CN111850036A - 一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法 - Google Patents

一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，提供了一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法。所述方法具体包括：无菌番茄叶片外植体的获得；农杆菌侵染叶片外植体；外植体的抗性筛选；外植体的继代培养；外植体的生根培养；转基因植株的移土培养；本发明方法简化了遗传转化的程序，整体过程较为简单，有效地缩短了转化周期；使得转基因后代遗传趋于稳定，操作简单，外源基因得到了表达水平明显提升，使得转化效率大大提高。

Description

一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法。
背景技术
番茄属于茄科家族，作为世界范围内广泛种植的蔬菜和经济作物，具有基因组小(950Mb)、生长周期短(45-100d)，可自花授粉等优点，也是培育转基因植物和植物生物制药产品的模式植物。近些年来，全球生产的番茄总量也在大幅攀升，成为了许多国家矿物质和维生素成份的重要来源之一。
1986年，McCormick等第一次提出用农杆菌介导的叶盘法转化番茄，该方法以番茄的子叶和下胚轴作为外植体，用单一序列和多拷贝序列作为外源基因，获得了多达8哥番茄品种的300多株转基因苗。2000年，VIDYA等利用农杆菌介导法转化番茄子叶，转化率仅为8％。2003年，PARK等利用农杆菌介导得叶盘法转化番茄，转化效率提高到了20％。2015年，SUN等利用农杆菌介导法转化番茄的子叶和下胚轴，转化效率已经40％。番茄得遗传转化研究不断进步发展，时至今日，转化效率仍有很大差异，较低的不足10％，较高的能达到80％以上，甚至可达100％。
与此同时，影响番茄遗传转化因素也有很多，如番茄基因型，农杆菌类型，外源基因的选择、预培养和共培养时间等。不同基因型的番茄品种对生长调节剂的敏感程度有较大差异，导致不同基因型的番茄品种对生长调节剂具有专一性，从而影响遗传转化的效率。
番茄作为植物转基因研究的主要模式植物之一，其遗传转化体系已经报道了很多，但仍存在很多问题，如转化率低、转基因后代遗传不稳定、外源基因沉默、操作复杂等问题。现代生物技术的飞速发展，使转基因植物基因工程疫苗逐渐走进人们的生活，因其独特的可食性特点，展现了广阔的应用前景和诱人的开发利用价值。因此建立一个高效、高产的番茄遗传转化体系是一个亟待解决的问题。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供了一种转化效率较高的农杆菌介导的番茄遗传转化方法。
本发明的技术方案为：一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，具体包括：
步骤一：无菌番茄叶片外植体的获得
11)在超净台中，用无菌镊子拔出子叶完全展开、真叶还未长出的Micro Tom番茄无菌幼苗，将无菌幼苗的根置于无菌水中，防止失水；
12)在T1培养基上放置一张无菌滤纸，用无菌眼科剪将无菌幼苗子叶剪成0.5～1cm大小，背面超上，均匀放置在T1培养基平皿上；
13)封口膜封住平皿，置于暗箱中，温度25℃条件下预培养2d；
步骤二：农杆菌侵染叶片外植体
21)挑去含有目的基因质粒的农杆菌单菌落于2～3mLLB培养基中，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养12～16h，至菌体完全复苏；
22)取500μL菌液加到新的10mLLB培养基，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养5～6h，至菌液浓度OD600达到0.5～0.6；
23)在转速为5000rpm的条件下离心10min，收集菌体，弃上清，用无菌水悬浮菌体；
24)重复步骤23)，用无菌水悬浮菌体，并将菌液浓度OD600稀释至0.08～0.12；
25)将置于暗箱中预培养2d的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染5min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；
26)弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，将叶片背面朝上，均匀摆放在放有新滤纸的T1培养基上；
27)封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；
步骤三：外植体的抗性筛选
31)将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化选择培养基——T21培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
32)为保证T21培养基的营养成分和抗性效价满足叶片的生长和抗性筛选，5d后将叶片转移至新的T21培养基上；
33)每10d更换一次T21培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基——T22培养基；
