CN103314849B - 一种野生番茄里基茄体胚发生诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及遗传转化领域，具体地涉及一种野生番茄里基茄体胚诱导方法及体胚遗传转化方法。所述方法包括步骤：（1）培养里基茄无菌苗；（2）在胚性愈伤诱导培养基ECIM上，暗培养诱导里基茄的根、茎（无腋芽）和叶产生胚性愈伤组织；（3）将产生胚性愈伤组织转至光下体细胞胚胎发生诱导培养基SEIM上诱导体胚发生；（4）诱导出芽、成苗。
Description
技术领域
本发明涉及遗传转化领域，具体地涉及一种野生番茄里基茄体胚发生诱导方法。
背景技术
番茄是一种世界性茄科经济作物，野生番茄里基茄是现代栽培番茄的野生近缘种，其自然生长条件特殊、地理分布范围狭窄，仅存于南美洲的智利和秘鲁，濒临灭绝。然而其生物生长量巨大而快速，特别是其丰富的野生基因资源，是现代栽培番茄抗性与杂交育种和品种改良的宝贵基因来源。
目前国内外对茄科植物尤其是番茄的研究，多集中于番茄的常规杂交与分子育种、番茄植物与病原菌互作机理、番茄红素和番茄碱合成与代谢、番茄耐热性、耐盐性以及番茄发育分子生物学等方面，而对番茄的野生近缘种里基茄体胚发生诱导及体胚遗传转化体系的方法，尚未见系统报道。
里基茄是现代栽培番茄的野生近缘种，栽培番茄的DNA水平遗传多样性还不足其5％。其体胚发生诱导及体胚遗传转化体系的构建不能简单地借鉴栽培番茄的相关研究成果，对于推进番茄分子育种和茄科植物体细胞胚胎发育分子生物学的研究进程至关重要，具有显著的创新性和重大现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种野生番茄里基茄体胚发生诱导方法。
本发明的再一目的是提供一种野生番茄里基茄体胚遗传转化方法。
根据本发明的野生番茄里基茄体胚发生诱导方法包括以下步骤：
(1)培养里基茄无菌苗；
(2)在胚性愈伤诱导培养基ECIM(Embryoniccallusinductionmedium)上，暗培养诱导里基茄的根、茎(无腋芽)和叶产生胚性愈伤组织，其中，胚性愈伤诱导培养基ECIM的配方为：MS盐+B5有机+(0，0.5，1.0和1.5mg/L)α-萘乙酸或(0，0.5，1.0和1.5mg/L)2,4-二氯苯氧乙酸+30g/L蔗糖+3.7g/L结冷胶，pH5.8，其中，α-萘乙酸与2,4-二氯苯氧乙酸须择一添加，优选添加量均为1.0mg/L；
(3)将产生胚性愈伤组织转至光下体细胞胚胎发生诱导培养基SEIM(Somaticembyrogenesisinductionmedium)上诱导体胚发生，其中，培养基SEIM的配方为：MS盐+MS有机+20mg/L噻苯隆(其中，分四个梯度进行试验，发结果证明20mg/L噻苯隆的效果最好)+30g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，pH5.8；
(4)将诱导出的体胚转移至分化培养基SERM(Somaticembryosregenerationmedium)上诱导出芽、成苗。
根据本发明的野生番茄里基茄体胚遗传转化方法包括以下步骤：
(1)培养里基茄无菌苗；
(2)在胚性愈伤诱导培养基ECIM(Embryoniccallusinductionmedium)上，暗培养诱导里基茄的根、茎(无腋芽)和叶产生胚性愈伤组织，其中，胚性愈伤诱导培养基ECIM的配方为：MS盐+B5有机+1.0mg/Lα-萘乙酸或2,4-二氯苯氧乙酸+30g/L蔗糖+3.7g/L结冷胶，pH5.8；
(3)将产生胚性愈伤组织转至光下体细胞胚胎发生诱导培养基SEIM(Somaticembyrogenesisinductionmedium)上诱导体胚发生，其中，培养基SEIM的配方为：MS盐+MS有机+20mg/L噻苯隆+30g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，pH5.8；
(4)将诱导出的体胚转移至分化培养基SERM(Somaticembryosregenerationmedium)上诱导出芽、成苗；
(5)以诱导出的里基茄体胚为外植体进行农杆菌侵染[SUS(Suspensions)]与共培养[CCPM(Co-culture/Preservationmedium)]，所述共培养培养基CCPM的配方为：MS盐+B5有机+120mg/L肌醇+120mg/L磷酸二氢钾+0.8mg/L盐酸硫胺素+0.25mg/L2,4-D+0.15mg/L激动素+20mg/L甘露醇+30g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，pH5.8；
