CN116724894B - 一种辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于辣椒花药培养技术领域，提出了一种辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，包括如下步骤：在MS基本培养基中，加入辣椒提取液，辣椒提取液的加入量为15‑30%(v/v)，得到一次改良培养基；在一次改良培养基的基础上，去除微量元素中的硫酸铜，得到二次改良培养基；在二次改良培养基的基础上，将所有大量元素的含量减少到40‑50%，得到三次改良培养基；将消毒处理后的外植体，在无菌条件下接种到三次改良培养基上进行培养。综上所述，本发明通过对MS基本培养基的三级优化，使辣椒花药培养中，外植体的褐化指数显著降低，愈伤组织诱导率、胚状体诱导率以及再生效率等指标显著升高。

Description

一种辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法
技术领域
本发明涉及辣椒花药培养技术领域，尤其涉及一种辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法。
背景技术
在辣椒育种工作中，自交系的选育需要进行隔离授粉，费工费时，而且长期的自交还易导致育种材料遗传退化。通过离体培养花药获得单倍体植株是解决这一问题的方法之一。由花药发育而来的再生植株只含有一套染色体，没有显性性状遮盖隐性性状的问题，可从表现型直接判断其基因型，是遗传分析的理想材料；而单倍体基因组经染色体加倍，能在短时间产生完全纯合的二倍体，应用于育种工作。
授权公告号为CN104357374B的专利中公开了一种辣椒花药组织培养方法，授权公告号为CN104041414B的专利中公开了一种辣椒花药培养获得单倍体再生植株的方法，授权公告号为CN1236668C的专利中公开了一种利用辣椒杂交种的花药培育近似杂交种的方法，授权公告号为CN105638455B的专利中公开了一种通过花药培养获得制干辣椒单倍体植株的方法及培养基。
上述专利中的技术，均是利用离体培养花药的方式获得单倍体植株，但是，上述专利中的方案，使用的培养基中，大量元素的含量都比较高，且微量元素中均含有硫酸铜。
发明人经过研究发现，在辣椒花药培养过程中会产生酚类化合物，当酚类化合物含量高时，酚氧化酶、酚类和氧气发生氧化反应，形成木质素、单宁和色素等有毒的醌类化合物，切口表面迅速变成褐色或棕色。这些醌类化合物扩散到培养基中，可以抑制其他酶的活性，毒害整个外植体，同时污染培养基，阻碍组织培养的进程，降低辣椒的植株再生效率，限制其单倍体技术的应用。因此，现有技术中，通过离体培养花药获得辣椒植株的再生效率较低，再生效率基本在10%左右，限制了辣椒单倍体技术的应用。
公开号为CN 104719169 B的专利中公开了一种高效地诱导粳稻花药培养的诱导培养基配方，公开号为CN 105660406 B的专利中公开了一种茄子花药诱导培养基及配制方法，公开号为CN 105961200 B的专利中公开了一种烟草花药分化培养基及配制方法，这三个专利中针对粳稻、茄子、烟草等三种作物，通过优化基本培养基配方，调整大量元素、微量元素、有机添加物、无机添加物、植物生长调节剂、生理活性物质等的成分和用量，达到降低培养材料和培养基的褐化反应的目的，但是，上述优化培养基配方的方式，并不是针对辣椒这种作物，优化后的培养基中，大量元素和微量元素的含量比较高，并不适应于辣椒的花药培养。
论文：辣椒花药、小孢子培养技术研究.孙少霞.南京农业大学硕士学位论文.其公开了辣椒花药培养的技术，但是并没有研究辣椒花药培养过程中外植体褐化的问题。
论文：不同培养基对辣椒花药培养的影响.湖南农业大学学报(自然科学版).2010,4,36（2）:181-187.论文中公开，在MS、NTH和B5培养基中分别添加 5 mg/L AgNO3均对减轻褐化具有明显效果。
