CN111165350B - 一种高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的选育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的选育方法。该方法包括如下步骤：玉米单倍体诱导系和玉米自交系S23杂交，获得杂交F1代；杂交F1代和玉米单倍体诱导系回交，获得回交后代BC1F1；在回交后代BC1F1中选择“与玉米杂交种杂交后、幼胚显色程度高”、“与玉米杂交种杂交后，单倍体诱导率高和单穗单倍体数高”和“Zmpla1基因和Zmdmp基因均纯合”的玉米单株，连续自交，获得高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系；高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的单倍体诱导率、单穗单倍体数、株高、穗位、雄穗分支数、单穗结实数和单倍体幼胚鉴别准确率均高于玉米单倍体诱导系。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的选育方法
技术领域
本发明属于生物育种领域，具体涉及一种高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的选育方法。
背景技术
玉米单倍体育种技术已广泛应用于玉米商业化育种。其主要包括单倍体的诱导，鉴别和加倍三个方面。单倍体诱导作为单倍体育种技术的重要首要步骤，促使单倍体孤雌生殖诱导系不断发展。现有诱导系均来源于Stock6，其诱导率为3.2％(Coe，1959)，随着人工测验选育与分子标记辅助选择，培育出一大批玉米单倍体高频诱导系，主要包括CAU系列，CHOI系列，UH系列，RWS/K系列，TAIL系列和PHI系列等(Ren et al,2017)，单倍体诱导率提高了10％左右。单倍体诱导率的不断提高，解决了大量产生单倍体的问题。而成功鉴别单倍体才能真正实现单倍体的获得。目前应用最广的单倍体鉴别标记主要包括R1-nj和油分,对单倍体成熟籽粒的鉴别技术已比较完善。近年来，随着玉米单倍体组培鉴别与加倍技术的发展，单倍体幼胚的高效鉴别作为幼胚加倍的首要前提急需解决。单倍体幼胚的鉴别除受外部培养条件和母本材料影响外，其鉴别效率主要受父本诱导系所携带颜色标记的影响。现有诱导系，在选育过程中，仅对杂交成熟籽粒的盾片及糊粉层着色情况进行评价和筛选，并未对授粉后12-20天幼胚时期，单倍体鉴别效率进行评价。因此在直接利用现有诱导系进行单倍体幼胚鉴别时，各诱导系之间差异较大，大大限制了单倍体组培鉴别与加倍的效率。目前并没有关于专门用于单倍体幼胚鉴别的诱导系选育相关报道。选育一种高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系对提高单倍体组培鉴别与加倍效率具有重要意义。
发明内容
本发明的目的为选育可用于高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系。
本发明首先保护一种获得高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的方法，可包括如下步骤：
(1)玉米单倍体诱导系和具有颜色标记的玉米自交系杂交，获得杂交F1代；
(2)杂交F1代和玉米单倍体诱导系回交，获得回交后代BC1F1；
(3)在回交后代BC1F1中选择具有特征Ⅰ和/或具有特征Ⅱ和/或具有特定基因型的玉米单株，连续自交，直至获得稳定遗传的自交后代BC1Fn；
自交后代BC1Fn中，具有特征Ⅰ和/或具有特征Ⅱ和/或具有特定基因型的玉米单株即为高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系；所述高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系具有优良性状；所述优良性状为(a1)—(a7)中的至少一种：
(a1)单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系；
(a2)单穗单倍体数高于玉米单倍体诱导系；
(a3)株高高于玉米单倍体诱导系；
(a4)穗位高于玉米单倍体诱导系；