步骤四：外植体的继代培养
41)为促进外植体愈伤组织分化出的芽进一步生长和伸长发育，将其转移至含有芽伸长培养基T22培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
42)为保证T22培养基的营养成分和抗性效价满足芽的伸长伸长生长和抗性筛选，每14d更换一次T22培养基，直至芽伸长3～5cm；
步骤五：外植体的生根培养
51)当T22培养基中的芽伸长至3～5cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基T3的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
52)2～3周，可以见到幼根；
53)至根生长丰富可见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；
步骤六：转基因植株的移土培养
61)转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，可转移至培养土中生长；
62)将转基因幼苗从T3培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，压实；
63)用塑料膜罩上植株，避免失水；光照培养1～2周，转基因苗适应环境后，慢慢将塑料膜移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
外植体的选择对转化效率有着重要影响，番茄无菌苗的苗龄，外植体的类型，大小以及在培养基上的放置方向都对转化效率有影响；因此我们选择在真叶还为长出时的无菌幼苗子叶部分，剪为0.5～1.0cm大小，并背面超上放置于培养基上，此时期的番茄子叶木质化程度较低，且农杆菌对外植体的毒害作用也较小，极大的提高了番茄的遗传转化效率。
进一步地，步骤一所述无菌幼苗的种植方法为：
1)在超净台中，取一定数量的Micro-Tom种子放入无菌平皿，倒入浓度为75％的无水乙醇，浸洗5min，弃溶液，加入浓度为4％的次氯酸钠溶液，浸洗5min，弃溶液，用无菌水清洗5次，洗净次氯酸钠溶液，防止其影响种子发芽率；
2)用无菌镊子将种子均匀摆放至含有T0培养基培养瓶中，每个培养瓶30～35粒；
3)放置于暗箱培养3～5d，温度25℃，至生根种子发芽，芽长至2～3cm；
4)将发芽种子的培养瓶放置在培养室，光照培养2～4d，温度25℃，直至得到子叶完全展开、真叶还未长出的无菌幼苗；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式。
作为一种改进方案，所述步骤二农杆菌侵染叶片外植体的操作具体为：
21)挑去含有目的基因质粒的农杆菌单菌落于2～3mLLB培养基中，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养12～16h，至菌体完全复苏；
22)取500μL菌液加到新的10mLLB培养基，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养5～6h，至菌液浓度OD600达到0.5～0.6；
23)在转速为5000rpm的条件下离心10min，收集菌体，弃上清，用无菌水悬浮菌体；
24)重复步骤23)，用无菌水悬浮菌体，并将菌液浓度OD600稀释至0.08～0.12；
25)将置于暗箱中预培养2d的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，在强度为65～70KHz条件下超声处理15～45s，利用超声处理配合诱导农杆菌菌液对无菌叶片进行转；然后再持续浸染2～3min，浸染过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；
26)弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，将叶片背面朝上，均匀摆放在放有新滤纸的T1培养基上；
27)封口膜封住平皿，在温度条件25℃、超声条件15～20KHz强度的环境下置于暗箱中共培养2d，在后期的培养中持续进行超声处理能够有效地增加实际的转化率。
作为一种改进的方案，所述T0培养基的具体配置方法为：称取MS盐4.4g，蔗糖30g，加蒸馏水至1L，完全溶解后加1MNaOH溶液，将pH调至5.8-6.0，加入8g琼脂粉末，121℃，高压灭菌20min。
进一步地，所述T0培养基为MS基础培养基，具体的配置方法为：称取MS盐4.8g，18g蔗糖，0.2mg/L CTK，0.05mg/L GA3，加蒸馏水至1L，完全溶解后加1MNaOH溶液，将pH调至6.0，加入12g琼脂粉末，121℃，高压灭菌20min；能够有效地改善种子的存活率和生长情况，在后续的外植体培养中能够利用有效地促进胞质分裂，在分裂中具备较佳的活化作用，更利于后续外植体的分化。
进一步地，所述T1培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基加入6-BA(1.0mg/mL)至终浓度1mg/L，加入IAA(1.0mg/mL)100μL至终浓度0.1mg/mL。
