CN108401901B - 一种辣椒抗病纯合体的培育方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辣椒抗病纯合体的培育方法，该方法包括组织培养鉴定步骤和抗病毒病筛选步骤，组织培养鉴定是利用常规培养基基础上以海藻糖代替蔗糖并添加黑果枸杞汁过滤液营养成分配制出来特定的培养基配方对辣椒进行外植体的选择、外植体处理、花药培养、完整植株的获得、秋水仙素处理及倍性鉴定，得到纯合体幼苗；并利用分子标记技术进行抗病毒病分子标记筛选，得到抗病毒病纯合体植株。本发明方法能够显著缩短筛选周期，快速获得辣椒抗病毒病纯合体；并且此方法操作简单，成本低，花培苗移栽后成活率高，抗逆性强，易于推广，可以直接应用于生产，有较好的经济效益和社会效益。

Description

一种辣椒抗病纯合体的培育方法

技术领域

本发明涉及农作物育种技术领域，尤其涉及一种辣椒抗病纯合体的培育方法。

背景技术

辣椒(Capsicum annuum L)是起源于中南美洲及墨西哥一带的一种重要蔬菜作物，在中国的年播种面积已达100多万公顷。20世纪60年代已有初辣(甜)椒病毒病的毒源种类的相关报道。20世纪70年代以来辣(甜)椒病毒病的危害日趋严重，发病率高、蔓延快，一般减产30％左右，严重的高达60％以上，甚至绝产，成为辣(甜)椒生产的主要限制因素。因此，抗病毒病品种培育是最有效、具有显著经济、生态效益的防治途径。

传统育种中，兼抗多种病毒病的高代纯和自交系亲本材料的获得，主要利用自交、杂交和回交技术，通常3～5年才能完成。育种周期长，育种成功率低，因此，迫切需要建立一整套高效的育种体系，提高育种效率，切实为生产服务。

发明内容

本发明的发明原理：本发明主要利用花药单倍体培养技术，在花药单倍体培养的过程中，用对培养物中生命活性物质具有非特异性保护作用的海藻糖取代了传统培养基中所用的蔗糖，加入黑果枸杞汁过滤液，其含有多种有益活性物质，能够显著提高花药单倍体的成功率。并结合分子标记辅助育种技术，筛选包括番茄斑萎病毒(tomato spotted wiltvirus，TSWV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)和烟草花叶病毒(Tobaccomosaic virus，TMV)病毒病。1～2年内可快速获得遗传稳定，兼抗多种病毒病的辣(甜)椒抗病毒病纯合体材料，为品种培育奠定材料基础。

本发明所要解决的技术问题是：提供一种辣椒抗病纯合体的培育方法，克服了传统方法获得辣椒抗病纯合体周期长的缺点，显著缩短筛选周期，快速获得辣椒抗病纯合体；并且此方法操作简单，成本低，易于推广，花培苗移栽后成活率高，抗逆性强，可以直接应用于生产。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种辣椒抗病纯合体的培育方法，包括辣椒花药培养鉴定步骤和抗病毒病筛选步骤，所述的组织培养鉴定步骤如下：

a.外植体的选择：取不同长度辣椒花蕾的花药进行压片检查，选取花药培养所需要的适宜花蕾；

b.外植体的处理：花蕾在4℃冰箱中低温预处理1～3天后，加入3～4滴吐温80，置于流水中冲洗1～2小时；然后进行消毒处理；

c.花药培养:将花药接种于花药诱导分化培养基进行培养；

其中，花药诱导分化培养基成分为0.03～0.07mg·L^-1 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、0.005～0.02mg·L^-1 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、30g·L^-1海藻糖、20～40g·L^-1黑果枸杞汁过滤液、7g·L^-1琼脂粉和MS基本培养基成分，调节pH值至5.8；

d.完整植株的获得:当愈伤组织分化出的芽长至2～3cm时，切取不定芽，并将其接入生根培养基进行培养；

其中，生根培养基成分为0.2mg·L^-1NAA、30g·L^-1海藻糖、20～40g·L^-1黑果枸杞汁过滤液、7g·L^-1琼脂粉和1/2MS基本培养基成分，调节pH值至5.8；

e.秋水仙素处理及倍性鉴定:在无菌条件下，用浓度为0.1～0.5％的秋水仙素溶液处理步骤d获得的植株的生长点，然后取新生叶片进行倍性鉴定；

所述的抗病毒病筛选步骤为利用分子标记检测花培苗，快速筛选出能够抗TSWV、CMV和TMV的抗病毒病纯合体植株，其方法如下：

根据改良的CTAB法提取辣椒全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，引物序列如下：

TSWV上游引物：GTGCCAGAGGAGGATTTAT

TSWV下游引物：GCGAGGTGGACACTGATACT

CMV上游引物：TCAGCAAAGAAAGATTCACGAAC(HinfⅠ酶切)