(a5)雄穗分支数高于玉米单倍体诱导系；
(a6)单穗结实数高于玉米单倍体诱导系；
(a7)单倍体幼胚鉴别准确率高于玉米单倍体诱导系；
所述特征Ⅰ可为与玉米杂交种杂交后，幼胚显色程度高；
所述特征Ⅱ可为与玉米杂交种杂交后，单倍体诱导率高和/或单穗单倍体数高”；
所述特定基因型为“Zmpla1基因和Zmdmp基因均纯合”的基因型。
上述方法中，所述特征Ⅱ中通过双指标选择(即单倍体诱导率高和单穗单倍体数高)，可以保证单倍体产量。
上述方法中，所述特征Ⅰ和/或所述特征Ⅱ可通过颜色标记筛选。通过颜色标记可对幼胚显色程度进行分级评价。颜色标记不局限于在杂交幼胚盾片大量表达的R1-nj标记，同时包括可在胚芽上表达的紫胚芽标记和胚根部位表达的紫根鞘标记。杂交幼胚携带颜色标记而大量合成花青素，单倍体仅含有母本一套染色体组，不显色。
上述任一所述的方法中，所述特征Ⅰ可为与玉米杂交种杂交后，幼胚显色程度可为4级或5级。所述杂交后可为授粉后12-18天(如12-15天、15-18天、12天、15天或18天)。
幼胚显色程度划分级数的原则如下：杂交幼胚连续培养24h后，根据幼胚显色情况分为1-5级，具体分级标准如下：1级，杂交幼胚不显色或显色极弱，无法根据颜色有无鉴别单倍体；2级，大部分杂交幼胚为淡紫色且显色面积较小，单倍体幼胚鉴别较难；3级，杂交幼胚均显色为淡紫色或紫色，可进行单倍体幼胚鉴别；4级，杂交幼胚均显紫色，单倍体幼胚鉴别较容易；5级，杂交幼胚呈紫黑色，单倍体鉴别容易。
上述任一所述的方法中，所述特征Ⅱ可为与玉米杂交种杂交后，将单倍体诱导率和单穗单倍体数分别从大到小排序，单倍体诱导率和/或单穗单倍体数处于前10％。
在本发明的一个实施例中，利用R1-nj标记挑选单倍体(无色为单倍体)。
在本发明的实施例中，上述任一所述玉米杂交种可为郑单958。
所述具有颜色标记的玉米自交系具体可为自交籽粒胚部和/或糊粉层着色明显的玉米自交系。
上文中，先筛选具有特定基因型的玉米单株，再从中筛选具有特征Ⅰ和特征Ⅱ的玉米单株，这样获得玉米单倍体幼胚鉴别效率最为优良的诱导系。
所述步骤(1)中，进行杂交时，玉米单倍体诱导系可作为父本，具有颜色标记的玉米自交系可作为母本。或者，进行杂交时，玉米单倍体诱导系可作为母本，具有颜色标记的玉米自交系可作为父本。
所述步骤(2)中，进行回交时，杂交F1代可作为父本，玉米单倍体诱导系可作为母本。或者，进行回交时，杂交F1代可作为母本，玉米单倍体诱导系可作为父本。
上述方法中，检测Zmpla1基因是否纯合的方法可为：以待测玉米的基因组DNA为模板，采用引物1和引物2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物1；如果PCR扩增产物1中含有大小为204bp的DNA片段且不含有大小为186bp的DNA片段，则待测玉米的Zmpla1基因为纯合；引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。判断PCR扩增产物1中含有的DNA片段的大小可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳银染或测序实现。
检测Zmpla1基因是否纯合的方法中，待测玉米的基因组DNA可为待测玉米胚或叶片的基因组DNA。
上述方法中，检测Zmdmp基因是否纯合的方法可为：以待测玉米的基因组DNA为模板，采用引物3和引物4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2；如果PCR扩增产物2中含有大小为70bp的DNA片段且不含有大小为140bp的DNA片段，则待测玉米的Zmdmp基因纯合；引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。判断PCR扩增产物2中含有的DNA片段的大小可通过琼脂糖凝胶电泳或测序实现。
检测Zmdmp基因是否纯合的方法中，待测玉米的基因组DNA可为待测玉米胚或叶片的基因组DNA。
玉米单倍体诱导性状主要受Zmpla1基因和Zmdmp基因控制，单独Zmpla1基因仅能表现出约2％的单倍体诱导率，Zmdmp基因可显著增强Zmpla1基因的单倍体诱导效应，两者相叠加上可提高2-3倍的单倍体诱导率。上述方法中，可以同时也可以先后检测Zmpla1基因和Zmdmp基因是否纯合，获得Zmpla1基因和Zmdmp基因均纯合的玉米单株。
