CN103314850B - 一种构建野生番茄里基茄再生体系及遗传转化体系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及遗传转化领域，具体地，涉及一种构建野生番茄里基茄再生体系及遗传转化体系的方法。所述包括步骤：（1）里基茄无菌苗的培养；（2）在愈伤诱导培养基CIM中诱导里基茄的根、茎和叶三种不同外植体产生愈伤组织与丛生芽点；（3）将诱导出的丛生芽进行单株分离，转入无菌苗培养基中诱导生根成苗。本发明选取野生番茄材料里基茄为再生和遗传转化研究的对象，而不是基因型专性很强的现代栽培番茄，更利于开展番茄基因工程方面的研究和番茄分子育种的进程；建立的里基茄的相应体系，适于三种外植体，并且转化介质和培养条件完全一致，大大节约了相关研究的费用支出；更重要的是，再生和转化效率高、体系稳定、试验时长短。

Description

一种构建野生番茄里基茄再生体系及遗传转化体系的方法
技术领域
本发明涉及遗传转化领域，具体地，涉及一种构建野生番茄里基茄再生体系及遗传转化体系的方法。
背景技术
番茄是一种世界性茄科经济作物，野生番茄里基茄是现代栽培番茄的野生近缘种，其自然生长环境特殊、地理分布范围狭窄，仅存于南美洲的智利和秘鲁，濒临灭绝。然而其生物生长量巨大而快速，特别是其丰富的野生基因资源，是现代栽培番茄抗性与杂交育种和品种改良的宝贵基因来源。目前国内外对茄科植物尤其是番茄的研究，多集中于番茄的常规杂交育种、番茄与病原菌互作机理、番茄红素和番茄碱合成与代谢、番茄耐热性、耐盐性以及番茄发育分子生物学等方面，而对番茄的野生近缘种里基茄的再生与遗传转化体系的构建方法，尚未见系统报道。 
里基茄是现代栽培番茄的野生近缘种，栽培番茄的DNA水平遗传多样性还不足其5%。其再生体系及遗传转化体系的构建不能简单地借鉴栽培番茄的相关研究成果，对于推进番茄分子育种的进程至关重要，具有显著的创新性和重大现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种构建野生番茄里基茄再生体系的方法。
本发明的再一目的是提供一种构建野生番茄里基茄遗传转化体系的方法。
根据本发明的构建野生番茄里基茄再生体系的方法包括以下步骤：
（1）里基茄无菌苗的培养；
（2）在愈伤诱导培养基CIM（Callus induction medium）中诱导里基茄的根、茎（无腋芽）和叶三种不同外植体产生愈伤组织与丛生芽点，其中愈伤诱导培养基CIM的配方为：MS盐+B5有机+20mg/L甘露醇+0.2mg/L玉米素+1.2mg/L生长素+30g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，pH5.8；
（3）将诱导出的丛生芽进行单株分离，转入无菌苗培养基SSCM2（Sterile seedling culture medium2）中诱导生根成苗。
根据本发明的构建野生番茄里基茄遗传转化体系的方法包括以下步骤：
（1）里基茄无菌苗的培养；
（2）对里基茄的三种外植体分别进行农杆菌侵染与共培养，其中共培养培养基CCPM（Co-culture/Preservation medium）的配方为：MS盐+B5有机+120mg/L肌醇+120mg/L磷酸二氢钾+0.8mg/L盐酸硫胺素+0.25mg/L2,4-D+0.15mg/L激动素+20mg/L甘露醇+30g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，pH5.8；
（3）将共培养后的外植体转入筛选培养基SCM1（Selective culture medium1）中进行抗性芽筛选，抗性芽培养成实生苗；
（4）炼苗、驯化与移栽。
根据本发明的构建野生番茄里基茄再生体系的方法，其中，在步骤（1）中，选择健康饱满的里基茄种子，用75%（v/v）的乙醇和2.5%的次氯酸钠消毒，4℃低温催芽，25℃黑暗孵育，然后于25℃，16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1的组培条件下进行培养。