进一步地，所述T21培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基加入ZT(1.0mg/mL)1mL至终浓度1mg/L，Hyg(50mg/mL)200μL至终浓度10mg/L，加入Ti(200mg/mL)2mL至终浓度400mg/L，加入IAA(1.0mg/mL)100μL至终浓度0.1mg/L。
进一步地，所述T22培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基加入ZT(1.0mg/mL)0.5mL至终浓度0.5mg/L，Hyg(50mg/mL)200μL至终浓度10mg/L，加入Ti(200mg/mL)2mL至终浓度400mg/L，加入GA(1.0mg/mL)100μL至终浓度0.1mg/L。
进一步地，所述T3培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基Hyg(50mg/mL)10μL至终浓度5mg/L，加入Ti(200mg/mL)2mL至终浓度150mg/L，加入IBA(1.0mg/mL)200μL至终浓度2mg/L；Ti作为抗生素可以有效地抑制农杆菌过度繁殖造成的不利影响。
更进一步地，T1、T21、T22、T3培养基中还加入有0.2～1.5mg的促转型调节结合物，所述促转型调节结合物具体的制备方法为：首先，利用NHS-生物素将BMs膜进行生物素化，然后利用膜结合的铜丙酸基团与素化后的BMs膜进行偶联形成促转型调节结合物，利用促转型调节结合物能够有效地促进外植体分化。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明方法简化了遗传转化的程序，整体过程较为简单，有效地缩短了转化周期；
2、本发明方法使得转基因后代遗传趋于稳定，操作简单，外源基因得到了表达水平明显提升；
3、转化效率大大提高：
A、本发明方法中我们选择在真叶还为长出时的无菌幼苗子叶部分，剪为0.5-1.0cm大小，并背面超上放置于培养基上，此时期的番茄子叶木质化程度较低，且农杆菌对外植体的毒害作用也较小，极大的提高了番茄的遗传转化效率；且在培养时间上选择2d，此时，外植体的切口处细胞分裂明显，并有少量愈伤组织形成，且切口部分愈合，外植体可正常生长，T-DNA容易整合的植物基因组中，转化效率明显提高；
B、本发明方法选取Micro-Tom番茄品种子叶为外植体，农杆菌OD600≈0.1，侵染5min，转化率在25％左右，相对于本基因型品种的番茄而言，转化效率有所提升，因为此时农杆菌浓度适宜，不会因过高而造成繁殖速度快，外植体死亡或过低造成侵染效果不佳等问题。侵染时间上我们控制在5min左右不仅给了农杆菌充分接触外植体的时间，也极大的避免了因农杆菌的毒害作用导致的外植体缺氧或软腐死亡，2d的共培养时间，避免了农杆菌的大量繁殖造成的后期除菌困难，降低了植物细胞的损伤；
C、在培养基的配置上，针对Micro-Tom番茄的植物生长调节剂配比，分化培养基加入玉米素(ZT)与吲哚乙酸(IAA)的比例为10:1，此外加入潮霉素(Hyg)作为抗性筛选的标记，同时加入特美汀(Ti)作为抗生素可以有效地抑制农杆菌过度繁殖造成的不利影响，而对转化效率不会造成负面影响且对器官的形成存在一定的促进作用，这是由于他们能释放出生长素类似物，可以促进芽和不定根的生长，提高了转化效率。
附图说明
图1是本发明的遗传转化流程图；
具体实施方式
实施例1：一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，具体包括：
步骤一：无菌幼苗的种植
11)在超净台中，取一定数量的Micro-Tom种子放入无菌平皿，倒入浓度为75％的无水乙醇，浸洗5min，弃溶液，加入浓度为4％的次氯酸钠溶液，浸洗5min，弃溶液，用无菌水清洗5次，洗净次氯酸钠溶液，防止其影响种子发芽率；
12)用无菌镊子将种子均匀摆放至含有T0培养基培养瓶中，每个培养瓶30粒；
13)放置于暗箱培养3d，温度25℃，至生根种子发芽，芽长至2cm；
14)将发芽种子的培养瓶放置在培养室，光照培养2d，温度25℃，直至得到子叶完全展开、真叶还未长出的无菌幼苗；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式。
步骤二：无菌番茄叶片外植体的获得
21)在超净台中，用无菌镊子拔出子叶完全展开、真叶还未长出的无菌幼苗，将无菌幼苗的根置于无菌水中，防止失水；
22)在T1培养基上放置一张无菌滤纸，用无菌眼科剪将无菌幼苗子叶剪成0.5cm大小，背面超上，均匀放置在T1培养基平皿上；
23)封口膜封住平皿，置于暗箱中，温度25℃条件下预培养2d；
步骤三：农杆菌侵染叶片外植体
31)挑去含有目的基因质粒的农杆菌单菌落于2mLLB培养基中，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养12h，至菌体完全复苏；其中，农杆菌具体为农杆菌菌株GV3101；
32)取500μL菌液加到新的10mLLB培养基，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养5h，至菌液浓度OD600达到0.5；
