CN101658134B - 番茄雌核发育培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种诱导番茄雌核发育的培养方法，其以处于E期或F期的番茄花蕾的离体胚珠作为外植体，在愈伤组织诱导培养基上诱导产生愈伤组织，其中所述E期或F期的番茄花蕾是指萼片合抱，萼片开裂最深处至花瓣顶端的长度为0-3mm的番茄花蕾。通过该方法可获得大量愈伤组织，为研究诱导雌核发育途径获得番茄单倍体提供有先决条件。进一步，本发明将愈伤组织在特定的培养基上分化成芽，最后通过生根培养获得完整植株。这为诱导雌核发育途径获得番茄单倍体的研究提供了可能性。
Description
技术领域
本发明涉及无性繁殖技术，具体涉及一种由番茄雌核诱导得到愈伤组织，以及进一步发育获得植株的方法。
背景技术
番茄单倍体培养技术的建立对于番茄育种、分子标记、遗传图谱构建、基因定位、基因克隆等均有极其重要的意义。诱导植物的雄核发育和雌核发育是获得单倍体的2条途径。诱导雄核发育途径包括花药和小孢子培养技术，该技术已应用于大麦、小麦、玉米、水稻、烟草、亚麻、油菜、甘蓝、茄子、西瓜等作物的育种。诱导雌核发育途径包括未授粉的子房和胚珠培养，并在小麦、水稻、烟草、大蒜、甜菜、非洲菊等作物中获得成功。番茄的单倍体培养起始于1971年，Sharp得到了栽培番茄花药的愈伤组织。Gresshoff和Doy(1972)培养番茄花药获得了植株，同年Sharp创造了番茄花粉的滋养培养技术。随后众多研究者进行了番茄花药和小孢子培养研究，但普遍存在着愈伤组织诱导率低，成苗难的问题，获得了少量的花药植株，而小孢子培养仅至球形胚和类心形胚阶段，尚未得到进一步的结果(Debergh和Nitsch(1973)；Devreux等(1976)；Debergh(1978)；Cappadocia(1980)；高秀云、王纪方等(1979，1980)；Gulshan等(1981；Krueget-Lebus等(1983)；Shamina和Yadav(1986)；Evans和Morrison(1989)；袁亦楠(1999))。因此，本申请发明人考虑进一步探索另一条获得番茄单倍体的途径——诱导雌核发育。关于番茄雌核发育的研究较少，Ugur和Bal KazimAbak(2003)进行了番茄的子房培养，未获得愈伤组织，在培养过程中子房逐渐枯萎最后死亡。
发明内容
本发明的目的在于提供一种番茄雌核培养方法，为番茄雌核诱导愈伤以及随后育成植株提供可能。
本发明方法是以处于E期或F期的番茄花蕾的离体胚珠作为外植体，在愈伤组织诱导培养基上诱导产生愈伤组织，其中所述E期或F期的番茄花蕾是指萼片合抱，萼片开裂最深处至花瓣顶端的长度为0-3mm的番茄花蕾。
其中所述愈伤组织培养基为优选为含有适当生长素和细胞分裂素的B5培养基。可用的生长素及细胞分裂素包括2，4-D、6-BA、NAA、IBA、KT、TDZ的浓度范围为0.1μmol.L-1-500μmol.L-1。优选培养基包括：
B5+2.0μmol.L-1 2，4-D+1.0μmol.L-1 6-BA；
B5+2mg.L-1 2，4-D+1.0μmol.L-1 6-BA+5.0μmol.L-1NAA+1.0μmol.L-1IBA+1.0μmol.L-1KT；
B5+2.0μmol.L-12，4-D+1.0μmol.L-16-BA+2.0μmol.L-1NAA+1.0μmol.L-1TDZ。
上述培养基的蔗糖浓度优选为1-3％，琼脂糖浓度为0.6-1％，pH5.8。更优选为2％，琼脂糖浓度为0.8％，pH5.8。
在上述培养基上按照常规植物愈伤组织诱导培养即可，优选的培养条件是：完全黑暗培养，温度28℃，湿度70％。
按照上述方法进行对番茄雌核进行培养，结果表明处于E和F期的胚珠在培养8～12h后就开始分裂生长，能够分化成愈伤组织的胚珠数目可达60％以上。