CMV下游引物：ACGTACACTTGATGATGCCTTGT(HinfⅠ酶切)

TMV上游引物：GCACATCAGCAGGTTTAGTACG

TMV下游引物：CCAACTGTCAAACCTCGGTT

其中，PCR扩增设置条件、电泳检测条件等见表1：

表1分子标记检测条件

上述标记通过PCR检测，能够区分抗病毒病单株和感病单株。在单倍体植株中进行分子标记检测，结果分析如下：TSWV标记，若检测出抗性条带568bp，则证明该单株抗TSWV；若检测出感病条带320bp和220bp，则该单株易感TSWV。CMV标记，PCR扩增条带经HinfⅠ酶切后，若酶切为350bp和150bp，则证明该单株抗CMV；若不能酶切出上述条带，则该单株易感CMV。TMV标记，若检测到感病条带751bp，则该单株易感TMV，若无该条带，则植株抗TMV。

优选的，所述的步骤a中的压片检查为取不同长度辣椒花蕾的花药用碘-碘化钾染色压片检查花粉发育时期，以确定花粉发育时期与花蕾长度的关系，用于选取花药培养所需要的适宜花蕾；最终确定以长度在4.0～4.49mm的花蕾为外植体，此时花瓣与花萼等长或花瓣稍长于花萼，花药绿色，花药末端略带紫色，小孢子多处于单核靠边期，最适合诱导胚状体发生。

优选的，所述的步骤b中消毒处理是采用75％酒精消毒15秒，无菌水冲洗3～4次；用浓度为0.1％的升汞(氯化汞)消毒8～10分钟，用无菌水冲洗3～4次。

优选的，所述的步骤c中花药诱导分化培养基成分为0.05mg·L^-1 6-BA、0.01mg·L^-1 2,4-D、30g·L^-1海藻糖、20g·L^-1黑果枸杞汁过滤液、7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8。

优选的，所述的步骤d中生根培养基成分为1/2MS基本培养基、0.2mg·L^-1NAA、30g·L^-1海藻糖、20g·L^-1黑果枸杞汁过滤液、7g·L^-1琼脂粉，pH5.8。

优选的，所述的步骤c中的MS基本培养基成分为，大量元素：硝酸钾1900mg·L^-1，硝酸铵1650mg·L^-1，磷酸二氢钾170mg·L^-1，硫酸镁370mg·L^-1，氯化钙440mg·L^-1；微量元素：碘化钾0.83mg·L^-1，硼酸6.2mg·L^-1，硫酸锰22.3mg·L^-1，硫酸锌8.6mg·L^-1，钼酸钠0.25mg·L^-1，硫酸铜0.025mg·L^-1，氯化钴0.025mg·L^-1；铁盐：乙二胺四乙酸二钠37.3mg·L^-1，硫酸亚铁27.8mg·L^-1；有机成分为：肌醇100mg·L^-1，甘氨酸2mg·L^-1，盐酸硫胺素0.1mg·L^-1，盐酸吡哆醇0.5mg·L^-1，烟酸0.5mg·L^-1；

优选的，所述的步骤d中1/2MS基本培养基成份为：硝酸钾950mg·L^-1，硝酸铵825mg·L^-1，磷酸二氢钾85mg·L^-1，硫酸镁185mg·L^-1，氯化钙220mg·L^-1；微量元素为：碘化钾0.83mg·L^-1，硼酸6.2mg·L^-1，硫酸锰22.3mg·L^-1，硫酸锌8.6mg·L^-1，钼酸钠0.25mg·L^-1，硫酸铜0.025mg·L^-1，氯化钴0.025mg·L^-1；铁盐为：乙二胺四乙酸二钠37.3mg·L^-1，硫酸亚铁27.8mg·L^-1；有机成分为：肌醇100mg·L^-1，甘氨酸2.0mg·L^-1，盐酸硫胺素0.1mg·L^-1，盐酸吡哆醇0.5mg·L^-1，烟酸0.5mg·L^-1。