33)在转速为5000rpm的条件下离心10min，收集菌体，弃上清，用无菌水悬浮菌体；
34)重复步骤33)，用无菌水悬浮菌体，并将菌液浓度OD600稀释至0.08；
35)将置于暗箱中预培养2d的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染5min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；
36)弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，将叶片背面朝上，均匀摆放在放有新滤纸的T1培养基上；
37)封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；
步骤四：外植体的抗性筛选
41)将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化选择培养基——T21培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
42)为保证T21培养基的营养成分和抗性效价满足叶片的生长和抗性筛选，5d后将叶片转移至新的T21培养基上；
43)每10d更换一次T21培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基——T22培养基；
步骤五：外植体的继代培养
51)为促进外植体愈伤组织分化出的芽进一步生长和伸长发育，将其转移至含有芽伸长培养基T22培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
52)为保证T22培养基的营养成分和抗性效价满足芽的伸长伸长生长和抗性筛选，每14d更换一次T22培养基，直至芽伸长3cm；
步骤六：外植体的生根培养
61)当T22培养基中的芽伸长至3cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基T3的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
62)3周后见到幼根；
63)至根生长丰富可见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；
步骤七：转基因植株的移土培养
71)转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，可转移至培养土中生长；
72)将转基因幼苗从T3培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，压实；
73)用塑料膜罩上植株，避免失水；光照培养1周，转基因苗适应环境后，慢慢将塑料膜移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式。
其中：T0培养基的具体配置方法为：称取MS盐4.4g，蔗糖30g，加蒸馏水至1L，完全溶解后加1MNaOH溶液，将pH调至6.0，加入8g琼脂粉末，121℃，高压灭菌20min。
T1培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基加入6-BA(1.0mg/mL)至终浓度1mg/L，加入IAA(1.0mg/mL)100μL至终浓度0.1mg/mL。
T21培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基加入ZT(1.0mg/mL)1mL至终浓度1mg/L，Hyg(50mg/mL)200μL至终浓度10mg/L，加入Ti(200mg/mL)2mL至终浓度400mg/L，加入IAA(1.0mg/mL)100μL至终浓度0.1mg/L
T22培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基加入ZT(1.0mg/mL)0.5mL至终浓度0.5mg/L，Hyg(50mg/mL)200μL至终浓度10mg/L，加入Ti(200mg/mL)2mL至终浓度400mg/L，加入GA(1.0mg/mL)100μL至终浓度0.1mg/L。
T3培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基Hyg(50mg/mL)10μL至终浓度5mg/L，加入Ti(200mg/mL)2mL至终浓度150mg/L，加入IBA(1.0mg/mL)200μL至终浓度2mg/L。
实施例2：与实施例1不同的是：
一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，具体包括：
步骤一：无菌幼苗的种植
11)在超净台中，取一定数量的Micro-Tom种子放入无菌平皿，倒入浓度为75％的无水乙醇，浸洗5min，弃溶液，加入浓度为4％的次氯酸钠溶液，浸洗5min，弃溶液，用无菌水清洗5次，洗净次氯酸钠溶液，防止其影响种子发芽率；
12)用无菌镊子将种子均匀摆放至含有T0培养基培养瓶中，每个培养瓶30粒；
13)放置于暗箱培养4d，温度25℃，至生根种子发芽，芽长至2.5cm；
