+琼脂5-10g/L，pH 5.8。
步骤6、转基因植株的移土培养：
转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，可转移至培养土中生长；将转基因幼苗从生长培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，稍压实；光照培养1～2周，转基因苗适应环境后，慢慢将培养瓶盖移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；适应外界环境后可将幼苗移植到普通培养基质中生长。
实施例3
一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法，以灰胡杨幼叶和茎段作为基因受体材料进行农杆菌介导，从而获得转基因植株，包括以下步骤：
步骤1、获得灰胡杨幼叶和茎段：用灰胡杨无菌苗培养基培养灰胡杨幼苗获得叶片和茎段，培养温度28℃，每天光照14小时；在超净台中，用无菌剪刀将灰胡杨无菌幼苗完全展开叶剪下置于湿润的滤纸，具体为：用无菌手术刀将叶片横向划2-3下但不断；选取灰胡杨幼叶第3至4叶和茎段，叶片长度为35毫米、茎段长度为30毫米；
其中，灰胡杨无菌苗培养基为：
WPM+BA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+TDZ0.05mg/L+蔗糖25g/L+琼脂10g/L，pH5.8。
步骤2、农杆菌侵染叶片外植体：
吸取含有目的基因质粒pK2GW7-CAD的农杆菌菌液于YM固定培养基划粗线，28℃的温度条件下培养60h，至菌体完全复苏长成光滑圆润的菌落；用无菌药勺刮取菌体，并用侵染液将菌液浓度OD600稀释至0.3～0.6；将置于湿滤纸上的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染12min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，加叶片置于两片干滤纸间吸干残留菌液，将叶片正面朝上，均匀摆放在放共培养培养基上；封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；
其中，划线培养的培养基为YM培养基+50mg/L含卡那霉素+25mg/L利福平，28℃培养3天；侵染液中添加乙酰丁香酮浓度为100μmol/L。
步骤3、外植体的抗性筛选
将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；为保证分化培养基的营养成分和抗性效价满足叶片的生长和抗性筛选，5d后将叶片转移至新的分化培养基上；每14d更换一次分化培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基，如图1所示；
所述分化培养基具体的配置方法为：称取WPM盐2.41g，30g蔗糖，0.2mg/L BA，0.1mg/L NAA，0.01mg/LTDZ加蒸馏水至1L，完全溶解后加1M KOH溶液，将pH调至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min冷却至60℃左右，加Hyg至终浓度2.5mg/L，加入cef至终浓度300mg/L。cef作为抗生素可以有效地抑制农杆菌过度繁殖造成的不利影响。
步骤4、外植体的继代培养：
为促进外植体愈伤组织分化出的芽进一步生长和伸长发育，将其转移至含有壮苗培养基培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；为保证培养基的营养成分和抗性效价满足芽的伸长生长和抗性筛选，每14d更换一次培养基，直至芽伸长2～4cm，如图2所示；
所述壮苗培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入BA至终浓度0.1mg/L，加入IBA至终浓度0.25mg/L，pH调节至5.8，高温灭菌冷却后加Hyg至终浓度6mg/L，加入cef至终浓度300mg/L。
步骤5、外植体的生根培养
当培养基中的芽伸长至2～4cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；2～3周，可以见到幼根，将生根幼苗移至生长培养基；至根生长丰富可见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶，如图3所示；
所述生根培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入IBA至终浓度0.1mg/L，pH调节至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min。
生长培养基组成为：WPM+蔗糖25-35g/L+琼脂5-10g/L，pH 5.8。
步骤6、转基因植株的移土培养：
转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，可转移至培养土中生长；将转基因幼苗从生长培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，稍压实；光照培养1～2周，转基因苗适应环境后，慢慢将培养瓶盖移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；适应外界环境后可将幼苗移植到普通培养基质中生长，如图4所示。
本发明还具有以下优点：
1、本发明方法简化了遗传转化的程序，整体过程较为简单，有效地缩短了转化周期；
2、本发明方法使得转基因后代遗传趋于稳定，操作简单，外源基因得到了表达水平明显提升；
3、转化效率大大提高：
3.1、本发明选择灰胡杨幼苗完全展开叶，用刀片划开但不断，并正面超上放置于培养基上，此时期的叶木质化程度较低，且农杆菌对外植体的毒害作用也较小，极大的提高了灰胡杨的遗传转化效率；且在培养时间上选择2d，此时，外植体的切口处细胞分裂明显，并有少量愈伤组织形成，且切口部分愈合，外植体可正常生长，T-DNA容易整合的植物基因组中，转化效率明显提高；
