CN108522275B - 一种番茄抗病纯合体的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种番茄抗病纯合体的培育方法，该方法包括组织培养鉴定步骤和抗病筛选步骤，组织培养是在常规培养基配方上利用以海藻糖代替蔗糖并添加黑果枸杞汁过滤液营养成分配制出来特定的培养基配方对番茄进行外植体的制备、花药的愈伤组织诱导培养、愈伤组织培养、完整植株的获得、秋水仙素处理及倍性鉴定，得到纯合体幼苗；并结合分子标记技术进行抗病分子标记筛选，得到抗病纯合体植株。本发明方法能够显著缩短筛选周期，快速获得番茄抗病纯合体；并且此方法操作简单，成本低，花培苗移栽后成活率高，抗逆性强，易于推广，可以直接应用于生产，有较好的经济效益和社会效益。

Description

一种番茄抗病纯合体的培育方法

技术领域

本发明涉及农作物育种技术领域，尤其涉及一种番茄抗病纯合体的培育方法。

背景技术

番茄是茄科番茄属一年生或多年生植物，它是世界上最重要的蔬菜作物之一。长期以来，各种番茄病害一直是生产上的巨大威胁，特别是从六十年代起，随着番茄在全国各地的广泛种植，各种病害迅速传播，逐年加重。抗病品种培育是最有效、具有显著经济、生态效益的防治途径。

传统育种中，兼抗多种病害的高代纯和自交系亲本材料的获得，主要利用自交、杂交和回交技术，通常3～5年才能完成，育种周期长，育种成功率低，因此，迫切需要建立一整套高效的育种体系，提高育种效率，切实为生产服务。

发明内容

本发明的发明原理：主要利用花药单倍体培养技术，结合分子标记辅助育种技术，1～2年内可快速获得遗传稳定，兼抗多种病害的番茄抗病纯合体材料，为品种培育奠定材料基础。分子标记筛选可包括番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)、番茄颈腐根腐病(Fusarium crown and root rot，FCRR)和番茄斑萎病毒(Tomato spottedwilt virus，TSWV)等多种病害。本发明在花药单倍体培养的过程中，用对培养物中生命活性物质具有非特异性保护作用的海藻糖取代了传统培养基中所用的蔗糖，加入黑果枸杞汁过滤液，能够显著提高花培单倍体的成功率。

本发明所要解决的技术问题是：提供一种番茄抗病纯合体的培育方法，克服了传统方法获得番茄抗病纯合体周期长的缺点，显著缩短筛选周期，快速获得番茄抗病纯合体；并且此方法操作简单，成本低，易于推广，花培苗移栽后成活率高，抗逆性强，可以直接应用于生产。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种番茄抗病纯合体的培育方法，包括组织培养鉴定步骤和抗病筛选步骤，所述的组织培养鉴定步骤如下：

a.选取花蕾：取不同长度番茄花蕾的花药用碘-碘化钾染色压片检查花粉发育时期，以确定花粉发育时期与花蕾长度的关系，用于选取花药培养所需要的适宜花蕾。

b.外植体的制备：将于晴天的采集6～8mm长的通过步骤a选取的花蕾，置于4℃预处理2～5天；接种前将花蕾用75％酒精消毒30秒，然后用浓度为0.1％的升汞消毒8～10分钟，然后经无菌水冲洗3～4次；在无菌条件下将花药从花蕾中取出，选取2～5mm长的花药(其内的花粉发育时期为单核靠边期)用于花药培养；

c.花药的愈伤组织诱导培养：将花药接种于愈伤组织诱导培养基进行培养，愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基、KT(激动素)0.2～0.8mg/L、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)0.5～1.5mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20～40g/L和琼脂8g/L，pH值5.8；

