CN101191127A - 一种农杆菌介导的番茄外植体高效转化系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的番茄外植体高效转化系统，包括以下部分：用于制备外植体的沪番1479号番茄品种的种子；带有目的基因的根癌农杆菌；培养基；所说的农杆菌为包含双元载体系统的根癌农杆菌。采用该番茄外植体转化系统获得的转基因植株，经过驯化，可成功移栽于土壤中，再生植株的生长表型正常。对来自沪番1479外植体的7株转基因植株进行抗病毒试验，对CMV病毒的抗性均高于对照，其中2份材料达到抗病水平，5份材料达到耐病水平。

Description

一种农杆菌介导的番茄外植体高效转化系统

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及农杆菌介导的番茄外植体转化系统。

背景技术

农杆菌介导法是应用最广泛的植物转基因方法，具有转化效率高、外源插入片段明确、单拷贝整合等优点。已经有多种基因通过农杆菌转化法转移到多种植物当中的报道，获得的转基因植物可具有抗病毒、抗真菌、抗虫、抗除草剂、抗旱、改善品质等优良性状。

番茄是重要的农作物，也有大量的转基因研究的报道。吴昌银等(《植物学报》2000，42(7)：719-723)报道把雪花莲外源凝集素基因(GNA)通过农杆菌导入番茄，获得具有抗蚜虫性状的转基因番茄；张赛群等(《园艺学报》1999，26(6))报道把异戊烯基转移酶(Isopentenyl transferase，ipt)基因通过农杆菌导入番茄，得到能抑制叶片衰老的转基因番茄；欧阳波等，(Journal of Plant Physiology and Molecular Biology2003，29(3)：179-184)报道将双价水解酶基因通过农杆菌系统转入番茄，获得对枯萎病抗性的提高的转基因番茄。

黄瓜花叶病毒病(CMV)是一种非常严重的病毒病害。黄瓜花叶病毒(CMV)能侵染烟草、蕃茄等许多种植物，属于黄瓜病病毒群(cucumovirus group)，是以黄瓜、番茄为主的多种作物病毒病的主要病原体，广泛分布于世界各地，寄主范围极广，危害很大。

通过农杆菌介导的转基因方法，将黄瓜花叶病毒病的经改造的外壳蛋白、运动蛋白等基因导入到番茄中，例如，转入体外培养的番茄外植体中，再经诱导分化，形成带有目的基因的再生植株，是获得对黄瓜花叶病毒病具有抗性的番茄品种的重要途径。农杆菌是否能有效地感染番茄外植体并获得完整的转基因植株，受许多因素的影响，如番茄品种、质粒的大小、农杆菌侵染的方法、外植体的生理状态、培养基、诱导剂选择等等。以往的番茄外植体转化系统不够理想，主要体现在：(1)番茄经农杆菌感染后出愈率(形成愈伤组织并形成再生芽的比率)低；(2)转化率(最后获得的转基因苗的比率)低。因此，本领域迫切需要高效的农杆菌介导的番茄外植体转化系统，为开发稳定、优异的抗黄瓜花叶病毒转基因番茄新品种服务。

发明内容

本发明的目的之一是供一种高效的农杆菌介导的番茄外植体转化系统，克服现有的番茄外植体转化系统转化效率低的不足。

本发明的另一目的是提供一种农杆菌介导的番茄外植体转化方法，用于培育转基因番茄品种。

提本发明通过以下技术方案实现：

选择适当的番茄品种，用该番茄品种的种子培育成无菌苗，选择该无菌苗的不同部位作为外植体培养；采用带有目的基因的农杆菌感染该外植体，感染后用选择培养基培养，转化的外植体形成愈伤组织、再生芽，未转化的外植体则被淘汰；再生芽经过生根培养，可形成完整的转基因植株。