优选的，所述的黑果枸杞汁过滤液为新鲜采摘的完全成熟的黑果枸杞，或采摘后晾干的干黑果枸杞经过蒸馏水常温浸泡24～48小时得到的黑果枸杞，经过果蔬榨汁机榨汁得到汁液，再经过三层纱布过滤后得到的黑果枸杞汁过滤液。

优选的，所述的步骤c中接种密度为每100mm培养皿8个花蕾；培养条件为：在白天温度28℃，夜晚温度为20℃的组培室中培养，培养相对湿度80％，光照强度为1000～2000勒克斯，每日光照16小时。

优选的，所述的步骤d的培养条件为：相对湿度80％，温度24～26℃，光照强度为1000～2000勒克斯，每日光照16小时。两周左右获得完整植株。

优选的，所述的步骤e中倍性鉴定为秋水仙素处理20天后采取新生叶片，利用流式细胞仪进行倍性鉴定，剔除多倍体及单倍体植株。

优选的，所述的步骤c和步骤d中pH值用1％的NaOH或HCl来调节。

优选的，所述的步骤c和步骤d中培养基的灭菌的条件是121℃，20分钟。

优选的，上述的步骤b中用75％酒精消毒及其之后的操作均在无菌条件下进行。

优选的，上述的步骤b至步骤e中的操作均在无菌条件下进行。

由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

1、提高花培苗抗逆性：本发明培养基中用海藻糖取代了传统培养基中的蔗糖，在为植物提供碳源和能源，调节渗透压的基础上，可以在花培苗体内细胞表面形成独特的保护膜，对其体内多种生物活性物质起到非特异性保护作用，显著提高花培苗抗逆性，一定程度上抵御培养过程中不利因素(包括不利渗透压、弱光、高湿等)对花培苗的伤害。而蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。

2、提高了花药培养诱导率：培养基中加入了黑果枸杞汁过滤液，而黑枸杞中氨基酸种类、矿质元素、花青素等相对较丰富：亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸等含量相对较高；果实所含的微量元素也很丰富，除常量元素Na、K、Mg、Ca、Fe之外，还含有一定量的微量元素Mn、Sr、Se、Zn、Cr、Cu等，由于微量元素对多种酶的活性和核酸、蛋白质的合成，对细胞增殖等具有直接或间接地作用；另外花青素具有深入细胞保护细胞膜不被自由基氧化的作用，具有强力抗氧化功能，促进了愈伤组织的形成，不定芽的分化。

3、操作简单、成本低。本发明培养基制作方便，成本低，极大地节省了生产成本。

4、显著提高花培苗炼苗成活率：花培苗虽然具有一定的光合能力，但长期处于高湿、弱光、低CO₂、恒温的异养条件下生长，其组织分化不完善，叶表保护组织不发达，气孔多而且不易关闭、叶绿素少，根毛少，光合自养能力弱，适应性差。本发明培养的花培苗体内含有较高水平的海藻糖，抗逆性高，在炼苗过程中，能够有效保护花培苗细胞活性，促进花培苗组织发育，显著提高对外界环境变化的适应性，提高成活率。

5、传统育种中，兼抗多种病害的高代纯和自交系亲本材料的获得，主要利用自交、杂交和回交技术，通常3～5年才能完成。本发明主要利用花药单倍体培养技术，结合分子标记辅助育种技术，1～2年内可快速获得遗传稳定，兼抗多种病毒病的辣椒抗病毒病纯合体材料，显著缩短了育种周期，节省了人力物力，降低育种成本。

6、与传统的倍型分析相比，本发明在单倍体培养过程中结合使用分子标记技术，最终筛选出兼抗TSWV、TMV和CMV三种病毒病的植株，筛选准确度高，检测效率高，成本低，能够快速获得辣椒抗病毒病纯合体。

总之，本发明方法能够显著缩短筛选周期，快速获得辣椒抗病毒病纯合体；并且此方法操作简单，成本低，花培苗移栽后成活率高，抗逆性强，易于推广，可以直接应用于生产，有较好的经济效益和社会效益。

