CN1650697A - 番茄纯合体的快速培育方法 - Google Patents

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一种番茄纯合体的快速培育方法，通过细胞学观察选取适宜花药进行培养；将花药接种于MS基本培养基+激动素KT+萘乙酸NAA+蔗糖+琼脂的培养基进行愈伤组织的诱导培养；将具有一定大小的愈伤组织接种于MS+苄基腺嘌呤BA+吲哚乙酸IAA+蔗糖+琼脂的培养基上进行分化培养；切取分化的小植株，再接入MS+IAA+蔗糖的生根培养基中进行生根培养，获得完整植株；再用简单序列重复SSR分子标记验证筛选出纯合体。本发明与传统育种技术相比，大大缩短了育种周期，利用SSR分子标记检测纯合体可提高检测效率，且不会丢失自然加倍的纯合二倍体。

Description

番茄纯合体的快速培育方法
技术领域
本发明涉及一种番茄纯合体的快速培育方法，用于番茄、茄子、辣椒等茄果类蔬菜新品种培育，属于农作物育种技术领域。
背景技术
番茄为严格的自花授粉植物，长期的人工驯化和有性杂交，使其基因背景越来越窄，一些耐逆境基因及一些不易被人们味觉感知的品质基因已很难在其栽培种中找到，但能在其野生近缘种中找到。例如，秘鲁番茄的维生素C含量为栽培番茄的100倍之多；秘鲁番茄、奇士曼尼番茄、潘那利番茄、醋栗番茄都表现出一定的耐盐性等。
虽说许多研究证明上述野生材料都能与栽培种通过有性杂交实现基因的转移和重组，但由于后代遗传性状的分离必须进行多代自交才能获得纯系，大大延长了育种时间。通过花药或花粉培养获得单倍体植株，再经染色体自然或人工加倍能快速得到纯合二倍体。这种纯合二倍体在遗传上稳定，不易发生性状分离，因此，通过花药或花粉培养能极早稳定分离后代、缩短育种年限(倪丕冲，我国水稻花培育种及其应用，农业科技通迅，1991，(5)：5～6)。
在蔬菜作物中，番茄自发的单倍体植株首先被发现，其次是石刁柏和辣椒。但由于单倍体的自然发生率极低(通常为0.002％-0.02％)，因此，人为地诱导形成单倍体植株引起了不少研究者的关注(董艳荣，龚义勤.茄果类蔬菜花药和花粉培养研究进展.长江蔬菜，2001，5：30-32)。
在以往的研究中，大家习惯于通过核型分析的染色体计数来区别真假单倍体，有时会误将花药或花粉培养过程中自然加倍的纯合二倍体丢弃，而忽略了培育单倍体的最终目的是为了获得纯合体这个事实。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种新的番茄纯合体的快速培育方法，能够缩短育种周期，快速获得番茄纯合体。
为实现这样的目的，本发明通过细胞学观察后，选取适宜花药进行培养，获得培养苗，再用SSR(Simple Sequence Repeats，简单序列重复)分子标记验证筛选出纯合体。本发明方法的各个步骤如下：
①细胞学观察
将不同长短的番茄花药用碘-碘化钾染色压片检查花粉发育时期，以确定用于花药培养所需要的适宜花药。
②外植体的制备
于晴天10:00-15:00采集6-8mm长的花蕾，置于4℃预处理2-5天。接种前将花蕾用70％酒精消毒30秒，然后用饱和的漂白粉上清液消毒5-7分钟，然后经无菌水冲洗3-4次。接着，在无菌条件下将花药从花蕾取出，选取2-5mm长的花药(其内的花粉发育时期为单核靠边期)用于花药培养。
③花药培养
将上述花药接种于MS(Murashige and Skoog的基本培养基)，附加KT(激动素)1.0mg/L，NAA(萘乙酸)0.5mg/L，蔗糖4％，琼脂0.7％，pH5.8的培养基进行愈伤组织诱导培养。培养室的条件：25±1℃，光强25μmol.m-2.s-1，10小时光/14小时暗的光周期。
4-8周后，当愈伤组织大小为2-3mm时，将其接种于MS培养基附加BA(苄基腺嘌呤)2.0mg/L，IAA(吲哚乙酸)0.2mg/L，蔗糖2％，琼脂0.7％，pH5.8的培养基中进行分化培养。培养室的条件：25±1℃，光强25μmol.m-2.s-1，14小时光/10小时暗的光周期。
④完整植株的获得
分化培养4周，当愈伤组织分化出小植株时，切取小植株，并将其接入MS+IAA0.2mg/L+蔗糖2％的生根培养基中，进行生根培养。两周左右获得完整植株。
⑤SSR分子标记检测筛选出纯合体。
因为SSR为共显性标记，能够区分纯合体和杂合体。纯合体的带型应该比杂合体(对照)少一条带。杂合体的带型则与对照相同。
本发明与传统育种技术相比，有一定优势：在番茄上常规育种技术从F1代开始到获得纯合体需要2-3年的时间，而本发明仅需要2.5-3个月，大大缩短了育种周期；与传统的核型分析相比，本发明利用SSR分子标记检测纯合体，大大提高了检测效率，且不会丢失自然加倍的纯合二倍体。
具体实施方式
实施例1
于晴天上午10:00，采集鲜丰‘98-7’(Lycopersicon esculentum Mill.)×奇士曼尼番茄(Lycopersicon cheesmanii LA166)的F1代植株上长度为6-8mm的花蕾，并将其置于4℃预处理3天。用碘-碘化钾染色压片确定花粉发育时期。将上述花蕾浸入70％酒精30秒，然后用10％～13％漂白粉饱和溶液表面消毒5-7分钟，再用无菌水冲洗3-4次。在无菌条件下将花药取出，选取2-5mm长的花药(其内的花粉发育时期为单核期)接种于MS+KT1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖4％+琼脂0.7％，pH5.8的培养基进行愈伤组织诱导培养。培养室的条件：25±1℃，光强25μmol.m-2.s-1，10小时光/14小时暗的光周期。
当愈伤组织大小为2-3mm时，将其接种于MS+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖2％+琼脂0.7％，pH5.8的培养基进行分化培养。培养室的条件：25±1℃，光强25μmol.m-2.s-1，14小时光/10小时暗的光周期。
分化培养28天后，愈伤组织分化出小植株时，切取小植株，并将其接入MS+IAA0.2mg/L+蔗糖2％的培养基进行生根培养。培养2周获得完整植株。SSR分子标记检测筛选出纯合体：
基因组DNA(脱氧核糖核酸)提取和纯化，参照方宣钧等的CTAB(溴代十六烷基三甲胺)方法(方宣钧，黄育民，陈启锋，等.若干水稻品种(组合)的等位酶和RAPD遗传分析.中国农业科学.1999，32(2)：1-8)。
SSR反应SSR反应体系为：20～40ng左右模板DNA，MgCl2(氯化镁)2.0mmol·L-1，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)0.2mmol·L-1，引物0.4umol·L-1，Taq聚合酶0.65U，1×Taq Buffer(缓冲液)，总体积15μl。PCR(聚合酶链式反应)反应具体程序为：94℃ 2分钟；94℃ 25秒，50℃ 25秒，68℃ 25秒，35循环；72℃ 8分钟。
PCR产物检测方法一：扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳(6％，8mol·L-1尿素，1×TBE buffer(三氨基甲烷，乙酸，乙二胺四乙酸缓冲液))分离。预电泳30分钟后上样，电泳时使用60W恒功率，电泳1.5～2小时。银染显色：固定液为0.5％的冰醋酸和10％的无水乙醇混合液，固定15分钟左右；水洗；染色液为0.2％的AgNO3(硝酸银)，染色时间为20分钟；水洗，时间不超过10秒；显影液为1.5％NaOH(氢氧化钠)和0.5％甲醛；最后0.75％Na2CO3(碳酸钠)定影。方法二：扩增产物用3％的琼脂糖检测，在紫外透射仪上观察、拍照。
因为SSR为共显性标记，能够区分纯合体和杂合体。纯合体的带型应该比杂合体(对照)少一条带。杂合体的带型则与对照相同。