14)将发芽种子的培养瓶放置在培养室，光照培养3d，温度25℃，直至得到子叶完全展开、真叶还未长出的无菌幼苗；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式。
步骤二：无菌番茄叶片外植体的获得
21)在超净台中，用无菌镊子拔出子叶完全展开、真叶还未长出的无菌幼苗，将无菌幼苗的根置于无菌水中，防止失水；
22)在T1培养基上放置一张无菌滤纸，用无菌眼科剪将无菌幼苗子叶剪成0.8cm大小，背面超上，均匀放置在T1培养基平皿上；
23)封口膜封住平皿，置于暗箱中，温度25℃条件下预培养2d；
步骤三：农杆菌侵染叶片外植体
31)挑去含有目的基因质粒的农杆菌单菌落于3mLLB培养基中，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养14h，至菌体完全复苏；
32)取500μL菌液加到新的10mLLB培养基，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养6h，至菌液浓度OD600达到0.6；
33)在转速为5000rpm的条件下离心10min，收集菌体，弃上清，用无菌水悬浮菌体；
34)重复步骤33)，用无菌水悬浮菌体，并将菌液浓度OD600稀释至0.10；
35)将置于暗箱中预培养2d的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染5min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；
36)弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，将叶片背面朝上，均匀摆放在放有新滤纸的T1培养基上；
37)封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；
步骤四：外植体的抗性筛选
41)将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化选择培养基——T21培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
42)为保证T21培养基的营养成分和抗性效价满足叶片的生长和抗性筛选，5d后将叶片转移至新的T21培养基上；
43)每10d更换一次T21培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基——T22培养基；
步骤五：外植体的继代培养
51)为促进外植体愈伤组织分化出的芽进一步生长和伸长发育，将其转移至含有芽伸长培养基T22培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
52)为保证T22培养基的营养成分和抗性效价满足芽的伸长伸长生长和抗性筛选，每14d更换一次T22培养基，直至芽伸长3～5cm；
步骤六：外植体的生根培养
61)当T22培养基中的芽伸长至3～5cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基T3的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
62)2周半后见到幼根；
63)至根生长丰富可见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；
步骤七：转基因植株的移土培养
71)转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，可转移至培养土中生长；
72)将转基因幼苗从T3培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，压实；
73)用塑料膜罩上植株，避免失水；光照培养1.5周，转基因苗适应环境后，慢慢将塑料膜移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式。
实施例3：与实施例1不同的是：
一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，具体包括：
步骤一：无菌幼苗的种植
11)在超净台中，取一定数量的Micro-Tom种子放入无菌平皿，倒入浓度为75％的无水乙醇，浸洗5min，弃溶液，加入浓度为4％的次氯酸钠溶液，浸洗5min，弃溶液，用无菌水清洗5次，洗净次氯酸钠溶液，防止其影响种子发芽率；
12)用无菌镊子将种子均匀摆放至含有T0培养基培养瓶中，每个培养瓶35粒；
13)放置于暗箱培养5d，温度25℃，至生根种子发芽，芽长至3cm；
14)将发芽种子的培养瓶放置在培养室，光照培养4d，温度25℃，直至得到子叶完全展开、真叶还未长出的无菌幼苗；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式。
步骤二：无菌番茄叶片外植体的获得
21)在超净台中，用无菌镊子拔出子叶完全展开、真叶还未长出的无菌幼苗，将无菌幼苗的根置于无菌水中，防止失水；
22)在T1培养基上放置一张无菌滤纸，用无菌眼科剪将无菌幼苗子叶剪成1cm大小，背面超上，均匀放置在T1培养基平皿上；