本发明的第一方面，提供一种番茄外植体转化系统，包括以下部分：

(1)用于制备外植体的沪番1479号番茄品种的种子；

(2)带有包含目的基因的质粒的根癌农杆菌；

(3)培养基。

所说的外植体为番茄品种沪番1479种子长成的无菌苗的子叶、下胚轴；优选沪番1479无菌苗的子叶。

所说的农杆菌选自包含双元载体系统的根癌农杆菌的一种，优选根癌农杆菌EHA105；载体选自微型Ti质粒中的一种，优选微型Ti质粒pBIN19；目的基因为黄瓜花叶病毒运动蛋白缺陷基因(CMV-dMP)k130片段。

所说的培养基包括：作为基础培养基的MS培养基，在MS培养基中加入ZT2.0mg/L、IAA0.2mg/L的预培养培养基，在MS培养基中加入ZT2.0mg/L、IAA0.2mg/L、选择性抗生素的愈伤诱导选择培养基，在MS培养基中加入IAA0.1mg/L、选择性抗生素的生根培养基。

选择性抗生素的种类、浓度根据质粒中抗性基因种类确定。在一个优选的方案中，所说的质粒为微型Ti质粒，带有卡那霉素抗性基因；所说的选择性抗生素包括50-100mg/L的卡那霉素。

本发明的第二方面，公开了一种农杆菌介导的番茄外植体转化方法，包括如下步骤：

番茄品种沪番1479的外植体，经带有包含目的基因的质粒的农杆菌接种后，在MS培养基中加入ZT2.0mg/L、IAA0.2mg/L的预培养培养基培养1天；在MS培养基中加入ZT2.0mg/L、IAA0.2mg/L、选择性抗生素的愈伤诱导选择培养基上培养，每隔2-3周继代一次，直至长出再生芽；再生芽在MS培养基中加入IAA0.1mg/L、选择性抗生素的生根培养基培养直至生根，得到再生苗；再生苗移栽得到转基因的再生植株。

其中所说的外植体按如下方法制备：沪番1479号番茄种子经75％的酒精、含有TWEEN的10％的次氯酸钠水溶液消毒，在MS培养基，25℃，3500lx光强，16小时光照然后8小时黑暗条件下培养萌发，12天左右获得无菌苗；取无菌苗的子叶、下胚轴，即为外植体。

本发明的有益效果体现为：

本发明公开的取自番茄品种沪番1479的外植体材料，具体为该品种无菌苗的子叶、下胚轴，是农杆菌介导的转基因番茄品种培育的优质材料，具有较高的转化率。

本发明提供的番茄外植体转化系统，选择番茄品种沪番1479的子叶、下胚轴作为外植体，以及在MS培养基上选择添加不同组合、浓度的植物生长调节剂，达到了高转化率。在最佳条件下，子叶诱导出愈伤组织的比例高达41.96％，可于5天即诱导出不定芽，下胚轴诱导出愈伤组织的比例高达42.02％，可于10天诱导出不定芽。子叶的转化率为5.35％，下胚轴的转化率为1.33％。

采用该番茄外植体转化系统获得的转基因植株，经过驯化，可成功移栽于土壤中，再生植株的生长表型正常。对来自沪番1479外植体的7株转基因植株进行抗病毒试验，对CMV病毒的抗性均高于对照，其中2份材料达到抗病水平，5份材料达到耐病水平。

附图说明

图1接种CMV病毒14和18天后各材料的病情指数

具体实时方式

(一)带有目的基因的农杆菌构建

黄瓜花叶病毒运动蛋白缺陷基因(CMV-dMP)k130

本发明采用的目的基因CMV-dMP k130是利用Fny-CMV株系RNA3克隆，在编码区缺失501个核苷酸(132-633)得到的黄瓜花叶病毒运动蛋白缺陷基因。

农杆菌质粒载体系统

本发明采用农杆菌双元载体系统，即将带有目的基因和卡那霉素抗性基因微型Ti质粒pBIN19，采用三亲杂交法转入含有辅助Ti质粒的根癌农杆菌EHA105菌株中，获得含有目的基因的感染性农杆菌。