具体实施方式

实施例1：

取辣椒花药作为外植体，设6种不同培养基处理，各3次重复，具体技术方案如下：

处理1：按本发明的方法进行辣椒花药单倍体培养。

于晴天从寿光蔬菜集团育种基地大棚内辣椒植株上采集4.0～4.49mm长的花蕾，置于4℃预处理4天后加入3～4滴吐温80，置于流水中冲洗1.5小时；再采用75％酒精消毒15秒，无菌水冲洗4次；用浓度为0.1％的升汞(氯化汞)消毒10分钟，用无菌水冲洗4次。将花药接种于MS基本培养基加补充组份，补充组份为0.05mg·L^-1 6-BA、0.01mg·L^-1 2,4-D、30g·L^-1海藻糖、20g·L^-1黑果枸杞汁过滤液、7g·L^-1琼脂粉，pH5.8。接种密度为每100mm培养皿8个花蕾。然后在白天温度28℃，夜晚温度为20℃的组培室中继续培养。相对湿度80％，光照强度1500勒克斯，每日光照16小时。

当愈伤组织分化出的芽长至2～3cm时，切取丛生芽，并将其接入生根培养基中培养；生根培养基为1/2MS基本培养基、0.2mg·L^-1NAA、30g·L^-1海藻糖、20g·L^-1黑果枸杞汁过滤液、7g·L^-1琼脂粉，pH5.8。培养条件：温度24～26℃，相对湿度80％，光照强度1500勒克斯，每日光照16小时。两周左右获得完整植株。

在无菌条件下，用浓度为0.1～0.5％的秋水仙素溶液处理植株生长点，20天后取新生叶片利用流式细胞仪进行倍性鉴定，剔除多倍体及单倍体植株。

利用分子标记检测花培苗，快速筛选出能够抗TSWV、TMV和CMV的抗病毒病纯合体植株。

根据改良的CTAB法提取辣椒全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，引物序列如下：

TSWV上游引物：GTGCCAGAGGAGGATTTAT

TSWV下游引物：GCGAGGTGGACACTGATACT

CMV上游引物：TCAGCAAAGAAAGATTCACGAAC(Hinf Ⅰ酶切)

CMV下游引物：ACGTACACTTGATGATGCCTTGT(Hinf Ⅰ酶切)

TMV上游引物：GCACATCAGCAGGTTTAGTACG

TMV下游引物：CCAACTGTCAAACCTCGGTT

利用以上引物，对培养的植株组织DNA进行PCR扩增，并检测扩增结果。

处理2：将上述处理1提到的诱导分化培养基和生根培养基中30g·L^-1海藻糖更换为30g·L^-1蔗糖，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。

处理3：将上述处理1提到的诱导分化培养基和生根培养基中不添加黑果枸杞汁过滤液，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。

处理4：将上述处理1提到的诱导分化培养基和生根培养基中20g·L^-1黑果枸杞汁过滤液更换为40g·L^-1黑果枸杞汁过滤液，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。

处理5：将上述处理1提到的诱导分化培养基和生根培养基中30g·L^-1海藻糖更换为30g·L^-1蔗糖，不添加黑果枸杞汁过滤液，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。

处理6：将上述处理1提到的诱导分化培养基和生根培养基中30g·L^-1海藻糖更换为30g·L^-1蔗糖，20g·L^-1黑果枸杞汁过滤液更换为40g·L^-1黑果枸杞汁过滤液，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。

以上6种处理的培养基主要成份及区别见表2：

表2 6种处理培养基主要成份及区别

处理	基本培养基	糖	添加物
				处理1	Ms	30g·L<sup>-1</sup>海藻糖	20g·L<sup>-1</sup>黑果枸杞汁过滤液
处理2	Ms	30g·L<sup>-1</sup>蔗糖	20g·L<sup>-1</sup>黑果枸杞汁过滤液
				处理3	Ms	30g·L<sup>-1</sup>海藻糖	不添加
处理4	Ms	30g·L<sup>-1</sup>海藻糖	40g·L<sup>-1</sup>黑果枸杞汁过滤液
				处理5	Ms	30g·L<sup>-1</sup>蔗糖	不添加
处理6	Ms	30g·L<sup>-1</sup>蔗糖	40g·L<sup>-1</sup>黑果枸杞汁过滤液