所述步骤(3)中，连续自交可为自交4代以上(如4代、5代或6代)。
上述方法中，所述“在回交后代BC1F1中选择具有特征Ⅰ和/或具有特征Ⅱ和/或具有特定基因型的玉米单株，连续自交，直至获得稳定遗传的自交后代BC1Fn”具体可为：
①在回交后代BC1F1中选择具有特征Ⅰ和/或具有特状Ⅱ和/或具有特定基因型的玉米单株，自交，获得自交后代BC1F2；
②在自交后代BC1F2中选择具有特征Ⅰ和/或具有特征Ⅱ和/或具有特定基因型的玉米单株，自交，获得自交后代BC1F3；
③在自交后代BC1F3中选择具有特征Ⅰ和/或具有特征Ⅱ和/或具有特定基因型的玉米单株，自交，获得自交后代BC1F4；
④在自交后代BC1F4中选择具有特征Ⅰ和/或具有特征Ⅱ和/或具有特定基因型的玉米单株，自交，获得自交后代BC1F5。
上述任一所述选择具有特征Ⅰ和/或具有特征Ⅱ和/或具有特定基因型的玉米单株具体可为选择“具有特征Ⅰ和/或具有特征Ⅱ和/或具有特定基因型”且不具有不利性状的玉米单株；所述不利性状可为株高偏高、抗病性差、雌雄不协调、不抗倒伏和雄穗小中的至少一种。
上述任一所述玉米单倍体诱导系可为诱导系CAU3或诱导系CAU5。
上述任一所述具有颜色标记的玉米自交系可为玉米自交系S23。
上述任一所述玉米杂交种可为郑单958、迪卡653、京科968、农大372、中农大678或先玉335。
上述任一所单倍体诱导率＝单穗单倍体数/单穗结实数×100％。
上述任一所鉴别准确率＝(拟单倍体幼胚总数-错选单倍体数)/拟单倍体幼胚总数×100％。
上述任一所述方法的应用也属于本发明的保护范围，可为H1)-H3)中的至少一种：
H1)玉米育种；
H2)提高玉米单倍体幼胚组培鉴别；
H2)提高玉米单倍体幼胚加倍效率。
上述应用中，所述玉米育种可为玉米单倍体育种。
上述应用中，所述玉米育种为将上述任一所述的方法选育的可用于高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系作为亲本，与其它玉米品种进行杂交和/或回交，得到具有所述其它玉米品种遗传背景的玉米品系。
采用本发明提供的方法利用CAU3和玉米自交系S23选育出2个可高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系，分别命名为CS1和CS2；采用本发明提供的方法利用CAU5和玉米自交系S23选育出1个可高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系，命名为CS3。实验证明，与CAU3相比，CS1和CS2的株高、穗位均有所提高，雄穗分支数增加了3.4个左右，单穗结实数由49个分别提高到86个和103个，鉴别准确率均有一定程度的提高(准确率提高到90％左右)；与CAU5相比，CS3的散粉时间延迟3天左右，株高和穗位均略有提高，雄穗分支数和单穗结实数均显著提高(增加了3倍左右)，鉴别准确率也有一定程度的提高(准确率提高到90％左右)；CS1、CS2和CS3的诱导率均较高，其中CS2诱导率最高，变异范围在11.54％-15.54％之间。CS1、CS2和CS3比其亲本诱导系相比，单穗单倍体数均提高了2倍左右。本发明提供的高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的选育方法具有育种周期短和单倍体诱导率高的优点。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为诱导系聚合颜色标记鉴别单倍体。
图2为组织培养显色分级。
图3为高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的选育示意图。
图4为实施例1中步骤一玉米诱导率的分布图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
诱导系CAU3(简称CAU3)、诱导系CAU5(简称CAU5)和玉米自交系S23(简称S23)均记载于如下文献中：董昕.玉米单倍体诱导基因qhir1精细定位与新型诱导系选育研究[D].北京，中国农业大学.2014.公众可从中国农业大学处获得。其中，诱导系CAU3和诱导系CAU5均为玉米单倍体诱导系；玉米自交系S23具有优良颜色标记，自交籽粒胚部和糊粉层着色明显。