本发明还进一步将上述愈伤组织在分化培养基上培育成植株。可用的生长素及细胞分裂素包括2，4-D、6-BA、NAA、IBA、KT、TDZ的浓度范围为0.1μmol.L-1-500μmol.L-1。优选的分化培养基包括：
(1)B5+NAA0.02mg.L-1+ZT1.0mg.L-1；
(2)B5+NAA0.5μmol.L-1+ZT10.0μmol.L-1；
(3)B5+NAA4.mg.L-1+2，4-D1.mg.L-1+KT0.8mg.L-1；
(4)B5+IAA0.01mg.L-1+ZT2.0mg.L-1；
(5)MS+IAA0.2mg.L-1+2mg.L-16-BA；
(6)DBM II+NAA0.5μmol.L-1+ZT10μmol.L-1。
上述培养基的蔗糖浓度优选1-3％，琼脂糖浓度为0.6-1％，pH5.8-6.0。更优选为2％，琼脂糖浓度为0.8％，ph5.8。
在上述培养基上按照常规的分化培养条件培养即可，优选的分化培养的条件是，16h光照(90μmol.m-2.s-1)，8h小时黑暗，温度28℃，湿度70％，每20-40d更换1次培养基。
经上述分化培养过程中，多数愈伤组织为绿色，表现正常，少数愈伤组织可长成4cM大小的“果实”，最后成熟，“果实”表面不如正常番茄光滑，中空，内部没有种子或类似于种子的痕迹，但有番茄的“味道”。
在B5+IAA0.01mg.L-1+ZT2.0mg.L-1培养基中培养的愈伤组织能够分化成芽，再经生根培养即可获得完整植株。
生根培养可按照常规方法进行，优选当芽生长至2-3片叶时，将其转移至生根培养基MS+0.2mg.L-1IAA+2％蔗糖+0.8％琼脂，ph5.8中培养，1周后根即长成。
本发明番茄雌核培养方法，采用E期或F期的番茄大孢子的离体胚珠作为外植体，进行培养，可获得大量愈伤组织，为研究雌核发育途径获得番茄单倍体提供有先决条件。进一步，本发明还提供了分化培养方法，结果表明，在本发明提供的分化培养基上进行培养多数愈伤组织为绿色，表现正常，少数愈伤组织可长成4cM大小的“果实”，最后成熟，“果实”表面不如正常番茄光滑，中空，内部没有种子或类似于种子的痕迹，但有番茄的“味道”。在特定的培养基上进行培养还能分化成芽。进一步，通过生根培养可获得完整植株。这为雌核发育途径获得番茄单倍体的研究提供了可能性。
附图说明
图1所示的是番茄花蕾发育的不同时期；
图2所示的是培养3周后E、F型的膨大子房；
图3所示的是在离心管中培养1周后的胚珠，右图为左图其中一管在200倍下的照片；
图4是分别生长在离心管和三角瓶中的愈伤组织；
图5是由胚珠发育而来的“果实”；
图6是愈伤组织分化形成的芽点；
图7是愈伤组织分化形成的芽；
图8是再生植株。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1愈伤组织诱导培养
1材料与方法
1.1材料试材为中国农业科学院蔬菜花卉研究所育成的两个杂交番茄品种‘中杂101’和‘中杂105’(购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所)，2006-2008年种植于春季温室、春季大棚、露地、秋季大棚和秋季温室，以保证周年采集样本，每种材料每次种植40-100株，均按常规方法管理，植株定植1周后选取合适的花蕾进行子房和胚珠分离。
1.2诱导培养基的筛选共选用了20种诱导培养基，其成分以B5和MS(均购自Sigma公司)为基本培养基，附加不同浓度(1-100μmol.L-1)的生长素(IAA、NAA、2，4-D、IBA)和细胞分裂素(KT、6BA、TDZ、ZT)共组成20种培养基，蔗糖浓度均为2％，琼脂糖浓度均为0.8％，pH5.8-6.0。