(6)将共培养后的体胚转入筛选培养基SCM2(Selectiveculturemedium2)中进行抗性丛生芽筛选；
(7)抗性芽培养成实生苗SSCM2(Steriledseedlingsculturemedium2)，炼苗、驯化与移栽。
根据本发明所述的野生番茄里基茄体胚发生诱导方法，在步骤(1)中，选择健康饱满的种子，先用75％(v/v)乙醇和2.5％的次氯酸钠消毒，4℃低温催芽；25℃黑暗孵育。然后于25℃、16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1的组培条件下进行培养。
根据本发明所述的野生番茄里基茄体胚发生诱导方法，在步骤(2)中，选取根、茎和叶三种外植体，置于胚性愈伤诱导培养基ECIM上，按照(1)中的培养条件进行培养。每月更新一次培养基。
根据本发明所述的野生番茄里基茄体胚发生诱导方法，在步骤(3)中，把上述三种外植体转至体细胞胚胎诱导培养基SEIM上，在弱光与TDZ的条件下，诱导体胚发生。每月更新一次培养基。
根据本发明所述的野生番茄里基茄体胚发生诱导方法，在步骤(4)所述，将诱导出的体胚可转入体胚再生培养基SERM上诱导成苗，也可于母体上直接发育成苗。
根据本发明的野生番茄里基茄体胚发生诱导方法，在步骤(5)中，将诱导出的体胚从母体上切离，人为创伤处理后，然后置于看护培养基(也叫共培养培养基)上预培养2d(培养条件如(1)所述)；将预培养后的体胚浸于侵染介质中8-10min，放回共培养培养基上，置于暗处共培养3d(25℃，黑暗培养)。
根据本发明的野生番茄里基茄体胚发生诱导方法，在步骤(6)中，对共培养后的外植体，置于筛选培养基上SCM进行筛选培养，诱导抗性芽，将诱导出来的抗性芽转接至体胚再生培养基SERM进行成苗诱导。
根据本发明的野生番茄里基茄体胚发生诱导方法，在步骤(7)所述，将由体胚诱导出来的无菌苗开瓶炼苗7d，用清水小股水流清洗掉残留琼脂块，将小苗移栽至混有少量土的小石块中，于弱光下进行保鲜膜保湿培养。15d后除去保鲜膜，在较为干燥的环境和介质中进行养护。
本发明的方法包括：里基茄无菌苗的培养；在胚性愈伤诱导培养基ECIM上，暗培养诱导里基茄的根、茎(无腋芽)和叶产生胚性愈伤；将暗培养后的外植体转至光下体细胞胚胎发生诱导培养基SEIM上诱导体胚发生；将诱导出的体胚转至分化培养基SERM上诱导出芽、成苗；以体胚为外植体进行农杆菌侵染(SUS)与共培养(CCPM)；将共培养后的体胚转入筛选培养基SCM2中进行抗性丛生芽筛选；抗性芽培养成实生苗(SSCM2)。本发明可快速、高效地诱导出里基茄体胚，并且可以其体胚为转化外植体成功转化外源基因。所诱导出的体胚可于母体上直接发育成苗，亦可离体成苗，成苗率100％；所建立的体胚遗传转化体系，稳定、高效。本发明可为野生番茄体胚发生的分子机制研究和抗性、杂交育种中关键基因的功能分析提供稳定的受体系统和验证平台。
在诱导里基茄胚性愈伤诱导培养基ECIM中，添加生长素类物质(NAA或者2,4-D)。生长素或者生长素类似物可显著促进里基茄的细胞生长与分裂，高效诱导其愈伤组织的形成。在体细胞胚胎发生诱导培养基SEIM中，添加了具有生长素和细胞分裂素的双向调控性能，加之光照诱导利于提高里基茄细胞的生长和分裂速度，进而诱导出胚性结构；合适的预培养和暗处共培养时段，以及温度，使得农杆菌vir区基因有较高的表达水平，大大提高了其转化效率。
附图说明
图1为里基茄根、茎和叶的胚胎发生诱导与体胚转化；A：里基茄无菌苗的根经2,4-D暗培养诱导产生的胚性愈伤；B：里基茄无菌苗的根经NAA暗培养诱导产生的胚性愈伤，红框标记类根体结构；C：由根诱导出的体胚；D：母株上的体胚发育成苗；E：通过体胚转化得到的阳性苗；F：茎段经2,4-D暗培养诱导产生的胚性愈伤；G：茎段经NAA暗培养诱导产生的胚性愈伤；H：由茎段诱导出的体胚；I：经X-gluc染色的对照株；J：叶片经2,4-D暗培养诱导产生的胚性愈伤；K：叶片经NAA暗培养诱导产生的胚性愈伤；L：由叶片诱导出的体胚；M：经X-gluc染色的由体胚转化得到的阳性苗。
具体实施方式
实施例1
下面结合里基茄实例对本发明进行详细说明。