迪卡653为中种国际种子有限公司的产品。先玉335为山东登海先锋种业有限公司的产品。郑单958为北京德农种业有限公司的产品。京科968是以自选系京724为母本，京92为父本杂交育成的高淀粉玉米品种；公众可从北京市农林科学院处获得。中农大372和中农大678由中国农业大学选育；公众可从中国农业大学处获得。迪卡653、先玉335、郑单958、京科968、中农大372和中农大678均为杂交种，在下述实施例中，均作为测验种评价诱导率和单穗单倍体数。
MS基本培养基：将MS盐3.0g和蔗糖30g溶于适量水，然后用水定容至1L，调节pH值至5.8；然后加入7.5g琼脂，121℃高压灭菌15min。
拿草特平板：将MS盐3.0g和蔗糖30g溶于适量水，然后用水定容至1L，调节pH值至5.8；之后加入7.5g琼脂，121℃高压灭菌15min；待培养基冷却至55℃，加入拿草特并使其在体系中的浓度为2.0μmol/L，混匀，乘热倒入培养皿，自然冷却后即获得拿草特平板。
拿草特为北京博友航生物科技有限公司的产品，产品目录号为23950-58-5。
MS盐为上海宇涵生物科技有限公司的产品，产品目录号为140225。
玉米单倍体诱导性状主要受两大主效基因(分别为Zmpla1基因和Zmdmp基因)控制，单独Zmpla1基因仅能表现出约2％的诱导率，Zmdmp基因可显著增强Zmpla1基因的单倍体诱导效应，两者相叠加上可提高2-3倍的诱导率。下述实施例中，筛选Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株的步骤如下：
1、以待测玉米叶片的基因组DNA为模板，采用5’-CGGTGAAGGCATCAGAAGGG-3’(SEQID NO：1)和5’-GGGAGGACGGCAAGCAAGAG-3’(SEQ ID NO：2)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物1。
2、完成步骤1后，将PCR扩增产物1进行聚丙烯酰胺凝胶电泳银染，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物1在聚丙烯酰胺凝胶上显示约200bp的条带(该条带的理论大小为204bp)且不显示约180bp的条带(该条带的理论大小为186bp)，则待测玉米为Zmpla1纯合的玉米单株。
3、以Zmpla1纯合的玉米单株叶片的基因组DNA为模板，采用5’-CACACGTCAGTGCAGGAAAT-3’(SEQ ID NO：3)和5’-AGTCGTTGCTGCCTCTCAGT-3’(SEQ ID NO：4)组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2。
4、完成步骤3后，将PCR扩增产物2进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果PCR扩增产物2中含有大小为70bp的DNA片段且不含有大小为140bp的DNA片段，则Zmpla1纯合的玉米单株为Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株。
下述实施例中，筛选级数为4级或5级的玉米单株的具体步骤如下：
1、田间种植郑单958(母本)，待母本花丝吐出之前，对其进行去雄、雌穗套袋处理；待Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株(父本)花丝吐出后，剪花丝，授粉；授粉后15天，获得胚长为2.0-4.0mm的杂交果穗。
2、取所述杂交果穗，第二天剥胚，得到玉米幼胚。
3、将步骤2剥离的玉米幼胚置于拿草特平板，培养皿封口，26-28℃光照培养24h。
4、完成步骤3后，计算显色幼胚数并统计幼胚显色率。幼胚显色率＝显色幼胚数/最终显色幼胚数(最终显色幼胚数为持续培养一定时间后，培养皿内显色幼胚数目基本稳定后的显色幼胚数，此处选择26-28℃光照培养72h时的显色幼胚数作为最终显色幼胚数)×100％。
单倍体幼胚颜色标记不局限于在杂交幼胚盾片大量表达的R1-nj标记，同时包括可在胚芽上表达的紫胚芽标记和胚根部位表达的紫根鞘标记，见图1。杂交幼胚携带颜色标记而大量合成花青素，单倍体仅含有母本一套染色体组，不显色。