以上6种处理的结果见表3：

表3不同培养基对花培苗的影响

注：培养50天时，调查愈伤组织诱导率，愈伤组织诱导率＝(诱导愈伤组织外植体个数/接种外植体数)×100％；培养70天时，调查不定芽分化率，愈伤组织不定芽分化率＝(具有不定芽分化的愈伤组织块数/继代愈伤组织块数)×100％；将分化出芽的材料转移到生根培养基上诱导生根，培养20天时，测量花培苗株高株茎，目测观察根的生长情况，生根率＝(具有根系的花培苗/诱导生根花培苗总数)×100％；平均根数＝诱导生根花培苗出根总数/诱导生根花培苗个数；移栽后30天统计炼苗成活率，炼苗成活率＝(炼苗后成活的花培苗数目/炼苗花培苗总数)×100％。

试验结果表明：本发明能够提高辣椒花培苗的抗逆性，显著促进花培苗分化生长，显著提高辣椒花药愈伤组织诱导率、不定芽分化率、平均株高和平均株茎；而且花培苗炼苗成活率也显著提高。本发明在单倍体培养过程中结合使用分子标记技术，最终筛选出兼抗TSWV、TMV和CMV三种病毒病的植株，筛选准确度高，检测效率高，成本低，能够快速获得辣椒抗病毒病纯合体。

实施例2：

实际应用：按本发明的方法进行辣椒花药单倍体培养。

于晴天从寿光蔬菜集团育种基地大棚内辣椒植株上采集4.0～4.49mm长的花蕾，置于4℃预处理4天后加入4滴吐温80，置于流水中冲洗1.5小时；再采用75％酒精消毒15秒，无菌水冲洗4次；用浓度为0.1％的升汞(氯化汞)消毒10分钟，用无菌水冲洗4次。将花药接种于MS基本培养基，培养基配方为0.05mg·L^-1 6-BA、0.01mg·L^-1 2,4-D、30g·L^-1海藻糖、20g·L^-1黑果枸杞汁过滤液、7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8。接种密度为每100mm培养皿8个花蕾。然后在白天温度28℃，夜晚温度为20℃的组培室中继续培养。

当愈伤组织分化出的芽长至2～3cm时，切取丛生芽，并将其接入生根培养基中培养；生根培养基为1/2MS基本培养基、0.2mg·L^-1NAA、30g·L^-1海藻糖、20g·L^-1黑果枸杞汁过滤液、7g·L^-1琼脂粉，pH5.8。培养条件：温度24～26℃，相对湿度80％，光照强度1500勒克斯，每日光照16小时。两周左右获得完整植株。

在无菌条件下，用浓度为0.1～0.5％的秋水仙素溶液处理植株生长点，20天后取新生叶片利用流式细胞仪进行倍性鉴定，剔除多倍体及单倍体植株。

利用分子标记检测花培苗，快速筛选出能够抗TSWV、CMV和TMV的抗病毒病纯合体植株。

根据改良的CTAB法提取辣椒全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，其中分子标记检测条件见表1，引物序列如下：

TSWV上游引物：GTGCCAGAGGAGGATTTAT

TSWV下游引物：GCGAGGTGGACACTGATACT

CMV上游引物：TCAGCAAAGAAAGATTCACGAAC(Hinf Ⅰ酶切)

CMV下游引物：ACGTACACTTGATGATGCCTTGT(Hinf Ⅰ酶切)

TMV上游引物：GCACATCAGCAGGTTTAGTACG

TMV下游引物：CCAACTGTCAAACCTCGGTT

实际应用中采集的各数据见表4：

表4数据调查记录表：

愈伤组织诱导率

不定芽分化率

平均株高

平均株茎

生根率

平均根数

炼苗成活率

32.42％

76.55％

5.76

0.34

98.31％

14.56

96.09％

注：愈伤组织诱导率、不定芽分化率、株高、株茎、生根率、平均根数和炼苗成活率统计方式参照实施例1。

实验结果表明：本发明能够提高辣椒花培苗的抗逆性，显著促进花培苗分化生长，显著提高辣椒花药愈伤组织诱导率、不定芽分化率、平均株高和平均株茎，而且花培苗炼苗成活率也显著提高；本发明在单倍体培养过程中结合使用分子标记技术，最终筛选出兼抗TSWV、TMV和CMV三种病毒病的植株，筛选准确度高，检测效率高，成本低，能够快速获得辣椒抗病毒病纯合体。本发明能够广泛的运用于生产。