论文：辣椒花药培养技术研究.静一.重庆师范大学硕士学位论文.论文中公开，AgNO3显著影响花药的褐化程度，添加6 mg/L 时，辣椒578、辣椒186的褐化程度分别为0。
论文：辣椒花药培养中若干影响因素的研究.王立浩等.园艺学报2004,31(2):199-204.论文中公开：AgNO3和维生素C能够有效地减轻褐化，促进愈伤组织的生成，提高胚状体的发生率。
上述三个论文中，均公开通过在培养基中添加AgNO3的方式来改善辣椒花药培养过程中的褐化现象，但是AgNO3具有毒性，超过一定的临界值，对作物有毒害作用；长时间使用，银离子和激素一样，也能在植物体中残留，使培养物畸形。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，通过对MS基本培养基的三级优化，使辣椒花药培养中，外植体的褐化指数显著降低，愈伤组织诱导率、胚状体诱导率以及再生效率等指标显著升高。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，包括如下步骤：
步骤一 外植体的选择及处理：
选择长度为4.0-4.49mm的花蕾为外植体，并对外植体进行消毒处理；此时花瓣与花萼等长或花瓣稍长于花萼，花药绿色，花药末端略带紫色，小孢子多处于单核靠边期，最适合诱导胚状体发生。
步骤二 制备辣椒提取液
选用与外植体同品种的辣椒，并与2.5-4倍质量的纯水混合后榨汁，使用孔径为0.1-0.3mm的滤布进行过滤，得到辣椒提取液。
步骤三 准备改良培养基
在MS基本培养基中，加入辣椒提取液，辣椒提取液的加入量为15-30%(v/v)，得到一次改良培养基；
在一次改良培养基的基础上，去除微量元素中的硫酸铜，得到二次改良培养基；
在二次改良培养基的基础上，将MS基本培养基成分中，所有大量元素的含量减少到40-50%，其它成分不变；得到三次改良培养基。
步骤四 外植体诱导培养：
将步骤一中消毒处理后的外植体，在无菌条件下接种到三次改良培养基上，在组培室中继续培养，培养条件为：白天温度24-30℃，夜晚温度为16-24℃；接种密度为每100mm培养皿15个花药。
步骤五 数据统计：
自花药置床后的第45天，统计各个处理的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率和再生效率。
本发明中，MS基本培养基成分包括大量元素、微量元素、铁盐、有机成分。其中，
大量元素包括硝酸钾1900mg·L-1，硝酸铵1650mg·L-1，磷酸二氢钾170mg·L-1，硫酸镁370mg·L-1，氯化钙440mg·L-1；
微量元素包括碘化钾0.83mg·L-1，硼酸6.2mg·L-1，硫酸锰22.3mg·L-1，硫酸锌8.6mg·L-1，钼酸钠0.25mg·L-1，硫酸铜0.025mg·L-1，氯化钴0.025mg·L-1；
铁盐包括乙二胺四乙酸二钠37.3mg·L-1，硫酸亚铁27.8mg·L-1；
有机成分为包括肌醇100mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，盐酸硫胺素0.1mg·L-1，盐酸吡哆醇0.5mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1。
本发明中，外植体的母株在26.4±0.4℃温度条件下生长。辣椒提取液制备过程中，选用的辣椒为鲜辣椒。
本发明中，外植体的消毒处理方法为：花蕾在3-5℃冰箱中低温预处理2.5-4d后，加入3-5滴吐温80，置于流水中冲洗1.5-2.5h；再采用体积浓度为75%的酒精消毒13-20s，无菌水冲洗3-5次；再用质量浓度为0.1%的升汞（氯化汞）消毒10-15min，最后用无菌水冲洗3-5次，得到处理后的外植体。
本发明步骤二中，过滤过程中的滤布设置三层。
优选的，步骤三中所有大量元素的含量减少到45%。
优选的，步骤三中，加入辣椒提取液时，辣椒提取液的加入量为20%(v/v)。
辣椒含有丰富的抗坏血酸、胡萝卜素、维生素A、维生素B、钙、磷、铁等，此外，还含有硫胺素、核黄素、尼克酸、苹果酸、柠檬酸和辣椒素等。