d.愈伤组织培养：步骤c中愈伤组织诱导培养4～8周后，当愈伤组织大小为2～3mm时，将其接种于愈伤组织培养基进行分化培养；愈伤组织培养基为MS基本培养基、6-BA(6-苄基腺嘌呤)1～3mg/L、IAA(吲哚乙酸)0.1～0.5mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20～40g/L和琼脂8g/L，pH值为5.8；

e.完整植株的获得：分化培养4周，当愈伤组织分化出的芽长至2～3cm时，切取分化芽，并将其接入1/2MS、IBA(吲哚丁酸)0.2mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20～40g/L和琼脂8g/L，pH值5.8的生根培养基中，进行生根培养；培养条件：相对湿度80％，24～26℃，光强1000～2000勒克斯，每日光照10～14小时，两周左右获得完整植株；

f.秋水仙素处理及倍性鉴定：在无菌条件下，用浓度为0.1～0.5％的秋水仙素溶液处理步骤e得到的植株生长点，20天后取新生叶片利用流式细胞仪进行倍性鉴定，剔除多倍体及单倍体植株；

所述的抗病筛选步骤为利用分子标记检测花培苗，快速筛选出能够抗TYLCV、FCRR和TSWV的抗病纯合体植株，其方法如下：

根据改良的CTAB法提取番茄全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，其中分子标记检测条件见表1，引物序列如下：

TY-1(TYLCV)上游引物：CAACAGCAATGTACCTGGTCAG

TY-1(TYLCV)下游引物：CTGTGGCATACGTTGGTGACAC

FRL(FCRR)上游引物：ATGGGCGCTGCATGTTTCGTG

FRL(FCRR)下游引物：ACACCTTTGTTGAAAGCCATCCC(ApoⅠ，50℃酶切1h)

SW5-2(TSWV)上游引物：AATTAGGTTCTTGAAGCCCATCT

SW5-2(TSWV)下游引物：TTCCGCATCAGCCAATAGTGT

其中，PCR扩增设置条件、电泳检测条件等见表1：

表1分子标记检测条件

上述标记均为共显性标记，通过以上引物对相应的抗性基因进行PCR检测，能够区分抗病单株和感病单株。分子标记检测结果分析如下：Ty-1标记，若检测出750bp抗性条带，则该单株抗黄化曲叶病毒；若检测出630bp感病条带，则该单株易感黄化曲叶病毒。FRL标记，若检测出731bp抗性条带，则证明该单株抗番茄茎腐根腐病；若检测出536bp感病条带，则该单株易感番茄茎腐根腐病。SW5-2标记，若检测结果含有574bp抗性条带，则该单株显著抗斑萎病毒；若检测结果不含有574bp抗性条带，含有510bp抗性，则该单株对班委病毒有一定抗性，但抗性略差；若检测出464bp感病条带，则该单株易感斑萎病毒。

优选的，所述的步骤c和步骤d中的MS基本培养基成分为：大量元素：硝酸钾1900mg/L，硝酸铵1650mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸镁370mg/L，氯化钙440mg/L；微量元素：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L；铁盐：乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L；有机成分为：肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。

优选的，所述的步骤e中1/2MS基本培养基成份为：硝酸钾950mg/L，硝酸铵825mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，硫酸镁185mg/L，氯化钙220mg/L；微量元素为：碘化钾0.83mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L；铁盐为：乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，硫酸亚铁27.8mg/L；有机成分为：肌醇100mg/L，甘氨酸2.0mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L。

优选的，所述的黑果枸杞汁过滤液为新鲜采摘的完全成熟的黑果枸杞，或采摘后晾干的干黑果枸杞经过蒸馏水常温浸泡24～48小时得到的黑果枸杞，经过果蔬榨汁机榨汁得到汁液，再经过三层纱布过滤后得到的黑果枸杞汁过滤液。

优选的，所述的步骤c、步骤d和步骤e中的培养基为：愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基、KT 0.5mg/L、2,4-D 1mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值5.8；愈伤组织培养基为MS基本培养基、6-BA 2mg/L、IAA 0.3mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值为5.8；生根培养基为1/2MS、IBA 0.2mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值5.8。