3.2、本发明方法选取叶为外植体，农杆菌OD600≈0.3，侵染12min，转化率在75％左右，相对于NL895杨而言，转化效率有所提升，因为此时农杆菌浓度适宜，不会因过高而造成繁殖速度快，外植体死亡或过低造成侵染效果不佳等问题。侵染时间上我们控制在12min左右不仅给了农杆菌充分接触外植体的时间，也极大的避免了因农杆菌的毒害作用导致的外植体缺氧或软腐死亡，2d的共培养时间，避免了农杆菌的大量繁殖造成的后期除菌困难，降低了植物细胞的损伤；
3.3、在培养基的配置上，针对灰胡杨的植物生长调节剂配比，分化培养基加入BA与NAA的比例为2:1，此外加入潮霉素(Hyg)作为抗性筛选的标记，同时加入cef作为抗生素可以有效地抑制农杆菌过度繁殖造成的不利影响，而对转化效率不会造成负面影响。此外，分化培养基中还加入了生长调节剂TDZ，能有效的促进外植体分化。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种灰胡杨组织培养及遗传转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、获得灰胡杨幼叶和茎段：用灰胡杨无菌苗培养基培养灰胡杨幼苗获得叶片和茎段；在超净台中，用无菌剪刀将灰胡杨无菌幼苗完全展开叶剪下置于湿润的滤纸；
步骤2、农杆菌侵染叶片外植体：吸取含有目的基因质粒pK2GW7-CAD的农杆菌菌液于YM固定培养基划粗线，28℃的温度条件下培养48～60h，至菌体完全复苏长成光滑圆润的菌落；用无菌药勺刮取菌体，并用侵染液将菌液浓度OD600稀释至0.3～0.6；将置于湿滤纸上的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染12min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，加叶片置于两片干滤纸间吸干残留菌液，将叶片正面朝上，均匀摆放在放共培养培养基上；封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；
步骤3、外植体的抗性筛选：将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；5d后将叶片转移至新的分化培养基上；每14d更换一次分化培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基；
步骤4、外植体的继代培养：将外植体愈伤组织分化出的芽转移至含有壮苗培养基培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；每14d更换一次培养基，直至芽伸长2～4cm；
步骤5、外植体的生根培养
当培养基中的芽伸长至2～4cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；2～3周，见到幼根，将生根幼苗移至生长培养基；至根生长丰富见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；
步骤6、转基因植株的移土培养：
转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，转移至培养土中生长；将转基因幼苗从生长培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，稍压实；光照培养1～2周，转基因苗适应环境后，慢慢将培养瓶盖移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；适应外界环境后将幼苗移植到普通培养基质中生长。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，灰胡杨无菌苗培养基为：WPM+BA0.1-0.3mg/L+NAA0.05-0.15mg/L+TDZ0.01-0.05mg/L+蔗糖25-35g/L+琼脂5-10g/L，pH5.8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的无菌苗培养基培养灰胡杨幼苗的培养温度23-28℃，每天光照14-18小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1中的灰胡杨叶片和茎段选择灰胡杨幼叶第3至4叶和茎段，叶片长度为25-35毫米、茎段长度为30-40毫米。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中的划线培养的培养基为YM培养基+50mg/L含卡那霉素+25mg/L利福平，28℃培养3天；侵染液中添加乙酰丁香酮浓度为100μmol/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中的分化培养基具体的配置方法为：称取WPM盐2.41g，30g蔗糖，0.2mg/L BA，0.1mg/L NAA，0.01mg/LTDZ加蒸馏水至1L，完全溶解后加1M KOH溶液，将pH调至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min冷却至60℃，加Hyg至终浓度2.5mg/L，加入cef至终浓度300mg/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中的所述壮苗培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入BA至终浓度0.1mg/L，加入IBA至终浓度0.25mg/L，pH调节至5.8，高温灭菌冷却后加潮霉素至终浓度6mg/L，加入头孢霉素至终浓度300mg/L。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5中的生根培养基的具体配置方法为：WPM培养基加入20g/L蔗糖，加入IBA至终浓度0.1mg/L，pH调节至5.8，加入7g琼脂粉末，120℃，高压灭菌20min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5中的生长培养基组成为：WPM+蔗糖25-35g/L+琼脂5-10g/L，pH 5.8。
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