辣椒提取液富含的抗坏血酸和胡萝卜素，作为还原剂，具有极强的抗氧化性，能够有效的减轻外植体内多酚物质的氧化，能将氧化的醌还原为酚类物质，阻止醌类物质进一步自发聚合形成色素物质，减少花药培养中褐化现象的发生。
辣椒提取液含有的维生素A、维生素B等多种维生素，能补充培养基的维生素种类与含量，促进外植体的生长。
辣椒提取液中含有的辣椒素，能够抑制细菌生长。
酚类氧化酶的辅酶以铜离子为主，少量是其它的2价离子，去除微量元素中的硫酸铜，抑制了酚类氧化酶的辅酶的合成，减轻了外植体的褐化。
同时，培养基中无机盐浓度过高会引起外植体酚类物质外泄，加剧褐变；如Mg2+、Ca2+等2价离子，可作为氧化酶类的组成成分或辅酶因子，本发明MS培养基中，所有大量元素的含量减少到40-50%，即，2价离子的含量降低，因此，在培养过程中，通过降低无机盐中2价离子的浓度，能够进一步降低酶活性、抑制酚类氧化、减轻褐变。
本发明的辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法相对于现有技术具有以下有益效果：
1、本发明通过在MS基本培养基中加入辣椒提取液，通过辣椒中含有的还原剂成分，减轻外植体内多酚物质的氧化，阻止醌类物质进一步自发聚合形成色素物质，减少花药培养中褐化现象的发生；通过辣椒中含有的维生素，能补充培养基的维生素种类与含量；通过辣椒中含有的辣椒素，抑制细菌生长，因此，维生素和辣椒素对外植体的培养有益。
2、辣椒提取液在一定程度上减少褐化现象，促进外植体生长，但是，其效果并不能达到最优，因此，继续将MS基本培养基中的硫酸铜去除，通过去除铜离子，抑制了酚类氧化酶的辅酶的合成，进一步减轻了外植体的褐化。
3、虽然酚类氧化酶的辅酶以铜离子为主，但是辅酶也包括少量的其它2价离子，因此，再进一步对MS基本培养基优化，将大量元素的含量减少到40-50%，使Mg2+、Ca2+等2价离子的含量降低，进一步降低酶活性、抑制酚类氧化、减轻褐变；虽然大量元素的含量减少，但是辣椒花药培养过程中所需要的营养物质，可以通过辣椒提取液中含有的维生素A、维生素B、钙、磷、铁、硫胺素、核黄素、尼克酸、苹果酸、柠檬酸和辣椒素等营养成分进行补充，使辣椒花药培养过程中，有充足的营养物质供其生长。
4、通过对MS基本培养基的三级优化，使辣椒花药培养中，外植体的褐化指数显著降低，愈伤组织诱导率、胚状体诱导率以及再生效率等指标显著升高。
5、本发明对MS基本培养基的优化并不涉及AgNO3，不会使Ag+在辣椒体内形成残留，避免辣椒花药培养的外植体产生畸形。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
本发明中，褐化等级表示：
0级：花药不变色，或者微微变绿；
1级：花药略变褐；
2级：花药变褐色；
3级：花药深褐色，接近黑色。
褐化指数（%）=Σ(褐化发生数×各褐化等级级数值)/(接种花药数×最高级别)×100%
愈伤组织诱导率（%）=形成愈伤组织花药数/接种花药数×100%
胚状体诱导率（%）=形成胚状体花药数/接种花药数×100%
再生效率（诱导率总计）（%）=愈伤组织诱导率+胚状体诱导率
本发明选取SP822080009黄色方椒、HP822060080羊角椒、HP822070048羊角形（螺旋）三个品种的辣椒，按照本发明的方法进行辣椒花药培养（实施例1-4），并统计各个实施例中，不同品种辣椒的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率和再生效率，本发明每种培养基接种20个培养皿。统计结果见表1。
实施例1
一种辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，包括如下步骤：
步骤一 外植体的选择及处理：
选择长度为4mm的花蕾为外植体，并对外植体进行消毒处理；此时花瓣与花萼等长或花瓣稍长于花萼，花药绿色，花药末端略带紫色，小孢子多处于单核靠边期，最适合诱导胚状体发生。
外植体的母株在26℃温度条件下生长。