根据本发明的构建野生番茄里基茄再生体系的方法，其中，在步骤（2）中，选取根、茎和叶三种外植体，置于愈伤诱导培养基上，然后于25℃，16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1的组培条件下进行培养，每月更换一次培养基。
根据本发明的构建野生番茄里基茄再生体系的方法，其中，在步骤（3）中，选择长度为1-2cm的丛生芽进行单株分离，转入无菌苗培养基SSCM2中诱导生根成苗，然后于25℃、16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1的组培条件下进行培养，每月更换一次培养基。
根据本发明的构建野生番茄里基茄遗传转化体系的方法，其中，在步骤（1）中，选择健康饱满的里基茄种子，用75%（v/v）的乙醇和2.5%的次氯酸钠消毒，4℃低温催芽，25℃黑暗孵育，然后于25℃、16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1的组培条件下进行培养。
根据本发明的构建野生番茄里基茄遗传转化体系的方法，其中，在步骤（2）中，选取根、茎（无腋芽）和叶三种外植体，置于共培养培养基CCPM上，于25℃、16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1的组培条件下共培养2d，农杆菌侵染后再放回共培养培养基CCPM上，黑暗培养3d。
根据本发明的构建野生番茄里基茄遗传转化体系的方法，其中，在步骤（3）中，将共培养后的外植体转至筛选培养基SCM1中进行抗性芽筛选，于25℃、16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1的组培条件下，进行筛选培养。
研究结果显示，25℃、16h光照/8h黑暗和光照度为120μmol.m-2s-1的组培条件是里基茄组织培养中不可或缺的关键条件。温度（25℃）显著影响着里基茄外植体的呼吸速度，调控外植体组织代谢过程的化学反应的进行；而光照（光周期和光照度， 16h光照/8h黑暗和光照度120μmol.m-2s-1），调控着里基茄的形态建成，组织的增殖和器官的分化和诱导愈伤组织的产生。
在诱导里基茄愈伤诱导培养基CIM中，主要添加两大类植物激素，即生长素类（生长素）和细胞分裂素类物质（玉米素）。生长素可以促进里基茄的细胞生长与分裂，用于诱导其愈伤组织的形成、根的分化和细胞的分裂和生长；而细胞分裂素可以促进里基茄细胞的分裂与分化，诱导其胚性结构和不定芽的形成。在共培养培养基CCPM中，主要添加了生长素类和细胞分裂素类的另外两类类似物，即2,4-D和激动素，目的仍然是利于提高里基茄细胞的生长和分裂速度，进而提高其侵染效率；合适的预培养和暗处共培养时段，以及温度，使得农杆菌vir区基因有较高的表达水平。
本发明选取野生番茄材料里基茄为再生和遗传转化研究的对象，而不是基因型专性很强的现代栽培番茄，更利于开展番茄基因工程方面的研究和番茄分子育种的进程；多数栽培番茄的再生和转化，只限定特定的外植体，而我们建立的里基茄的相应体系，适于三种外植体，并且转化介质和培养条件完全一致，大大节约了相关研究的费用支出；更重要的是，再生和转化效率高、体系稳定、试验时长短。
附图说明
图1为里基茄根、茎和叶的再生与转化，其中，A：里基茄无菌苗的根切段；B：里基茄无菌苗根的再生； C：里基茄无菌苗根的转化；D：根转化的GUS阳性苗； E：里基茄茎转化的GUS阳性苗； F：里基茄无菌苗的茎段； G：里基茄无菌苗茎的再生； H：里基茄无菌苗茎的转化；I：野生型里基茄；J：里基茄无菌苗的叶；K：里基茄无菌苗叶的再生；L：里基茄无菌苗叶的转化；M：里基茄叶转化的GUS阳性苗。
具体实施方式
实施例1
里基茄无菌苗培养：选择健康饱满的种子，先用75%（v/v）的乙醇进行种子表面消毒30s，无菌水冲洗5遍；再用2.5%的次氯酸钠浸种8-10min，无菌水冲洗3遍；将消毒后的种子置于无菌的1.5ml离心管中，4℃低温催芽4d；然后播于催芽培养基AGM（Accelerating germination medium）上，25℃黑暗孵育、催芽。将露出胚根的种子转移至幼苗培养基SSCM1（Seedlings culture medium1）上，于25℃、16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1的组培条件下进行培养，待无菌苗长出3-4片真叶， 便可进行以下实验。