优选的，所述的步骤c、步骤d和步骤e的培养条件为：相对湿度80％，温度24～26℃，光照强度为1000～2000勒克斯，每日光照10～14小时。

优选的，所述的步骤c、步骤d和步骤e中pH值用1％的NaOH或HCl来调节。

优选的，所述的步骤c、步骤d和步骤e中培养基的灭菌的条件是121℃，20分钟。

优选的，上述的步骤b中用75％酒精消毒及其之后的操作均在无菌条件下进行。

优选的，上述的步骤c至步骤f中的操作均在无菌条件下进行。

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、提高花药培养抗逆性：本发明培养基中用海藻糖取代了传统培养基中的蔗糖，在为植物提供碳源和能源，调节渗透压的基础上，可以在花培苗体内细胞表面形成独特的保护膜，对其体内多种生物活性物质起到非特异性保护作用，显著提高花培苗抗逆性，一定程度上抵御培养过程中不利因素(包括不利渗透压、弱光、高湿等)对花培苗的伤害。而蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。

2、提高了花药培养诱导率：培养基中加入了黑果枸杞汁过滤液，而黑果枸杞中氨基酸种类、矿质元素、花青素等相对较丰富：亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸等含量相对较高；果实所含的微量元素也很丰富，除常量元素Na、K、Mg、Ca、Fe之外，还含有一定量的微量元素Mn、Sr、Se、Zn、Cr、Cu等，由于微量元素对多种酶的活性和核酸、蛋白质的合成，对细胞增殖等具有直接或间接地作用；另外花青素具有深入细胞保护细胞膜不被自由基氧化的作用，具有强力抗氧化功能，促进了愈伤组织的形成，不定芽的分化。

3、显著提高花培苗炼苗成活率：花培苗(虽然具有一定的光合能力，但长期处于高湿、弱光、低CO₂、恒温的异养条件下生长，其组织分化不完善，叶表保护组织不发达，气孔多而且不易关闭、叶绿素少，根毛少，光合自养能力弱，适应性差。本发明培养的花培苗体内含有较高水平的海藻糖，抗逆性高，在炼苗过程中，能够有效保护花培苗细胞活性，促进花培苗组织发育，显著提高对外界环境变化的适应性，提高成活率。

4、传统育种中，兼抗多种病害的高代纯和自交系亲本材料的获得，主要利用自交、杂交和回交技术，通常3～5年才能完成。本发明主要利用花药单倍体培养技术，结合分子标记辅助育种技术，1～2年内可快速获得遗传稳定，兼抗多种病害的番茄抗病纯合体材料，显著缩短了育种周期，节省了人力物力，降低育种成本。

5、与传统的倍型分析相比，本发明在单倍体培养过程中结合使用分子标记技术，最终筛选出兼抗TYLCV、FCRR和TSWV三种病害的植株，筛选准确度高，检测效率高，成本低，能够快速获得番茄抗病纯合体。

6、操作简单、成本低。本发明培养基制作方便，成本低，极大地节省了生产成本。

总之，本发明方法能够显著缩短筛选周期，快速获得番茄抗病纯合体；并且此方法操作简单，成本低，花培苗移栽后成活率高，抗逆性强，易于推广，可以直接应用于生产，有较好的经济效益和社会效益。

具体实施方式

实施例1：

取番茄花药作为外植体，设6种不同培养基处理，各3次重复，具体技术方案如下：

处理1：按本发明的方法进行番茄花药单倍体培养。

于晴天从寿光蔬菜集团育种基地大棚内抗病的番茄突变植株上采集6～8mm长的预先通过压片检查后选取的花蕾，置于4℃预处理4天。接种前将花蕾用75％酒精消毒30秒，然后用浓度为0.1％的升汞消毒10分钟，然后经无菌水冲洗4次。在无菌条件下将花药从花蕾中取出，选取2～5mm长的花药(其内的花粉发育时期为单核靠边期)用于花药培养。将花药接种于MS基本培养基，附加KT 0.5mg/L，2,4-D 1mg/L，海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值5.8的培养基进行愈伤组织诱导培养。培养条件：相对湿度80％，24～26℃，光强1500勒克斯，每日光照14小时。