外植体的消毒处理方法为：花蕾在3℃冰箱中低温预处理2.5d后，加入3滴吐温80，置于流水中冲洗1.5h；再采用体积浓度为75%的酒精消毒13s，无菌水冲洗3次；再用质量浓度为0.1%的升汞（氯化汞）消毒10min，最后用无菌水冲洗3次。
步骤二 制备辣椒提取液
选用与外植体同品种的鲜辣椒，并与2.5倍质量的纯水混合后榨汁，使用孔径为0.1mm的滤布进行过滤，得到辣椒提取液。
步骤三 准备改良培养基
在MS基本培养基中，加入辣椒提取液，辣椒提取液的加入量为15%(v/v)，得到一次改良培养基；
在一次改良培养基的基础上，去除微量元素中的硫酸铜，得到二次改良培养基；
在二次改良培养基的基础上，将MS基本培养基成分中，所有大量元素的含量减少到40%，其它成分不变；得到三次改良培养基。
MS基本培养基成分包括大量元素、微量元素、铁盐、有机成分。其中，
大量元素包括硝酸钾760mg·L-1，硝酸铵660mg·L-1，磷酸二氢钾68mg·L-1，硫酸镁148mg·L-1，氯化钙176mg·L-1；
微量元素包括碘化钾0.83mg·L-1，硼酸6.2mg·L-1，硫酸锰22.3mg·L-1，硫酸锌8.6mg·L-1，钼酸钠0.25mg·L-1，氯化钴0.025mg·L-1；
铁盐包括乙二胺四乙酸二钠37.3mg·L-1，硫酸亚铁27.8mg·L-1；
有机成分为包括肌醇100mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，盐酸硫胺素0.1mg·L-1，盐酸吡哆醇0.5mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1。
本发明MS基本培养基成分还包括附加激素：6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）0.2mg·L-1、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）0.5mg·L-1，琼脂粉7.0g·L-1。
步骤四 外植体诱导培养：
将步骤一中消毒处理后的外植体，在无菌条件下接种到三次改良培养基上，在组培室中继续培养，培养条件为：白天温度24℃，夜晚温度为16℃。
每种培养基接种20个培养皿，接种密度为每100mm培养皿15个花药。
步骤五 数据统计：
自花药置床后的第45天，统计各个处理的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率和再生效率。
实施例2
一种辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，包括如下步骤：
步骤一 外植体的选择及处理：
选择长度为4.49mm的花蕾为外植体，并对外植体进行消毒处理；此时花瓣与花萼等长或花瓣稍长于花萼，花药绿色，花药末端略带紫色，小孢子多处于单核靠边期，最适合诱导胚状体发生。
外植体的母株在26.8℃温度条件下生长。
外植体的消毒处理方法为：花蕾在5℃冰箱中低温预处理4d后，加入5滴吐温80，置于流水中冲洗2.5h；再采用体积浓度为75%的酒精消毒20s，无菌水冲洗5次；再用质量浓度为0.1%的升汞（氯化汞）消毒15min，最后用无菌水冲洗5次。
步骤二 制备辣椒提取液
选用与外植体同品种的鲜辣椒，并与4倍质量的纯水混合后榨汁，使用孔径为0.3mm的滤布进行过滤，得到辣椒提取液。
步骤三 准备改良培养基
在MS基本培养基中，加入辣椒提取液，辣椒提取液的加入量为30%(v/v)，得到一次改良培养基；
在一次改良培养基的基础上，去除微量元素中的硫酸铜，得到二次改良培养基；
在二次改良培养基的基础上，将MS基本培养基成分中，所有大量元素的含量减少到50%，其它成分不变；得到三次改良培养基。
MS基本培养基成分包括大量元素、微量元素、铁盐、有机成分。其中，
大量元素包括硝酸钾950mg·L-1，硝酸铵825mg·L-1，磷酸二氢钾85mg·L-1，硫酸镁185mg·L-1，氯化钙220mg·L-1；