双元载体系统由微型Ti质粒(mini-Ti plasmid)和辅助Ti质粒(helper Ti plasmid)组成。微型Ti质粒是一种含有T-DNA边界序列、缺失Vir基因的Ti质粒，外源的目的基因插入T-DNA边界序列之间。辅助Ti质粒为含有Vir区段、缺失T-DNA序列的Ti质粒，其作用是提供Vir基因功能，激活处于反式位置上的T-DNA转移。

(二)外植体

无菌苗培养：将番茄种子流水冲洗1.5小时，然后用体积浓度为75％的酒精浸1分钟，然后用滴入1滴TWEEN的重量浓度为10％的次氯酸钠的水溶液消毒20分钟，次氯酸钠的水溶液中，无菌水冲洗8次，然后用无菌水浸泡1.5小时；

将种子接种于MS培养基(M0)平板上，置25℃，3500lx光强下，16小时光照然后8小时黑暗条件下培养萌发，12天左右获得无菌苗。

外植体切取：切取下胚轴和子叶作为外植体，每一植株切去生长点后，下胚轴切成3～4段，每段约长0.6～0.8cm，子叶横切为两部分。

(三)基因转化和外植体再生

农杆菌活化

农杆菌用于感染前，需要在液体培养基中活化。本发明采用加50mg/LRif(利福平)、50mg/LKan的LB培养基，于26℃，200rpm条件下过夜培养后可用于感染外植体。

农杆菌感染外植体

切好的外植体放入预培养及共同培养培养基(M1)中预培养1天，取出外植体，放入经过夜培养的农杆菌的培养液(LB+50mg/LRif+50mg/LKan)中，感染5min，取出外植体在无菌吸水纸上吸干，重新放入预培养培养基(M1)进行共培养，共培养时间为1天。

选择培养

将经共培养的外植体转接入愈伤诱导选择培养基(M2)上进行选择培养，转化的外植体因导入了卡那霉素基因，将形成愈伤组织，未转化的外植体逐渐死亡。每隔2～3周继代一次，直至生长出不定芽；

再生芽生根培养

待再生芽长至1cm左右时，将其切下，放入生根培养基(M3)中生根。

生根2周后，对生根良好的再生苗，长至5cm左右的转化苗进行炼苗、驯化，适应外界环境后，移栽至瓦钵或大田中。

(四)外植体再生系列培养基

外植体再生系列培养基是在GIBCO公司的MS培养基基础上，添加植物生长调节剂、选择性抗生素等配制而成。本发明采用的培养基类型及其各自的添加剂为：

MS培养基(M0)：为GIBCO公司的产品MS0加入有机物配制而成，组分含量为MS0+蔗糖30g/L+琼脂粉7.5g/L，pH5.8，可用于无菌苗的培养。

预培养培养基(M1)：MS培养基加入ZT(玉米素)2.0mg/L和IAA(生长素)0.2mg/L的植物生长调节剂，可用于外植体的预培养和接种农杆菌的外植体的共培养。

愈伤诱导选择培养基(M2)：MS培养基加入ZT2.0mg/L和IAA0.2mg/L的植物生长调节剂，再加入Kan(卡那霉素)100mg/L和Cb(羧苄青霉素)500mg/L选择性抗生素，可用于选择培养农杆菌感染的外植体，诱导形成愈伤组织，长出再生芽。

生根培养基(M3)：MS培养基加入IAA0.1mg/L、Kan(卡那霉素)50mg/L、Cb(羧苄青霉素)300mg/L，可用于诱导再生芽生根培养。

本发明所采用的番茄种子沪番08、沪番23、沪番1479由上海市农业科学院园艺研究所提供；载体pBIN19来自CLONTECH公司，pUFΔk、pROK19按照以下文献构建：王关林.方宏筠.主编.植物基因工程原理与技术.科学出版社.1998.