当愈伤组织大小为2～3mm时，将其接种于MS基本培养基附加6-BA 2mg/L，IAA0.3mg/L，海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值5.8的培养基中进行分化培养。培养条件：相对湿度80％，24～26℃，光强1000～2000勒克斯，每日光照14小时。

分化培养4周，当愈伤组织分化出的芽长至2～3cm时，切取分化芽，并将其接入1/2MS、IBA0.2mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值5.8的生根培养基中，进行生根培养。培养条件：温度24～26℃，相对湿度80％，光照强度1500勒克斯，每日光照16小时。两周左右获得完整植株。

在无菌条件下，用浓度为0.1～0.5％的秋水仙素溶液处理植株生长点，20天后取新生叶片利用流式细胞仪进行鉴定提出多倍体及单倍体植株。

将经过流式细胞仪鉴定后挑选出来的花培苗，再利用分子标记检测，快速筛选出能够抗TYLCV、FCRR和TSWV的抗病纯合体植株。

根据改良的CTAB法提取番茄全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，其中分子标记检测条件见表1，引物序列如下：

TY-1上游引物：CAACAGCAATGTACCTGGTCAG

TY-1下游引物：CTGTGGCATACGTTGGTGACAC

FRL上游引物：ATGGGCGCTGCATGTTTCGTG

FRL下游引物：ACACCTTTGTTGAAAGCCATCCC(ApoⅠ，50℃酶切1h)

SW5-2上游引物：AATTAGGTTCTTGAAGCCCATCT

SW5-2下游引物：TTCCGCATCAGCCAATAGTGT

利用以上引物对挑选出来的花培苗组织DNA进行PCR扩增，通过扩增结果筛选抗病纯合体。

处理2：将上述处理1提到的诱导培养基、分化培养基和生根培养基中海藻糖30g/L更换为蔗糖30g/L，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。

处理3：将上述处理1提到的诱导培养基、分化培养基和生根培养基中不添加黑果枸杞汁过滤液，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。

处理4：将上述处理1提到的诱导培养基、分化培养基和生根培养基中黑果枸杞汁过滤液20g/L调整为黑果枸杞汁过滤液40g/L，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。

处理5：将上述处理1提到的诱导培养基、分化培养基和生根培养基中海藻糖30g/L更换为蔗糖30g/L，不添加黑果枸杞汁过滤液，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。

处理6：将上述处理1提到的诱导培养基、分化培养基和生根培养基中海藻糖30g/L更换为蔗糖30g/L，黑果枸杞汁过滤液20g/L更换为黑果枸杞汁过滤液40g/L，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。

以上6种处理的培养基主要成份及区别见表2：

表2 6种处理的培养基主要成份及区别

处理	基本培养基	糖	添加物
				处理1	Ms	海藻糖30g/L	黑果枸杞汁过滤液20g/L
处理2	Ms	蔗糖30g/L	黑果枸杞汁过滤液20g/L
				处理3	Ms	海藻糖30g/L	不添加
处理4	Ms	海藻糖30g/L	黑果枸杞汁过滤液40g/L
				处理5	Ms	蔗糖30g/L	不添加
处理6	Ms	蔗糖30g/L	黑果枸杞汁过滤液40g/L