5、完成步骤4后，根据幼胚显色程度将Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株的级数分为1-5级(见图2)，具体分级标准如下：1级，杂交幼胚不显色或显色极弱，无法根据颜色有无鉴别单倍体；2级，大部分杂交幼胚为淡紫色且显色面积较小，单倍体幼胚鉴别较难；3级，杂交幼胚均显色为淡紫色或紫色，可进行单倍体幼胚鉴别；4级，杂交幼胚均显紫色，单倍体幼胚鉴别较容易；5级，杂交幼胚呈紫黑色，单倍体鉴别容易。
剥胚的具体步骤如下：将干净无虫害的幼穗去除苞叶，摘去花丝，75％酒精短暂消毒后放入超净工作台。置于事先准备好的次氯酸钠溶液(利用灭菌去离子水配制2％次氯酸钠溶液，滴加两滴吐温80)中进行表面消毒20min。期间将玉米搅动2-3次，消毒更彻底。消毒完成后拿出，放置片刻，控水后即可开始剥胚。所剥取的玉米幼胚，具有一片较大的子叶，即盾片，呈弧形隆起；近轴侧，面平，有较小的胚体，由胚芽、胚轴和胚根组成。
单倍体诱导率＝单穗单倍体数/单穗结实数×100％。单倍体诱导率简称诱导率。
鉴别准确率＝(拟单倍体幼胚总数-错选单倍体数)/拟单倍体幼胚总数×100％。
实施例1、一种高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的选育及其应用
一、高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的选育
高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的选育示意图见图3。
1、2015年春，以玉米单倍体诱导系(CAU3或CAU5)为父本，S23为母本，杂交，获得杂交F1。
杂交方法为：田间种植(实验地点为北京)玉米单倍体诱导系(作为父本)及S23(作为母本)，待母本花丝吐出之前，对其进行去雄、雌穗套袋处理；花丝吐出后，剪花丝，授粉。
2、2015年冬，田间种植(实验地点为海南)杂交F1，以玉米单倍体诱导系进行回交，获得BC1F1群体。
3、完成步骤2后，根据田间表现，从BC1F1群体中剔除株高偏高、抗病性差、雌雄不协调、不抗倒伏、雄穗偏小等不利性状的单株，之后从中筛选Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株，再从Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株中筛选级数为4级或5级的玉米单株；之后采用级数为4级或5级的玉米单株诱导郑单958，利用R1-nj标记挑选单倍体(无色为单倍体)，统计诱导率和单穗单倍体数，将诱导率和单穗单倍体数分别从大到小排序，选择诱导率和单穗单倍体数均处于前10％的单株。
4、取步骤3筛选的玉米单株，自交，获得BC1F2群体。
5、完成步骤4后，根据田间表现，从BC1F2群体中剔除株高偏高、抗病性差、雌雄不协调、不抗倒伏、雄穗偏小等不利性状的单株，之后从中筛选Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株，再从Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株中筛选级数为4级或5级的玉米单株；之后采用级数为4级或5级的玉米单株诱导郑单958，利用R1-nj标记挑选单倍体(无色为单倍体)，统计诱导率和单穗单倍体数，将诱导率和单穗单倍体数分别从大到小排序，选择诱导率和单穗单倍体数均处于前10％的单株。
6、取步骤5筛选的玉米单株，自交，获得BC1F3群体。
7、完成步骤6后，根据田间表现，从BC1F3群体中剔除株高偏高、抗病性差、雌雄不协调、不抗倒伏、雄穗偏小等不利性状的单株，之后从中筛选Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株，再从Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株中筛选级数为4级或5级的玉米单株；之后采用级数为4级或5级的玉米单株诱导郑单958，利用R1-nj标记挑选单倍体(无色为单倍体)，统计诱导率和单穗单倍体数，将诱导率和单穗单倍体数分别从大到小排序，选择诱导率和单穗单倍体数均处于前10％的单株。
8、取步骤7筛选的玉米单株，自交，获得BC1F4群体。