将50mL诱导培养基分装于2mL的离心管，每离心管400μL，120℃下灭菌15-18min。在无菌条件下将‘中杂101’和‘中杂105’两个品种从现蕾至花开前期的胚珠混合接种于离心管中的诱导培养基上，观察胚珠细胞的分裂和分化情况，筛选出最佳的培养基。
1.3培养时期的筛选以‘中杂105’为材料，按照花蕾和花药大小、距开花时间等分7个时期(表1)取样，将胚珠分别置于最佳的诱导培养基上，观察胚珠细胞分裂和分化情况，以确定最佳的取样时期。
1.4番茄子房和胚珠外植体比较选取最佳时期的花蕾，剥离出子房，用10％次氯酸钠灭菌16-20min，再用去离子无菌水冲洗3～4次。在无菌条件下将下列4种外植体接种于诱导培养基：
(1)完整子房；
(2)将子房切除外部果皮后使胚株外露；
(3)将子房切除外部果皮后使胚株外露，再将其切成长与宽均约1-3mm的胚珠块，每一小块均有少量的胎座组织，胎座组织上大约含有数十个胚珠；
(4)离体胚珠。
每个品种的不同外植体接种10个离心管，每个离心管接种2～3个子房、半子房或胚珠块，接种100～200个胚珠。在28℃下进行暗培养，每12h检查1次。
2结果
2.1适宜的诱导培养基
将现蕾至花开前期的混合胚珠接种于20种诱导培养基进行筛选的结果表明，以下3种诱导培养基能使部分胚珠较快地生长出愈伤组织，可用于胚珠和子房的诱导培养，并且对‘中杂101’和‘中杂105’的诱导效果一致，这3种培养基是：
B5+2.0μmo1.L-1 2，4-D+1.0μmo1.L-1 6-BA；
B5+2mg.L-1 2，4-D+1.0μmol.L-1 6-BA+5.0μmol.L-1NAA+1.0μmol.L-1IBA+1.0μmol.L-1KT；
B5+2.0μmol.L-12，4-D+1.0μmol.L-16-BA+2.0μmol.L-1NAA+1.0μmol.L-1TDZ。
3种培养基的蔗糖浓度均为2％，琼脂糖浓度为0.8％，pH5.8。
2.2适宜的培养时期
在诱导培养基的筛选中发现，现蕾至花开前期的混合胚珠中只有一小部分能在诱导培养基中生长，表明并非所有发育时期的胚珠均适于离体培养，需要进行最佳培养时期的筛选。以‘中杂105’为试材，将处于A-G(表1，图1)7个时期的胚珠于上述3种诱导培养基上培养。结果表明，处于A-C时期和G时期的胚株不能进一步脱分化和进行细胞分裂，在培养过程中逐渐褐化，最终死亡；处于D期的花蕾，在培养过程中，仅有少量较小的胚珠分裂和生长；处于E和F期的胚珠在培养8～12h后就开始分裂生长，能够分化成愈伤组织的胚珠数目可达60％以上。
因此认为，最适于进行番茄大孢子培养时期为E和F期。对两时期花蕾的花粉进行观察，可以观察到单核早期至单核晚期的花粉粒，表明E和F期为单核期。最易于识别这两个时期的取样标准是萼片合抱，萼片开裂最深处至花瓣顶端的长度为0-3mm(图1，表1)。利用该标准对‘中杂101’和其它番茄材料进行取材和培养，结果与‘中杂105’一致。
表1 中杂105番茄花蕾的分类
2.3不同外植体的培养效果
2.3.1完整的子房培养对中杂101和中杂105两个番茄品种E和F时期的子房培养结果表明：在培养3d后，子房开始膨大，至4周后生长至最大，大小是原来的4-8倍，继代培养3个月后，果实开始变色，至4个月后完全变红，但果实内部没有种子或类似于种子的痕迹，也未观察到来自于胚株的愈伤组织或胚状体(图2)。
2.3.2半子房培养将‘中杂101’和‘中杂105’两个番茄品种E和F时期的子房切除外部果皮后使胚株外露，然后置于培养基上培养，培养2～3d后，的胚珠均略有膨大，但在随后的培养过程中停止生长并逐渐褐化，最后死亡，在培养过程中也未观察到来自胎座和其它组织的愈伤组织的分化现象。