以上6种处理的结果见表3：

表3不同培养基对花培苗的影响

注：培养45天时，调查愈伤组织诱导率，愈伤组织诱导率＝(诱导愈伤组织外植体个数/接种外植体数)×100％；培养70天时，调查不定芽分化率，愈伤组织不定芽分化率＝(具有不定芽分化的愈伤组织块数/继代愈伤组织块数)×100％；将分化出芽的材料转移到生根培养基上诱导生根，培养20天时，测量花培苗株高株茎，目测观察根的生长情况，生根率＝(具有根系的花培苗/诱导生根花培苗总数)×100％；平均根数＝诱导生根花培苗出根总数/诱导生根花培苗个数；移栽后30天统计炼苗成活率，炼苗成活率＝(炼苗后成活的花培苗数目/炼苗花培苗总数)×100％。

试验结果表明：本发明能够提高番茄花培苗的抗逆性，显著促进花培苗分化生长，显著提高番茄花药愈伤组织诱导率、不定芽分化率、平均株高和平均株茎；而且花培苗炼苗成活率也显著提高。本发明在单倍体培养过程中结合使用分子标记技术，最终筛选出兼抗TYLCV、FCRR和TSWV三种病害的植株，筛选准确度高，检测效率高，成本低，能够快速获得番茄抗病纯合体。

实施例2

实际应用：按本发明的方法进行番茄花药单倍体培养。

于晴天从寿光蔬菜集团育种基地大棚内抗病的番茄突变植株上采集6～8mm长的花蕾，置于4℃预处理4天。接种前将花蕾用75％酒精消毒30秒，然后用浓度为0.1％的升汞消毒10分钟，然后经无菌水冲洗4次。在无菌条件下将花药从花蕾中取出，选取2～5mm长的花药(其内的花粉发育时期为单核靠边期)用于花药培养。将花药接种于MS基本培养基、KT0.5mg/L，2,4-D 1mg/L，海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值5.8的培养基进行愈伤组织诱导培养。培养条件：相对湿度80％，24～26℃，光强1000～2000勒克斯，每日光照14小时。

当愈伤组织大小为2～3mm时，将其接种于MS基本培养基、6-BA 2mg/L，IAA 0.3mg/L，海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值5.8的培养基中进行分化培养。培养条件：相对湿度80％，24～26℃，光强1500勒克斯，每日光照14小时。

分化培养4周，当愈伤组织分化出的芽长至2～3cm时，切取分化芽，并将其接入1/2MS、IBA 0.2mg/L、海藻糖30g/L和黑果枸杞汁过滤液20g/L的生根培养基中，进行生根培养。两周左右获得完整植株。

在无菌条件下，用浓度为0.1～0.5％的秋水仙素溶液处理植株生长点，20天后取新生叶片利用流式细胞仪进行鉴定提出多倍体及单倍体植株。

利用分子标记检测花培苗，快速筛选出能够抗TYLCV、FCRR和TSWV的抗病纯合体植株。

根据改良的CTAB法提取番茄全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，其中分子标记检测条件见表4，引物序列如下：

TY-1上游引物：CAACAGCAATGTACCTGGTCAG

TY-1下游引物：CTGTGGCATACGTTGGTGACAC

FRL上游引物：ATGGGCGCTGCATGTTTCGTG

FRL下游引物：ACACCTTTGTTGAAAGCCATCCC(ApoⅠ，50℃酶切1h)

SW5-2上游引物：AATTAGGTTCTTGAAGCCCATCT

SW5-2下游引物：TTCCGCATCAGCCAATAGTGT

实际应用中采集的各数据见表4：

表4数据调查记录表

注：愈伤组织诱导率、不定芽分化率、株高、株茎、生根率、平均根数和炼苗成活率统计方式参照实施例1。

实验结果表明：本发明能够提高番茄花培苗的抗逆性，显著促进花培苗分化生长，显著提高番茄花药愈伤组织诱导率、不定芽分化率、平均株高和平均株茎，而且花培苗炼苗成活率也显著提高；本发明在单倍体培养过程中结合使用分子标记技术，最终筛选出兼抗TYLCV、FCRR和TSWV三种病害的植株，筛选准确度高，检测效率高，成本低，能够快速获得番茄抗病纯合体。本发明能够广泛的运用于生产。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (5)