9、完成步骤8后，根据田间表现，从BC1F4群体中剔除株高偏高、抗病性差、雌雄不协调、不抗倒伏、雄穗偏小等不利性状的单株，之后从中筛选Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株，再从Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株中筛选级数为4级或5级的玉米单株；之后采用级数为4级或5级的玉米单株诱导郑单958，利用R1-nj标记挑选单倍体(无色为单倍体)，统计诱导率和单穗单倍体数，将诱导率和单穗单倍体数分别从大到小排序，选择诱导率和单穗单倍体数均处于前10％的单株。
10、取步骤9筛选的玉米单株，自交，获得BC1F5群体。
11、完成步骤10后，根据田间表现，从BC1F5群体中剔除株高偏高、抗病性差、雌雄不协调、不抗倒伏、雄穗偏小等不利性状的单株，之后从中筛选Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株，再从Zmpla1和Zmdmp均纯合的玉米单株中筛选级数为4级或5级的玉米单株；之后采用级数为4级或5级的玉米单株诱导郑单958，利用R1-nj标记挑选单倍体(无色为单倍体)，统计诱导率和单穗单倍体数，将诱导率和单穗单倍体数分别从大到小排序，选择诱导率和单穗单倍体数均处于前10％的单株。
步骤5、步骤7、步骤9和步骤11筛选的玉米诱导率分布见图4。
步骤5、步骤7、步骤9和步骤11筛选的玉米诱导率平均值、单穗单倍体数平均值和BC1F1群体—BC1F5群体单株数见表1。结果表明，以CAU3为父本的BC1F2群体的平均诱导率为4.43％，BC1F5群体的平均诱导率为12.07％，同时单穗单倍体数由10.40个提高至17.79个；以CAU5为父本的BC1F2群体的平均诱导率为6.77％，BC1F5群体的平均诱导率为10.28％，同时单穗单倍体数由11.20个提高至14.96个(BC1F5群体受高温影响结实相对差，单穗单倍体数和诱导率比BC1F4群体略有降低，但差异不显著)。整体来看，多代选择后，诱导率和单穗单倍体数都显著提高。
表1
Figure BDA0002415667970000091
注：“-”表示不存在。
经过上述步骤，玉米单倍体诱导系为CAU3时，筛选获得2个高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系，分别命名为CS1和CS2；玉米单倍体诱导系为CAU5时，筛选获得1个高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系，命名为CS3。
二、高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的农艺性状分析
高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系通常作为父本与测验种进行杂交，因此针对父本所要求的性状进行特别关注，主要包括散粉时间、株高、穗位、雄穗分支数和单穗结实数等。
大田条件下，分别统计CAU3、CS1、CS2、CAU5和CS3的散粉时间、株高、穗位、雄穗分支数和单穗结实数。
统计结果见表2。结果表明，与CAU3相比，CS1和CS2的散粉时间差异不显著，株高、穗位均有所提高，雄穗分支数增加了3.4个左右，单穗结实数由49个分别提高到86个和103个；与CAU5相比，CS3的散粉时间延迟3天左右，株高和穗位均略有提高，雄穗分支数和单穗结实数均显著提高，增加了2-3倍。
表2
散粉时间(天) 株高(cm) 穗位(cm) 雄穗分支数 单穗结实数
CAU3 66.40±0.60 174.80±1.43 50.60±1.55 5.80±0.25 49.00±2.34
CS1 67.80±0.37 196.80±6.26 94.40±3.08 9.20±0.80 86.00±8.64
CS2 66.60±0.75 198.00±3.15 82.60±1.21 9.20±0.37 103.00±7.46
CAU5 59.80±0.72 149.00±1.13 32.60±0.82 9.80±0.86 37.20±3.16
CS3 62.00±0.32 162.80±2.24 45.80±2.01 28.20±1.11 110.60±3.44
三、检测单倍体幼胚的鉴别准确率