Claims (1)

1、一种番茄纯合体的快速培育方法，其特征在于包括如下步骤：
1)将不同长短的番茄花药用碘-碘化钾染色压片检查花粉发育时期，以确定用于花药培养所需要的适宜花药；
2)于晴天10:00-15:00采集6-8mm长的花蕾，置于4℃预处理2-5天，接种前将花蕾用70％酒精消毒30秒，再用饱和的漂白粉消毒5-7分钟，然后经无菌水冲洗，在无菌条件下将花药从花蕾取出，选取2-5mm长的花药用于花药培养，花药内的花粉发育时期为单核期；
3)将上述花药接种于MS培养基附加激动素KT1.0mg/L、萘乙酸NAA0.5mg/L、蔗糖4％、琼脂0.7％、pH5.8的培养基进行愈伤组织诱导培养，培养室的条件：25±1℃，光强25μmol.m-2.s-1，10小时光/14小时暗的光周期；4-8周后，当愈伤组织大小为2-3mm时，将其接种于MS培养基附加苄基腺嘌呤BA2.0mg/L、吲哚乙酸IAA0.2mg/L、蔗糖2％、琼脂0.7％、pH5.8的培养基中进行分化培养，培养室的条件：25±1℃，光强25μmol.m-2.s-1，14小时光/10小时暗的光周期；
4)分化培养4周，当愈伤组织分化出小植株时，切取小植株，并将其接入MS+IAA0.2mg/L+蔗糖2％的生根培养基中，进行生根培养，获得完整植株；
5)SSR分子标记检测筛选出纯合体。
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