23)封口膜封住平皿，置于暗箱中，温度25℃条件下预培养2d；
步骤三：农杆菌侵染叶片外植体
31)挑去含有目的基因质粒的农杆菌单菌落于3mLLB培养基中，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养16h，至菌体完全复苏；
32)取500μL菌液加到新的10mLLB培养基，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养6h，至菌液浓度OD600达到0.6；
33)在转速为5000rpm的条件下离心10min，收集菌体，弃上清，用无菌水悬浮菌体；
34)重复步骤33)，用无菌水悬浮菌体，并将菌液浓度OD600稀释至0.12；
35)将置于暗箱中预培养2d的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染5min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；
36)弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，将叶片背面朝上，均匀摆放在放有新滤纸的T1培养基上；
37)封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；
步骤四：外植体的抗性筛选
41)将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化选择培养基——T21培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
42)为保证T21培养基的营养成分和抗性效价满足叶片的生长和抗性筛选，5d后将叶片转移至新的T21培养基上；
43)每10d更换一次T21培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基——T22培养基；
步骤五：外植体的继代培养
51)为促进外植体愈伤组织分化出的芽进一步生长和伸长发育，将其转移至含有芽伸长培养基T22培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
52)为保证T22培养基的营养成分和抗性效价满足芽的伸长伸长生长和抗性筛选，每14d更换一次T22培养基，直至芽伸长5cm；
步骤六：外植体的生根培养
61)当T22培养基中的芽伸长至3～5cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基T3的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
62)2周后见到幼根；
63)至根生长丰富可见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；
步骤七：转基因植株的移土培养
71)转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，可转移至培养土中生长；
72)将转基因幼苗从T3培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，压实；
73)用塑料膜罩上植株，避免失水；光照培养2周，转基因苗适应环境后，慢慢将塑料膜移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式。
实施例4：与实施例1不同的是：T0培养基为MS基础培养基，具体的配置方法为：称取MS盐4.8g，18g蔗糖，0.2mg/L CTK，0.05mg/L GA3，加蒸馏水至1L，完全溶解后加1MNaOH溶液，将pH调至6.0，加入12g琼脂粉末，121℃，高压灭菌20min。
实施例5：与实施例2不同的是：
步骤二：农杆菌侵染叶片外植体
31)挑去含有目的基因质粒的农杆菌单菌落于3mLLB培养基中，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养14h，至菌体完全复苏；
32)取500μL菌液加到新的10mLLB培养基，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养6h，至菌液浓度OD600达到0.6；
33)在转速为5000rpm的条件下离心10min，收集菌体，弃上清，用无菌水悬浮菌体；
34)重复步骤23)，用无菌水悬浮菌体，并将菌液浓度OD600稀释至0.10；
35)将置于暗箱中预培养2d的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，在强度为65KHz条件下超声处理30s，然后再持续浸染2～3min，浸染过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；
26)弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，将叶片背面朝上，均匀摆放在放有新滤纸的T1培养基上；
27)封口膜封住平皿，在温度条件25℃、超声条件20KHz强度的环境下置于暗箱中共培养2d。
实施例6：与实施例1不同的是：