1、田间种植郑单958(母本)，待母本花丝吐出之前，对其进行去雄、雌穗套袋处理；待CAU3、CS1、CS2、CAU5或CS3花丝吐出后，剪花丝，授粉；授粉后15天，获得胚长为2.0-4.0mm的杂交果穗。
2、取所述杂交果穗，第二天剥胚，得到玉米幼胚。
3、将步骤2剥离的玉米幼胚置于拿草特平板，培养皿封口，26-28℃光照培养24h。
4、完成步骤3后，挑选无色幼胚(即拟单倍体幼胚)诱导成苗，进行单倍体真实性鉴定；计算单倍体幼胚的鉴别准确率。
统计结果见表3。结果表明，与CAU3相比，CS1和CS2的鉴别准确率均有一定程度的提高；与CAU5相比，CS3的鉴别准确率也有一定程度的提高。由此可见，多代筛选后，单倍体幼胚鉴别准确率提高到90％左右，最高可达95.5％。
表3
拟单倍体总数 错选单倍体数 真单倍体数 单倍体鉴别准确率(％)
CAU3 68 7 61 89.71
CS1 96 8 88 91.67
CS2 134 6 128 95.52
CAU5 105 13 92 87.62
CS3 112 12 100 89.29
四、评价高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的诱导性能
为进一步评价CS1、CS2、CS3的诱导性能，采用迪卡653、京科968、农大372、中农大678、先玉335和郑单958分别作为测验种，评价诱导率和单穗单倍体数。具体步骤如下：
1、以高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系(CS1、CS2或CS3)为父本，测验种(迪卡653、京科968、农大372、中农大678、先玉335或郑单958)为母本，杂交，获得杂交F1。以CAU3或CAU5为父本，郑单958为母本，杂交，获得杂交F1。
2、分别取杂交F1的单穗，统计籽粒总数；利用R1-nj标记挑选单倍体(无色为单倍体)，统计诱导率和单穗单倍体数。
结果见表4。结果表明，CS1、CS2和CS3的诱导率均较高，其中CS2诱导率最高，变异范围在11.54％-15.54％之间。关于单穗单倍体数，CS1、CS2和CS3比其亲本诱导系均提高了2倍左右。由此可见，CS1、CS2、CS3普遍适用于不同测验种，可提供较高的单倍体诱导率和单穗单倍体数。
表4
Figure BDA0002415667970000111
Figure BDA0002415667970000121
<110> 中国农业大学
<120> 一种高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的选育方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
cggtgaaggc atcagaaggg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
gggaggacgg caagcaagag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
cacacgtcag tgcaggaaat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
agtcgttgct gcctctcagt 20

Claims (9)

1.一种获得高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系的方法，包括如下步骤：
（1）玉米单倍体诱导系和具有颜色标记的玉米自交系杂交，获得杂交F1代；
（2）杂交F1代和玉米单倍体诱导系回交，获得回交后代BC1F1；
（3）在回交后代BC1F1中选择具有特征Ⅰ、具有特征Ⅱ和具有特定基因型的玉米单株，连续自交，直至获得稳定遗传的自交后代BC1Fn；
自交后代BC1Fn中，具有特征Ⅰ、具有特征Ⅱ和具有特定基因型的玉米单株即为高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系；所述高效鉴别玉米单倍体幼胚的诱导系具有优良性状；所述优良性状为（a1）—（a7）中的至少一种：
（a1）单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系；
（a2）单穗单倍体数高于玉米单倍体诱导系；