应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种辣椒抗病纯合体的培育方法，其特征在于，包括花药培养鉴定步骤和抗病毒病筛选步骤，所述花药培养鉴定的步骤如下：

a.外植体的选择

取花蕾的花药进行压片检查，选取所需要的花蕾；以长度在4.0～4.49mm的花蕾为外植体，此时小孢子多处于单核靠边期；

b.外植体的处理

花蕾在4℃冰箱中低温预处理1～3天后，加入3～4滴吐温80，置于流水中冲洗1～2小时；然后进行消毒处理；

c.花药培养

将花药接种于花药诱导分化培养基进行培养；其中，花药诱导分化培养基成分为0.03～0.07mg·L^-16-BA、0.005～0.02mg·L^-12,4-D、30g·L^-1海藻糖、20～40g·L^-1黑果枸杞汁过滤液、7g·L^-1琼脂粉和MS基本培养基成分，调节pH值至5.8；

d.完整植株的获得

待愈伤组织分化出的芽长至2～3cm时，切取不定芽，并将其接入生根培养基进行培养；其中，生根培养基成分为0.2mg·L^-1NAA、30g·L^-1海藻糖、20～40g·L^-1黑果枸杞汁过滤液、7g·L^-1琼脂粉和1/2MS基本培养基成分，调节pH值至5.8；

e.秋水仙素处理及倍性鉴定

在无菌条件下，用秋水仙素溶液处理步骤d获得的植株的生长点，然后取新生叶片进行倍性鉴定；

所述抗病毒病筛选步骤为：提取辣椒组培苗全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，通过PCR扩增筛选出能够抗TSWV、CMV和TMV的抗病毒病纯合体植株，其引物序列如下：

TSWV上游引物：GTGCCAGAGGAGGATTTAT

TSWV下游引物：GCGAGGTGGACACTGATACT

CMV上游引物：TCAGCAAAGAAAGATTCACGAAC

CMV下游引物：ACGTACACTTGATGATGCCTTGT

TMV上游引物：GCACATCAGCAGGTTTAGTACG

TMV下游引物：CCAACTGTCAAACCTCGGTT；

所述黑果枸杞汁过滤液为新鲜采摘的完全成熟的黑果枸杞，或采摘后晾干的干黑果枸杞经过蒸馏水常温浸泡24～48小时得到的黑果枸杞，经过果蔬榨汁机榨汁得到汁液，再经过三层纱布过滤后得到的黑果枸杞汁过滤液；

所述步骤b中的消毒为将花蕾用75％酒精消毒30秒，然后用浓度为0.1％的升汞消毒8～10分钟，然后经无菌水冲洗3～4次；在无菌条件下将花药从花蕾中取出，选取2～5mm长的花药用于花药培养；

所述步骤e中倍性鉴定为秋水仙素处理20天后采取新生叶片，利用流式细胞仪进行倍性鉴定，剔除多倍体及单倍体植株。

2.如权利要求1所述的辣椒抗病纯合体的培育方法，其特征在于，所述步骤a中的压片检查为碘-碘化钾染色压片检查。

3.如权利要求1所述的辣椒抗病纯合体的培育方法，其特征在于，所述步骤c中花药诱导分化培养基成分为0.05mg·L^-16-BA、0.01mg·L^-12,4-D、30g·L^-1海藻糖、20g·L^-1黑果枸杞汁过滤液、7g·L^-1琼脂粉，pH值为5.8。

4.如权利要求1所述的辣椒抗病纯合体的培育方法，其特征在于，所述步骤c中接种密度为每100mm培养皿8个花蕾的花药；培养条件为：在白天温度28℃，夜晚温度为20℃的组培室中培养，培养相对湿度80％，温度24～26℃，光照强度为1000～2000勒克斯，每日光照16小时。

5.如权利要求1所述的辣椒抗病纯合体的培育方法，其特征在于，所述步骤d中的生根培养基成分为1/2MS基本培养基、0.2mg·L^-1NAA、30g·L^-1海藻糖、20g·L^-1黑果枸杞汁过滤液、7g·L^-1琼脂粉，pH5.8。

6.如权利要求1所述的辣椒抗病纯合体的培育方法，其特征在于，所述步骤d的培养条件为：相对湿度80％，温度24～26℃，光照强度为1000～2000勒克斯，每日光照16小时。