(1)无菌苗培养：选择健康饱满的种实，先用75％(v/v)乙醇表面消毒30s，无菌水冲洗5遍；再用2.5％次氯酸铵处理8-10min，无菌水冲洗3遍；将消毒后的种子至于无菌1.5ml离心管中，4℃低温催芽4d；然后将之播于催芽培养基AGM(Acceleratinggerminationmedium，MS+3％蔗糖+0.1mg/LGA3+7.8g/L琼脂粉，pH5.8)上，于25℃黑暗孵育、催芽。将露出胚根的种子转移至幼苗培养基SSCM1(Seedlingsculturemedium1)上，至于25℃，16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1组培条件下进行培养，待无菌苗长出3-4片真叶，便可开展后续实验。
(2)暗培养里基茄三种不同外植体，诱导胚性愈伤组织：选取长势良好的三种外植体，即根(0.5cm长)、茎(无腋芽，0.5cm)和叶(0.5×0.5cm2)，叶的近轴面向上平(根与茎段不考虑其方向性)铺于胚性愈伤诱导培养基ECIM(Embryoniccallusinductionmedium)上，至于暗处25℃诱导愈伤组织。每月更新一次培养基。
(3)光下诱导体胚：见上述三种外植体转至体细胞胚胎诱导培养基SEIM(Somaticembyrogenesisinductionmedium)上，在弱光与TDZ的条件下，诱导体胚发生，每月更新一次培养基。
(4)所诱导出的体细胞胚胎分化成苗：所诱导出的体细胞胚胎可于母体上直接分化成苗，也可转入基本培养基MS上诱导成苗。
(5)以里基茄体胚为外植体进行农杆菌共培养：将诱导出的体胚从母体上切离，对其进行人为创伤处理，然后置于看护培养基(也叫共培养培养基)上预培养2d(25℃，16h光照/8h黑暗，光照度为120μmol.m-2s-1)；将预培养后的体胚浸泡于侵染介质中8-10min后，放回共培养培养基上，置于暗处共培养3d(28℃，黑暗培养)。
(6)筛选培养基中进行抗性丛生芽诱导与筛选：对共培养后的外植体，置于筛选培养基上SCM(Selectiveculturemedium)进行筛选培养，诱导丛生芽；最后将诱导出来的抗性芽转接至SERM(Somaticembryosregenerationmedium)进行生根诱导。
(7)壮苗、驯化与移栽：将由体细胞胚胎诱导出来的无菌苗开瓶炼苗7d，用清水小股水流清洗掉残留琼脂块，将小苗移栽至混有少量土的小石块中，于弱光下进行保鲜膜保湿培养，15d后除去保鲜膜，在较为干燥的环境和介质中进行养护。
表1所用培养基名称缩写、名称与组分
野生番茄里基茄的三种外植体，即根、茎(无腋芽)和叶都能在暗培养(添加生长素类似物)后，再添加一定浓度TDZ和光照条件下诱导出体细胞胚胎。结果显示，NAA和2,4-D诱导产生胚性愈伤的最佳浓度为1.0mg/L，出愈率分别为91％(根/NAA)、87％(茎/NAA)和95％(叶/NAA)，73％(根/2,4-D)、67(茎/2,4-D)和79％(叶/2,4-D)；TDZ的添加浓度为20mg/L时诱导出的体细胞胚胎相对最多，达到差异极显著水平，体胚诱导率分别为67.07％(根/NAA)、33.83％(茎/NAA)和83.63％(叶/NAA)，38.07％(根/2,4-D)、29.40％(茎/2,4-D)和45.87％(叶/2,4-D)。
Claims (1)
1.一种野生番茄里基茄体胚发生诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)培养里基茄无菌苗；
(2)在胚性愈伤诱导培养基ECIM上，暗培养诱导里基茄的根、无腋芽茎和叶产生胚性愈伤组织，其中，胚性愈伤诱导培养基ECIM的配方为：MS盐+B5有机+1.0mg/Lα-萘乙酸或+1.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸+30g/L蔗糖+3.7g/L结冷胶，pH5.8；
(3)将产生胚性愈伤组织转至光下体细胞胚胎发生诱导培养基SEIM上诱导体胚发生，其中，培养基SEIM的配方为：MS盐+MS有机+20mg/L噻苯隆+30g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，pH5.8；
(4)将诱导出的体胚转移至分化培养基SERM上诱导出芽、成苗，所述SERM培养基的配方为：MS盐+MS有机+2mg/L6-苄氨基腺嘌呤+0.2mg/L吲哚丁酸+0.2mg/L赤霉素+0.15mg/Lα-萘乙酸+20mg/L甘露醇+30g/L蔗糖+7.8g/L琼脂粉，pH5.8。
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