2.3.3胚珠块培养将E和F期子房切除外部果皮后使胚株外露，再将其切成长与宽均约1-3mm的胚珠块置于培养基上培养，培养3～5d后胎座组织开始由绿变褐，胚珠略有膨大，但随后停止生长并逐渐褐化，最后死亡，在培养过程中也未观察到来自胎座的愈伤组织的分化现象。
2.3.4胚株的培养
将处于E和F期的离体胚株置于诱导培养基上，7-12h后胚珠开始膨大，颜色逐渐变白，呈不透明状态。1周后体积增加1倍，60％以上的胚珠成长为不透明的白球状，并在胚株与珠柄的断裂处留下一个褐色的痕迹(图3)。10-15d开始形成愈伤组织，20d后的愈伤组织可达到2-3mm，每个离心管中均可生长出50-100个愈伤组织。‘中杂101’和‘中杂105’两个品种之间无明显的差异，均获得上千个的愈伤组织。
实施例2分化培养及生根培养
1、材料和方法
1.1材料实验材料为实施例1获得的愈伤组织。待愈伤组织形成并生长至2mm左右时，在无菌条件下将其转移至分化培养基中。子房、半子房和胚珠块也可以采用普通培养方法，将其接种于三角瓶或者培养皿中的培养基上。
1.2分化培养基的筛选选用了60种分化培养基—以B5、MS、DBM II(GreshoffP.M.Doy C.H.1972)、Nitsch和N6为基本培养基，附加不同浓度(0.1-1000μmol.L-1)的生长素(吲哚乙酸IAA、α-萘乙酸NAA、2，4-D)和细胞分裂素(激动素KT、6-苄氨基嘌呤6-BA、TDZ、玉米素ZT)，蔗糖浓度为2％，琼脂糖浓度为0.8％，pH5.8-6.0。
当愈伤组织达到2mm大小时，将其转移至分化培养基上，16h光照(90μmol m-2s-1)，8h黑暗培养，温度28℃，湿度70％，每20-40d更换1次培养基。早期的分化培养基可以分装于离心管中，但当愈伤组织达到5mm左右后须转移至50或100mL的三角瓶中培养。
1.3生根培养及根尖染色体倍性鉴定
当愈伤组织诱导出芽并生长至2-3片叶时，将其转移至MS+0.2mg/L IAA+2％蔗糖+0.8％琼脂，pH5.8的生根培养基中培养，培养条件与分化培养相同。根尖的染色体的倍性鉴定采用朱徵(1982)的方法。
2结果
将2个品种的愈伤组织接种于60种不同的分化培养基中，一部分培养基中的愈伤组织逐渐褐化，最后死亡，另一部分培养基中的愈伤组织生长极其缓慢，最后筛选到6种较好的培养基，在这6种培养基中的愈伤组织生长正常，速度较快。
(1)B5+NAA0.02mg.L-1+ZT1.0mg.L-1；
(2)B5+NAA0.5μmol.L-1+ZT10.0μmol.L-1；
(3)B5+NAA4.mg.L-1+2，4-D1.mg.L-1+KT0.8mg.L-1；
(4)B5+IAA0.01mg.L-1+ZT2.0mg.L-1；
(5)MS+IAA0.2mg.L-1+2mg.L-16-BA；
(6)DBMII+NAA0.5μmol.L-1+ZT10μmol.L-1。
6种培养基的蔗糖浓度均为2％，琼脂糖浓度为0.8％，ph5.8-6.0。
将2个品种的白色的愈伤组织接种于上述6个培养基中，1周后开始膨大，随后表面稍为变褐，3周左右开始变绿，2-3月后完全变绿，随后继续生长(图4)。‘中杂101’番茄在更换15-20次培养基并生长20月后，3个愈伤组织开始出现绿色的芽点(图6)，再过2-3周后形成2cm左右高的植株，此时，多数愈伤组织为绿色，表现正常，少数愈伤组织可长成4cm大小的“果实”，最后成熟，“果实”表面不如正常番茄光滑，中空，内部没有种子或类似于种子的痕迹，但有番茄的“味道”(图5)。
‘中杂105’番茄也得到类似于‘中杂101’的愈伤组织和“果实”。在更换10-12次培养基并生长15月后，5个愈伤组织开始出现绿色的芽点(图6)，再过2-3周后形成2cm左右高的植株，如果需要可利用这些愈伤组织分化出更多的芽(图7)。