T0培养基为MS基础培养基，具体的配置方法为：称取MS盐4.8g，18g蔗糖，0.2mg/LCTK，0.05mg/L GA3，加蒸馏水至1L，完全溶解后加1MNaOH溶液，将pH调至6.0，加入12g琼脂粉末，121℃，高压灭菌20min；
T1培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基加入6-BA(1.0mg/mL)至终浓度1mg/L，加入IAA(1.0mg/mL)100μL至终浓度0.1mg/mL，再向培养基中加入0.8mg的促转型调节结合物；
T21培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基加入ZT(1.0mg/mL)1mL至终浓度1mg/L，Hyg(50mg/mL)200μL至终浓度10mg/L，加入Ti(200mg/mL)2mL至终浓度400mg/L，加入IAA(1.0mg/mL)100μL至终浓度0.1mg/L；再向培养基中加入0.6mg的促转型调节结合物；
T22培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基加入ZT(1.0mg/mL)0.5mL至终浓度0.5mg/L，Hyg(50mg/mL)200μL至终浓度10mg/L，加入Ti(200mg/mL)2mL至终浓度400mg/L，加入GA(1.0mg/mL)100μL至终浓度0.1mg/L；再向培养基中加入1.0mg的促转型调节结合物；
T3培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基Hyg(50mg/mL)10μL至终浓度5mg/L，加入Ti(200mg/mL)2mL至终浓度150mg/L，加入IBA(1.0mg/mL)200μL至终浓度2mg/L再向培养基中加入0.8mg的促转型调节结合物。
其中，促转型调节结合物具体的制备方法为：首先，利用NHS-生物素将BMs膜进行生物素化，然后利用膜结合的铜丙酸基团与素化后的BMs膜进行偶联形成促转型调节结合物。
实验例：实施例1～6进行PCR扩增，检测获得转基因植株。检测结果如下表：
Figure BDA0002603489430000171
结论：
1、通过实施例1与实施例4的比较可以看出改变T0培养基的配比方法能够改善阳性转化率；
2、通过实施例2与实施例5的比较可以看出在农杆菌侵染叶片外植体的步骤进行改进后能够改善阳性转化率；
3、通过实施例1与实施例6的比较可以看出在培养基中加入促转型调节结合物能够改善再生植株数；但是由于其再生植株的增长率小于PCR阳性植株的增长率而导致其阳性率并未得到改善，但其阳性转化率有显著提高。

Claims (10)

1.一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，具体包括：
步骤一：无菌番茄叶片外植体的获得
11)在超净台中，用无菌镊子拔出子叶完全展开、真叶还未长出的Micro-Tom番茄无菌幼苗，将无菌幼苗的根置于无菌水中，防止失水；
12)在T1培养基上放置一张无菌滤纸，用无菌眼科剪将无菌幼苗子叶剪成0.5～1cm大小，背面超上，均匀放置在T1培养基平皿上；
13)封口膜封住平皿，置于暗箱中，温度25℃条件下预培养2d；
步骤二：农杆菌侵染叶片外植体
21)挑去含有目的基因质粒的农杆菌单菌落于2～3mLLB培养基中，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养12～16h，至菌体完全复苏；
22)取500μL菌液加到新的10mLLB培养基，并加入相应的抗生素，28℃的温度条件下在200rpm摇床培养5～6h，至菌液浓度OD600达到0.5～0.6；
23)在转速为5000rpm的条件下离心10min，收集菌体，弃上清，用无菌水悬浮菌体；
24)重复步骤23)，用无菌水悬浮菌体，并将菌液浓度OD600稀释至0.08～0.12；
25)将置于暗箱中预培养2d的无菌叶片收集在无菌平皿中，倒入菌液，浸染5min，此过程中不断摇晃平皿，保证叶片接触到菌液；
26)弃菌液，用枪头将多余菌液尽量吸干后，将叶片背面朝上，均匀摆放在放有新滤纸的T1培养基上；
27)封口膜封住平皿，温度25℃的条件下置于暗箱中共培养2d；
步骤三：外植体的抗性筛选
31)将共培养2d的叶片正面向上均匀摆放至分化选择培养基——T21培养基上，封口膜封住平皿，温度25℃的条件下光照培养，其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
32)为保证T21培养基的营养成分和抗性效价满足叶片的生长和抗性筛选，5d后将叶片转移至新的T21培养基上；
33)每10d更换一次T21培养基，至愈伤组织分化出的芽可以移至芽伸长培养基——T22培养基；
步骤四：外植体的继代培养
41)为促进外植体愈伤组织分化出的芽进一步生长和伸长发育，将其转移至含有芽伸长培养基T22培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
42)为保证T22培养基的营养成分和抗性效价满足芽的伸长伸长生长和抗性筛选，每14d更换一次T22培养基，直至芽伸长3～5cm；
步骤五：外植体的生根培养