（a3）株高高于玉米单倍体诱导系；
（a4）穗位高于玉米单倍体诱导系；
（a5）雄穗分支数高于玉米单倍体诱导系；
（a6）单穗结实数高于玉米单倍体诱导系；
（a7）单倍体幼胚鉴别准确率高于玉米单倍体诱导系；
所述特征Ⅰ为与玉米杂交种杂交后，幼胚显色程度高；所述杂交后为授粉后12-18天；
所述特征Ⅱ为与玉米杂交种杂交后，单倍体诱导率高和单穗单倍体数高；
所述特定基因型为“Zmpla1基因和Zmdmp基因均纯合”的基因型；
所述特征Ⅱ为与玉米杂交种杂交后，将单倍体诱导率和单穗单倍体数分别从大到小排序，单倍体诱导率和单穗单倍体数处于前10%。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述特征Ⅰ或所述特征Ⅱ通过颜色标记筛选。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
检测Zmpla1基因是否纯合的方法为：以待测玉米的基因组DNA为模板，采用引物1和引物2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物1；如果PCR扩增产物1中含有大小为204bp的DNA片段且不含有大小为186bp的DNA片段，则待测玉米的Zmpla1基因为纯合；引物1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；引物2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
检测Zmdmp基因是否纯合的方法为：以待测玉米的基因组DNA为模板，采用引物3和引物4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物2；如果PCR扩增产物2中含有大小为70bp的DNA片段且不含有大小为140bp的DNA片段，则待测玉米的Zmdmp基因纯合；引物3的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；引物4的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：可以同时也可以先后检测Zmpla1基因和Zmdmp基因是否纯合，获得Zmpla1基因和Zmdmp基因均纯合的玉米单株。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，连续自交为自交4代以上。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述“在回交后代BC1F1中选择具有特征Ⅰ、具有特征Ⅱ和具有特定基因型的玉米单株，连续自交，直至获得稳定遗传的自交后代BC1Fn”为：
①在回交后代BC1F1中选择具有特征Ⅰ、具有特状Ⅱ和具有特定基因型的玉米单株，自交，获得自交后代BC1F2；
②在自交后代BC1F2中选择具有特征Ⅰ、具有特征Ⅱ和具有特定基因型的玉米单株，自交，获得自交后代BC1F3；
③在自交后代BC1F3中选择具有特征Ⅰ、具有特征Ⅱ和具有特定基因型的玉米单株，自交，获得自交后代BC1F4；
④在自交后代BC1F4中选择具有特征Ⅰ、具有特征Ⅱ和具有特定基因型的玉米单株，自交，获得自交后代BC1F5。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：选择具有特征Ⅰ、具有特征Ⅱ和具有特定基因型的玉米单株为选择“具有特征Ⅰ、具有特征Ⅱ和具有特定基因型”且不具有不利性状的玉米单株；所述不利性状为株高偏高、抗病性差、雌雄不协调、不抗倒伏和雄穗小中的至少一种。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述玉米单倍体诱导系为诱导系CAU3或诱导系CAU5；
所述具有颜色标记的玉米自交系为玉米自交系S23；
所述玉米杂交种为郑单958、迪卡653、京科968、农大372、中农大678或先玉335。
9.权利要求1至8任一所述的方法的应用，为H1）-H3）中的至少一种：
H1）玉米单倍体育种；
H2）提高玉米单倍体幼胚组培鉴别；
H2）提高玉米单倍体幼胚加倍效率。
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