当芽生长至2-3片叶时，将来自愈伤组织的芽转移至生根培养基MS+0.2mg.L-1IAA+2％蔗糖+0.8％琼脂，ph5.8中培养，1周后根即长成(图8)。根尖染色体鉴定结果其染色体数为24条。
本发明建立了在诱导愈伤组织阶段的番茄胚珠的微型培养方法，实验表明，选择最佳时期的花蕾进行胚珠培养是必须的，本研究结果表明，E和F类花蕾的胚珠最适合培养，其所对应的小孢子时期为单核期。根据花蕾大小、花药大小、颜色和胚珠大小来选择单核期的花蕾，在不同的番茄材料中会出现较大的偏差，因此，依据萼片开裂最深处至花瓣顶端的长度为0-3mm(将于4-5d后开放)作为取样标准，大大提高了取样的准确性。
此外，直接将胚珠接种在三角瓶或培养皿中的常规方法相比，采用2mL的离心管进行培养具有优越性，其最主要的优点是可以大大降低污染率，因为和小孢子相比胚珠的数量是较少的，50个子房的胚珠仅能接种在2-3个三角瓶中，在预备实验中每个三角瓶平均可长出2-3个细菌病斑，污染率高达80％以上，在秋季甚至可达100％。而将50个子房的胚株置于20-30个离心管中培养，仅有3-6个离心管受到污染，培养效率数倍地提高，此外采用离心管法培养还可节省大量的培养基。
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Claims (7)
1.番茄雌核发育培养方法，其以处于E期或F期的番茄花蕾的离体胚珠作为外植体，在愈伤组织诱导培养基上诱导产生愈伤组织，其中所述E期或F期的番茄花蕾是指萼片合抱，萼片开裂最深处至花瓣顶端的长度为0-3mm的番茄花蕾，其中所述愈伤组织诱导培养基选自：
B5+2.0μmol·L-1 2，4-D+1.0μmol·L-16-BA；
B5+2mg·L-12，4-D+1.0μmol·L-16-BA+5.0μmol·L-1NAA+1.0μmol·L-1IBA+1.0μmol·L-1KT；
B5+2.0μmol·L-12，4-D+1.0μmol·L-16-BA+2.0μmol·L-1NAA+1.0μmol·L-1TDZ，
这三种培养基的蔗糖浓度为1-3％，琼脂糖浓度为0.6-1％，pH 5.8。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述愈伤组织诱导培养在离心管中进行。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，其还包括将诱导获得的愈伤组织进行分化培养。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述分化培养的培养基选自：
(1)B5+NAA0.02mg·L-1+ZT1.0mg·L-1；
(2)B5+NAA0.5μmol·L-1+ZT10.0μmol·L-1；
(3)B5+IAA0.01mg·L-1+ZT2.0mg·L-1；
(4)MS+IAA0.2mg·L-1+2mg·L-16-BA；
(5)DBMII+NAA0.5μmol·L-1+ZT10μmol·L-1，
这5种培养基的蔗糖浓度为1-3％，琼脂糖浓度为06-1％，pH 5.8。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，分化培养的条件是，16h光照培养，8h暗培养，温度28℃，湿度70％，每20-40天更换1次培养基。
6.如权利要求4或5所述的方法，其还包括愈伤组织分化成芽后进行生根培养。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述生根培养基为：MS+0.2mg·L-1IAA+2％蔗糖+0.8％琼脂，pH 5.8。
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