51)当T22培养基中的芽伸长至3～5cm时，将具有芽分化生长点的愈伤组织拔出，剪下具有分化生长点的芽，插入含有生根培养基T3的培养瓶中，温度25℃条件下光照培养；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式；
52)2～3周，可以见到幼根；
53)至根生长丰富可见须根，幼苗叶片丰富，将转基因幼苗移出培养瓶；
步骤六：转基因植株的移土培养
61)转基因幼苗根须发达，叶片丰富时，可转移至培养土中生长；
62)将转基因幼苗从T3培养基中拔出，洗净根上培养基，将根埋入已经完全润湿的培养土中，压实；
63)用塑料膜罩上植株，避免失水；光照培养1～2周，转基因苗适应环境后，慢慢将塑料膜移除；光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式。
2.如权利要求1所述的一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，步骤一所述无菌幼苗的种植方法为：
1)在超净台中，取一定数量的Micro-Tom种子放入无菌平皿，倒入浓度为75％的无水乙醇，浸洗5min，弃溶液，加入浓度为4％的次氯酸钠溶液，浸洗5min，弃溶液，用无菌水清洗5次，洗净次氯酸钠溶液，防止其影响种子发芽率；
2)用无菌镊子将种子均匀摆放至含有T0培养基培养瓶中，每个培养瓶30～35粒；
3)放置于暗箱培养3～5d，温度25℃，至生根种子发芽，芽长至2～3cm；
4)将发芽种子的培养瓶放置在培养室，光照培养2～4d，温度25℃，直至得到子叶完全展开、真叶还未长出的无菌幼苗；其中，光照培养具体采用16h光照/8h黑暗交替照明的方式。
3.如权利要求1所述的一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，所述步骤二农杆菌侵染叶片外植体的操作中，在所述步骤25)中，无菌平皿中倒入菌液后，在强度为65～70KHz条件下超声处理15～45s，然后再持续浸染2～3min；在所述步骤27中，封口膜封住平皿后，在温度条件25℃、超声条件15～20KHz强度的环境下置于暗箱中共培养2d。
4.如权利要求2所述的一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，所述T0培养基的具体配置方法为：称取MS盐4.4g，蔗糖30g，加蒸馏水至1L，完全溶解后加1MNaOH溶液，将pH调至5.8-6.0，加入8g琼脂粉末，121℃，高压灭菌20min。
5.如权利要求4所述的一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，所述T1培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基加入6-BA(1.0mg/mL)至终浓度1mg/L，加入IAA(1.0mg/mL)100μL至终浓度0.1mg/mL。
6.如权利要求4所述的一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，所述T21培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基加入ZT(1.0mg/mL)1mL至终浓度1mg/L，Hyg(50mg/mL)200μL至终浓度10mg/L，加入Ti(200mg/mL)2mL至终浓度400mg/L，加入IAA(1.0mg/mL)100μL至终浓度0.1mg/L。
7.如权利要求4所述的一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，所述T22培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基加入ZT(1.0mg/mL)0.5mL至终浓度0.5mg/L，Hyg(50mg/mL)200μL至终浓度10mg/L，加入Ti(200mg/mL)2mL至终浓度400mg/L，加入GA(1.0mg/mL)100μL至终浓度0.1mg/L。
8.如权利要求4所述的一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，所述T3培养基的具体配置方法为：灭菌后T0培养基温度降至60℃左右，1L的T0培养基Hyg(50mg/mL)10μL至终浓度5mg/L，加入Ti(200mg/mL)2mL至终浓度150mg/L，加入IBA(1.0mg/mL)200μL至终浓度2mg/L。
9.如权利要求5～8任意一项所述的一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，所述T1、T21、T22、T3培养基中还加入有0.2～1.5mg的促转型调节结合物，所述促转型调节结合物具体的制备方法为：首先，利用NHS-生物素将BMs膜进行生物素化，然后利用膜结合的铜丙酸基团与素化后的BMs膜进行偶联形成促转型调节结合物。
10.如权利要求1任意一项所述的一种农杆菌介导的番茄遗传转化方法，其特征在于，步骤一所述无菌幼苗采用Micro-Tom番茄无菌幼苗。
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