CN111893203A - 一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物 - Google Patents

一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物，属于分子生物育种技术领域。本发明公开的一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物，所用分子标记检测试验过程简便，荧光数据获取准确且环保，经过与类似方法获得的结果进行比较，本发明对目标基因型识别准确、高效且成本更低，在选育诱导系的实践中，更为直观准确，试验任务量更小，育种效率更高。

Description

一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及 其引物
技术领域
本发明涉及分子生物育种技术领域，更具体的说是涉及一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物。
背景技术
玉米双单倍体育种(DH，Doubled Haploid Breeding)技术是传统育种技术的革命，已与分子育种技术、转基因技术构成了现代玉米育种技术的新体系。近年来，玉米单倍体育种技术在常规玉米中的应用较为成熟，单倍体诱导系的诱导机理被解析。2017年国内外研究人员(kelliher,et al.,2017；Liu,et al.,2017)先后报道了诱导基因GRMZM2G471240的相关内容，Liu等将其命名为PLA1，该基因上4个碱基插入所导致的基因功能缺失是单倍体诱导能力产生的关键；2019年位于第8染色体的单倍体高频诱导基因ZmDMP被发现和报道，该基因编码DUF679结构域膜蛋白，是单倍体诱导的关键贡献基因，ZmDMP起始密码子下游的第131bp上T到C的单碱基替换导致氨基酸的错义突变，进而将单倍体诱导率提高2～3倍，两个关键基因的发现为单倍体育种基础及应用研究奠定了理论基础，为利用分子标记辅助选择选育新诱导系提供高效的前景选择位点。
目前选育高频单倍体诱导系的方法一般是依靠逐代诱导杂交授粉,并通过子代的籽粒颜色标记和油份含量鉴别来确定父本诱导率，工作量大，实验数据易受母本材料基因型、玉米生长环境以及人为因素影响，导致选择不准确且效率低。
因此，提供一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物，所述引物序列包括针对ZmPLA1基因变异位点或者ZmDMP基因变异位点设计的引物；
所述针对ZmPLA1基因变异位点设计的引物序列如下：
单倍型引物PLA-2Fg：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCAACGTGGAGACAGGGAGG-3’；SEQID NO.1；
单倍型引物PLA-2Fc：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAACGTGGAGACAGGGACC-3’；SEQID NO.2；
共用引物PLA-2R：5’-TTGCTTCCTTCGCCAGTCAC-3’；SEQ ID NO.3；
所述针对ZmDMP基因变异位点设计的引物序列如下：
所述引物PLA-2Fg、PLA-2Fc的5’端标记荧光分子，且PLA-2Fg与PLA-2Fc标记的荧光分子不同；
单倍型引物DMP-A：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACGCTCTCCAAGACGTCCAT-3’；SEQID NO.4；
单倍型引物DMP-B：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACGCTCTCCAAGACGTCCAC-3’；SEQID NO.5；
共用引物DMP-C：5’-CCGTGGGGAGGAAGTTGG-3’；SEQ ID NO.6；
所述引物DMP-A、DMP-B的5’端标记荧光分子，且DMP-A与DMP-B标记的荧光分子不同。
进一步，所述荧光分子为FAM、HEX、ROX。
进一步，一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的检测方法，具体步骤如下：
(1)碱煮法提取玉米叶片基因组DNA；
(2)将权利要求1所述的单倍型引物PLA-2Fg、PLA-2Fc，共用引物PLA-2R同时参与PCR反应；或者将所述的单倍型引物DMP-A、DMP-B，共用引物DMP-C同时参与PCR反应；
(3)使用酶标仪对PCR产物在包含荧光信号下进行检测，根据荧光强度信号分析基因型。
进一步，步骤(1)所述碱煮法提取玉米叶片基因组DNA的具体步骤如下：
①取1cm2叶片，加100μl的0.3M氢氧化钠研磨；
②3000rpm离心1min，然后沸水浴1min，加入200μl 0.2M pH7.0的Tris-HCl中和降低pH；
③沸水浴1min，3000rpm离心1min，将上清液稀释10-30倍，用于PARMS试剂检测。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物，本发明所用分子标记检测试验过程简便，荧光数据获取准确且环保，经过与类似方法获得的结果进行比较，本发明对目标基因型识别准确、高效且成本更低，在选育诱导系的实践中，更为直观准确，试验任务量更小，育种效率更高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明鉴定ZmPLA1基因的CGAG插入和无插入基因型的扩增示意图；
图2附图为本发明鉴定ZmDMP基因的等位基因型T和C的扩增示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
通过五引物扩增受阻突变体系(PARMS)技术，对ZmPLA1基因(GRMZM2G471240)和ZmDMP基因(GRMZM2G465053)变异位点进行引物设计，设计结果见表1和表2。
表1 ZmPLA1基因PARMS引物序列
Figure BDA0002603699630000041
2条根据ZmPLA1基因目标基因型(CGAG插入和无插入)设计的引物及共用引物同时加入到PCR反应体系进行扩增，ZmPLAd的CGAG无插入基因型可以根据SNP差异与单倍型引物PLA-2Fg匹配而扩增获得FAM荧光信号值；CGAG插入基因型可以根据SNP差异与单倍型引物PLA-2Fc匹配而扩增获得FAM荧光信号值；PLA-2R为共用引物；杂合位点则兼具FAM和HEX信号。
鉴定ZmPLA1基因的CGAG插入和无插入基因型的扩增示意图，见图1。其中，绿色荧光点代表HEX信号，蓝色荧光点代表FAM信号。
表2 ZmDMP基因PARMS引物序列
Figure BDA0002603699630000042
2条根据ZmDMP基因目标基因型(C/T)设计的引物及共用引物同时加入到PCR反应体系进行扩增，ZmDMP基因的T基因型可以根据SNP差异与单倍型引物DMP-A匹配而扩增获得FAM荧光信号值；ZmDMP基因的C基因型可以根据SNP差异与单倍型引物DMP-B匹配而扩增获得FAM荧光信号值；DMP-C为共用引物；杂合位点则兼具FAM和HEX信号。
鉴定ZmDMP基因的等位基因型T和C的扩增示意图，见图2。其中，绿色荧光点代表HEX信号，红色荧光点代表杂合信号，蓝色荧光点代表FAM信号。
实施例2
利用上述荧光分子标记及其引物辅助选育玉米单倍体诱导系的方法，具体步骤如下：
(1)通过碱煮法快速低成本提取玉米叶片基因组DNA，具体步骤为：
①取1cm2叶片，加100μl的0.3M氢氧化钠研磨；②3000rpm离心1min，然后沸水浴1min，加入200μl 0.2M的Tris-HCl(pH7.0)中和降低pH；③沸水浴1min，3000rpm离心1min，将上清液稀释10-30倍，并用于PARMS试剂检测。
(2)将ZmPLA基因单倍型引物PLA-2Fg、PLA-2Fc和共用引物PLA-2R，或者ZmDMP基因单倍型引物DMP-A、DMP-B和共用引物DMP-C同时参与PCR反应，反应体系为：
成分 加入量(10μl) 终浓度
2x PARMS master mix 5μl 1x
PLA-2Fg/DMP-A 0.15μl 150nM
PLA-2Fc/DMP-B 0.15μl 150nM
PLA-2R/DMP-C 0.4μl 400nM
DNA template 1μl(10-100ng) 10-100nM
ddH<sub>2</sub>O 补至10μl
反应程序如下：
Figure BDA0002603699630000051
(3)使用酶标仪对PCR产物在包含2种荧光信号下(FAM、HEX)进行检测，根据荧光强度信号分析基因型，FAM信号代表ZmPLA1基因的无插入和ZmDMP基因的T基因型，HEX代表ZmPLA1基因的CGAG插入和ZmDMP基因的C基因型，同时出现则代表杂合基因型。
实施例3准确度验证
提取纯合诱导系及诱导系选育基础材料DNA，分别采用本发明的2套PARMS引物进行PCR反应，分析基因型，结果见表3。
表3
Figure BDA0002603699630000061
Figure BDA0002603699630000071
注：吉诱101，CAU5，W7-4，WY7为纯合诱导系；JNX6和JNX22为糯玉米品种吉农糯7号亲本。
表3结果表明，吉诱101等高频诱导系具有ZmPLA1基因的CGAG插入和ZmDMP基因的C基因型，育种中间材料分别具备ZmDMP基因的C或T或C/T杂合基因型以及ZmPLA1基因的CGAG插入及无插入基因型，试验结果符合预期，证明了本发明的准确性及育种实用性。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 吉林省农业科学院
<120> 一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gaaggtgacc aagttcatgc ttcaacgtgg agacagggag g 41
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
gaaggtcgga gtcaacggat ttcaacgtgg agacagggac c 41
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ttgcttcctt cgccagtcac 20
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gaaggtgacc aagttcatgc tacgctctcc aagacgtcca t 41
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
gaaggtcgga gtcaacggat tacgctctcc aagacgtcca c 41
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ccgtggggag gaagttgg 18