农杆菌为EHA105菌株来源于上海农科院生物技术研究所；植物生长调节剂ZT、IAA购于上海国药集团化学试剂有限公司，抗生素Kan、Cb、Rif购于上海国药集团化学试剂有限公司；培养基购于GIBCO公司；其他试剂为国产分析纯试剂。

下面结合实施例，对本发明做进一步地说明，但本发明并不受限于下述实施例。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照王关林、方宏筠主编的《植物基因工程原理与技术》(科学出版社.1998)以及欧阳波等在《华中农业大学学报》，2002，21：206～209和周冀明等在《植物生理学报》，1997，23(1)：21～28上公开的方法，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

实施例1、Fny-CMV缺失型运动蛋白基因k130片段植物表达载体构建

首先用HindIII酶切带有k130基因片段的pUFΔk质粒中RNA3 cDNA的3’端，然后用klenow补平3’端凹端。再用BamH I酶切RNA3基因的5’端，获得含有k130的DNA片段。同时用Sma I和BamH I酶切质粒载体pROK19。用T4DNA聚合酶将含有k130的DNA片段连接到中间质粒载体pROK19的Sma I和BamH I酶切位点，形成含有k130的中间质粒载体pRMPK。用EcoR I和HindIII酶切pRMPK和微型Ti质粒pBIN19。用T4DNA聚合酶将酶切pRMPK得到的含有CaMV 35S启动子、k130片段、NOS终止子的DNA片段亚克隆到pBIN19的EcoR I、HindIII酶切位点，构建成含有k130的微型质粒载体pBMPK。

实施例2、番茄基因型对转化率的影响

(1)无菌苗培养

以沪番08、沪番23、沪番1479种子流水冲洗1.5小时，然后用体积浓度为75％的酒精浸1分钟，然后用加1滴TWEEN的重量浓度为10％的次氯酸钠的水溶液消毒20分钟，无菌水冲洗8次，然后用无菌水浸泡1.5小时；

将种子接种于倒有M0培养基的平板上，置25℃，3500lx光强下，16小时光照8小时，然后黑暗条件下培养萌发，12天左右获得无菌苗；

(2)外植体切取

切取下胚轴和子叶作为外植体，每一植株切去生长点后，下胚轴切成4段，每段约长0.8cm，子叶横切为两部分。共获得外植体：

沪番08：子叶171，下胚轴210；沪番23：子叶108，下胚轴171；沪番1479：子叶102，下胚轴98。

(3)外植体预培养及农杆接种

切好的外植体放入M1培养基中预培养1天，取出外植体，放入到农杆菌培养液中，感染5min，取出外植体在无菌吸水纸上吸干，重新放入M1培养基中进行共培养，共培养时间为1天；

所说的农杆菌培养液为：从平板上挑取农杆菌单菌落，接种到50ml LB培养基(含有50mg/L利福平，50mg/L卡那霉素)中，在恒温摇床上于26℃，200rpm条件下过夜培养。

(4)选择培养

将经共培养的外植体转接入M2培养基上进行选择培养，转化的外植体因导入了卡那霉素基因，将形成愈伤组织，未转化的外植体逐渐死亡。每隔2～3周继代一次，直至生长出不定芽。不同品种番茄外植体形成愈伤组织并长出再生芽的数目如下：

沪番08：子叶来源12，下胚轴来源17；沪番23：子叶来源29，下胚轴来源23；沪番1479：子叶来源53，下胚轴来源38。

(5)再生芽生根培养基

待再生芽长至1cm左右时，将其切下，放入M3培养基中生根。

来自沪番08的外植体没有得到再生苗；来自沪番23子叶的外植体形成2株再生苗，下胚轴外植体未能形成再生苗；来自沪番1479子叶的外植体形成5株再生苗，下胚轴外植体得到2株再生苗，分别命名为1479K-1～7。