1.一种番茄抗病纯合体的培育方法，其特征在于，包括组织培养鉴定步骤和抗病筛选步骤，所述组织培养鉴定步骤如下：

a.选取花蕾

取番茄花药用压片检查花粉发育情况，选取培养所需要花蕾；

b.外植体的制备

将通过步骤a选取的花蕾，置于4℃预处理2～5天，消毒后，选取2～5mm长的花药培养，此时花粉发育时期为单核靠边期；

c.花药的愈伤组织诱导培养

将花药接种于愈伤组织诱导培养基进行培养，其中，愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基、KT0.2～0.8mg/L、2,4-D 0.5～1.5mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值5.8；

d.愈伤组织培养

步骤c中愈伤组织诱导培养4～8周后，接种于愈伤组织培养基进行分化培养；其中，愈伤组织培养基为MS培养基、6-BA 1.0～3.0mg/L、IAA 0.1～0.5mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20～40g/L和琼脂8g/L，pH值为5.8；

e.完整植株的获得

分化培养后，切取分化芽，并将其接入1/2MS、IBA0.2mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值5.8的生根培养基中，进行生根培养，获得完整植株；

f.秋水仙素处理及倍性鉴定

用秋水仙素溶液处理步骤e得到的植株生长点，20天后进行倍性鉴定，剔除多倍体及单倍体植株；

所述抗病筛选步骤为利用分子标记检测花培苗，提取番茄全基因组DNA，利用现有引物序列进行PCR扩增，通过扩增结果筛选出抗病纯合体植株，其引物序列如下：

TY-1上游引物：CAACAGCAATGTACCTGGTCAG

TY-1下游引物：CTGTGGCATACGTTGGTGACAC

FRL上游引物：ATGGGCGCTGCATGTTTCGTG

FRL下游引物：ACACCTTTGTTGAAAGCCATCCC

SW-5上游引物：AATTAGGTTCTTGAAGCCCATCT

SW-5下游引物：TTCCGCATCAGCCAATAGTGT；

所述黑果枸杞汁过滤液为新鲜采摘的完全成熟的黑果枸杞，或采摘后晾干的干黑果枸杞经过蒸馏水常温浸泡24～48小时得到的黑果枸杞，经过果蔬榨汁机榨汁得到汁液，再经过三层纱布过滤后得到的黑果枸杞汁过滤液；

所述步骤f中秋水仙素处理及倍性鉴定为：用浓度为0.1～0.5％的秋水仙素溶液处理步骤e得到的植株生长点，20天后取新生叶片利用流式细胞仪进行倍性鉴定，剔除多倍体及单倍体植株。

2.如权利要求1所述的番茄抗病纯合体的培育方法，其特征在于，所述步骤a中的压片检查为碘-碘化钾染色压片检查。

3.如权利要求1所述的番茄抗病纯合体的培育方法，其特征在于，所述步骤b中的消毒为将花蕾用75％酒精消毒30秒，然后用0.1％的升汞消毒8～10分钟，然后经无菌水冲洗3～4次；在无菌条件下将花药从花蕾中取出，选取2～5mm长的花药用于花药培养。

4.如权利要求1所述的番茄抗病纯合体的培育方法，其特征在于，所述步骤c、步骤d和步骤e的培养条件为：相对湿度80％，温度24～26℃，光照强度为1000～2000勒克斯，每日光照10～14小时。

5.如权利要求1所述的番茄抗病纯合体的培育方法，其特征在于，所述步骤c、步骤d和步骤e中的培养基为：愈伤组织诱导培养基为MS基本培养基、KT0.5mg/L、2,4-D 1mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值5.8；愈伤组织培养基为MS基本培养基、6-BA 2mg/L、IAA 0.3mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值为5.8；生根培养基为1/2MS、IBA 0.2mg/L、海藻糖30g/L、黑果枸杞汁过滤液20g/L和琼脂8g/L，pH值5.8。