在愈伤诱导培养基CIM（Callus induction medium）中诱导里基茄的根、茎（无腋芽）和叶三种不同外植体产生愈伤组织与丛生芽点：选取长势良好里基茄的三种不同外植体，即根（0.5cm）、茎（无腋芽，0.5cm）和叶（0.5×0.5cm2），其中叶的近轴面向上（根与茎段不考虑其方向性）平铺于愈伤诱导培养基CIM上，置于（1）中的组培条件下进行培养。每月更换一次培养基。
将诱导出的丛生芽进行单株分离，转入无菌苗培养基SSCM2（Sterile seedling culture medium2）中诱导生根成苗，获得实生苗。每月更换一次培养基。
对里基茄的三种外植体分别进行农杆菌侵染与共培养[CCPM，Co-culture/Preservation medium）]：将上述三种外植体从里基茄母株上切离，分别对其进行创伤处理，然后置于看护/共培养培养基上预培养2d[培养条件如（1）所述]；将预培养后的外植体浸于侵染介质中8-10min后，放回共培养培养基上，置于暗处共培养3d（25℃，黑暗培养）。
将共培养后的外植体转入筛选培养基SCM1（Selective culture medium1）中进行抗性芽筛选，最后将诱导出来的抗性芽转接至生根培养基上，诱导生根。
壮苗、驯化与移栽：将再生出的或转化筛选出的无菌苗培养20-30d，然后开瓶炼苗7d，用清水小股水流清洗掉残留琼脂块，将小苗移栽至混有少量土的小石块中，保鲜膜密闭保湿，于弱光下驯化培养；15d后除去保鲜膜，在较为干燥的环境和介质中养护。
野生番茄里基茄的三种外植体，即根、茎（无腋芽）和叶都能在添加植物激素类似物的MS培养基上再生成苗。试验以玉米素（0.2和0.5mg/L）和生长素（0、0.6、1.2和1.8mg/L）组合进行。结果显示，无生长素存在时，未能成功诱导里基茄再生；而玉米素为0.2mg/L和生长素为1.2mg/L的组合，里基茄三种外植体的再生诱导率均高于其他各个组合，分别达84%（根）、63%（茎）和100%（叶）。
表1所用培养基名称缩写、名称与组分

Claims (1)

1.一种构建野生番茄里基茄再生体系的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)里基茄无菌苗的培养，选择健康饱满的里基茄种子，用75％v/v的乙醇和2.5％的次氯酸钠消毒，4℃低温催芽，25℃黑暗孵育，然后于25℃，16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1的组培条件下进行培养；
(2)在愈伤诱导培养基CIM中诱导里基茄的根、茎和叶三种不同外植体产生愈伤组织与丛生芽点，选取根、茎和叶三种外植体，置于愈伤诱导培养基CIM上，然后于25℃，16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1的组培条件下进行培养，其中愈伤诱导培养基CIM的配方为：MS盐+B5有机+20mg/L甘露醇+0.2mg/L玉米素+1.2mg/L生长素+30g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，pH5.8，每月更换一次培养基；
(3)选择长度为1-2cm的丛生芽进行单株分离，转入无菌苗培养基SSCM2中诱导生根成苗，然后于25℃、16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1的组培条件下进行培养，每月更换一次培养基，其中，无菌苗培养基SSCM2中的组分为：MS盐+B5有机+0.15mg/Lα-萘乙酸+20mg/L甘露醇+30g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，pH5.8。
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