(6)再生苗驯化及移栽

生根2周后，再生苗经进行炼苗、驯化，适应外界环境后，移栽至瓦钵或大田中。

对上述试验结果进行统计分析，分别计算不同番茄品种子叶、下胚轴外植体的出愈率、转化率，结果见表1、表2：

出愈率＝形成绿色愈伤的外植体数/总外植体数

转化率＝生根成苗的外植体数/总外植体数

表1 不同基因型外植体感染后出愈率、转化率

由表1可以看出，不同基因型的番茄在感染农杆菌后，出愈率和转化率差异明显，沪番1479的出愈率和转化率都显著高于其他两个基因型。

表2 沪番1479不同外植体感染后出愈率、转化率

从表2可以看出，子叶和下胚轴的出愈率差异不大，分别为41.96％和42.02％，而子叶的转化率5.36％明显高于下胚轴的1.33％。

实施例3 转基因植株后代CMV抗性分析

实施例2得到的7株转基因植株1479K-1～7为实验组，以沪番1479为对照，分别接种CMV病毒，进行抗病毒试验。

接种CMV病毒14天后，各转基因植株后代病情指数从6.6～27.7变化不等，均低于沪番1479的病情指数39.3，其中1479K-2的病情指数最低，为6.6；1479 K-3病情指数最高，为27.7。但也远低于沪番1479的病情指数39.3。结合CMV群体病情分级标准可以看出，在7份材料中达到抗病水平的有1479K-2、1479K-4两份材料，其余5份材料均达耐病水平，而沪番1479则为感病材料。

Claims (8)

1.一种番茄外植体转化系统，包括以下部分：

用于制备外植体的沪番1479号番茄品种的种子；

带有目的基因的根癌农杆菌；

培养基；

所说的农杆菌为包含双元载体系统的根癌农杆菌；

所说的培养基包括：作为基础培养基的MS培养基，在MS培养基中加入ZT2.0mg/L、IAA0.2mg/L的预培养培养基，在MS培养基中加入ZT2.0mg/L、IAA0.2mg/L、选择性抗生素的愈伤诱导选择培养基，在MS培养基中加入IAA0.1mg/L、选择性抗生素的生根培养基；选择性抗生素的种类、浓度根据质粒中抗性基因种类确定。

2.如权利要求1所述的番茄外植体转化系统，其特征在于，其中所说的外植体是沪番1479号番茄种子长成的无菌苗的子叶。

3.如权利要求2所述的番茄外植体转化系统，其特征在于，其中所说的外植体是沪番1479号番茄种子长成的无菌苗的下胚轴。

4.如权利要求1所述的番茄外植体转化系统，其特征在于，其中所说的目的基因是黄瓜花叶病毒运动蛋白缺陷基因(CMV-dMP)k130。

5.如权利要求1所述的番茄外植体转化系统，其特征在于，其中所说的双元载体系统包含带有卡那霉素抗性基因的微型Ti质粒。

6.如权利要求5所述的番茄外植体转化系统，其特征在于，其中所说的选择性抗生素包括50-100mg/L的卡那霉素。

7.一种农杆菌介导的番茄外植体转化方法，包括如下步骤：

番茄品种沪番1479的外植体，经带有包含目的基因的质粒的农杆菌接种后，在MS培养基中加入ZT2.0mg/L、IAA0.2mg/L的预培养培养基培养1天；在MS培养基中加入ZT2.0mg/L、IAA0.2mg/L、选择性抗生素的愈伤诱导选择培养基上培养，每隔2-3周继代一次，直至长出再生芽；再生芽在MS培养基中加入IAA0.1mg/L、选择性抗生素的生根培养基培养直至生根，得到再生苗；再生苗移栽得到转基因的再生植株。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，其中所说的外植体按如下方法制备：沪番1479号番茄种子经75％的酒精、含有TWEEN的10％的次氯酸钠水溶液消毒，在MS培养基，25℃，3500lx光强下，16小时光照然后8小时黑暗条件下培养萌发，12天左右获得无菌苗；取无菌苗的子叶、下胚轴，即为外植体。

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