Claims (4)

1.一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物，其特征在于，所述引物序列包括针对ZmPLA1基因变异位点或者ZmDMP基因变异位点设计的引物；
所述针对ZmPLA1基因变异位点设计的引物序列如下：
单倍型引物PLA-2Fg：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCAACGTGGAGACAGGGAGG-3’；SEQ IDNO.1；
单倍型引物PLA-2Fc：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTCAACGTGGAGACAGGGACC-3’；SEQ IDNO.2；
共用引物PLA-2R：5’-TTGCTTCCTTCGCCAGTCAC-3’；SEQ ID NO.3；
所述针对ZmDMP基因变异位点设计的引物序列如下：
所述引物PLA-2Fg、PLA-2Fc的5’端标记荧光分子，且PLA-2Fg与PLA-2Fc标记的荧光分子不同；
单倍型引物DMP-A：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACGCTCTCCAAGACGTCCAT-3’；SEQ IDNO.4；
单倍型引物DMP-B：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACGCTCTCCAAGACGTCCAC-3’；SEQ IDNO.5；
共用引物DMP-C：5’-CCGTGGGGAGGAAGTTGG-3’；SEQ ID NO.6；
所述引物DMP-A、DMP-B的5’端标记荧光分子，且DMP-A与DMP-B标记的荧光分子不同。
2.根据权利要求1所述的一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的荧光分子标记及其引物，其特征在于，所述荧光分子为FAM、HEX、ROX。
3.一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)碱煮法提取玉米叶片基因组DNA；
(2)将权利要求1所述的单倍型引物PLA-2Fg、PLA-2Fc，共用引物PLA-2R同时参与PCR反应；或者将所述的单倍型引物DMP-A、DMP-B，共用引物DMP-C同时参与PCR反应；
(3)使用酶标仪对PCR产物在包含荧光信号下进行检测，根据荧光强度信号分析基因型。
4.根据权利要求3所述的一种用于分子辅助选育玉米单倍体诱导系的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述碱煮法提取玉米叶片基因组DNA的具体步骤如下：
①取1cm2叶片，加100μl的0.3M氢氧化钠研磨；
②3000rpm离心1min，然后沸水浴1min，加入200μl 0.2M pH7.0的Tris-HCl中和降低pH；
③沸水浴1min，3000rpm离心1min，将上清液稀释10-30倍，用于PARMS试剂检测。
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