微量元素包括碘化钾0.83mg·L-1，硼酸6.2mg·L-1，硫酸锰22.3mg·L-1，硫酸锌8.6mg·L-1，钼酸钠0.25mg·L-1，氯化钴0.025mg·L-1；
铁盐包括乙二胺四乙酸二钠37.3mg·L-1，硫酸亚铁27.8mg·L-1；
有机成分为包括肌醇100mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，盐酸硫胺素0.1mg·L-1，盐酸吡哆醇0.5mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1。
本发明MS基本培养基成分还包括附加激素：6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）0.2mg·L-1、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）0.5mg·L-1，琼脂粉7.0g·L-1。
步骤四 外植体诱导培养：
将步骤一中消毒处理后的外植体，在无菌条件下接种到三次改良培养基上，在组培室中继续培养，培养条件为：白天温度30℃，夜晚温度为24℃。
每种培养基接种20个培养皿，接种密度为每100mm培养皿15个花药。
步骤五 数据统计：
自花药置床后的第45天，统计各个处理的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率和再生效率。
实施例3
一种辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，包括如下步骤：
步骤一 外植体的选择及处理：
选择长度为4.2mm的花蕾为外植体，并对外植体进行消毒处理；此时花瓣与花萼等长或花瓣稍长于花萼，花药绿色，花药末端略带紫色，小孢子多处于单核靠边期，最适合诱导胚状体发生。
外植体的母株在26.4℃温度条件下生长。
外植体的消毒处理方法为：花蕾在4℃冰箱中低温预处理3d后，加入4滴吐温80，置于流水中冲洗2h；再采用体积浓度为75%的酒精消毒15s，无菌水冲洗4次；再用质量浓度为0.1%的升汞（氯化汞）消毒12min，最后用无菌水冲洗4次。
步骤二 制备辣椒提取液
选用与外植体同品种的鲜辣椒，并与3倍质量的纯水混合后榨汁，使用孔径为0.2mm的滤布进行过滤，得到辣椒提取液。
步骤三 准备改良培养基
在MS基本培养基中，加入辣椒提取液，辣椒提取液的加入量为20%(v/v)，得到一次改良培养基；
在一次改良培养基的基础上，去除微量元素中的硫酸铜，得到二次改良培养基；
在二次改良培养基的基础上，将MS基本培养基成分中，所有大量元素的含量减少到45%，其它成分不变；得到三次改良培养基。
MS基本培养基成分包括大量元素、微量元素、铁盐、有机成分。其中，
大量元素包括硝酸钾855mg·L-1，硝酸铵742.5mg·L-1，磷酸二氢钾76.5mg·L-1，硫酸镁166.5mg·L-1，氯化钙198mg·L-1；
微量元素包括碘化钾0.83mg·L-1，硼酸6.2mg·L-1，硫酸锰22.3mg·L-1，硫酸锌8.6mg·L-1，钼酸钠0.25mg·L-1，氯化钴0.025mg·L-1；
铁盐包括乙二胺四乙酸二钠37.3mg·L-1，硫酸亚铁27.8mg·L-1；
有机成分为包括肌醇100mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，盐酸硫胺素0.1mg·L-1，盐酸吡哆醇0.5mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1。
本发明MS基本培养基成分还包括附加激素：6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）0.2mg·L-1、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）0.5mg·L-1，琼脂粉7.0g·L-1。
步骤四 外植体诱导培养：
将步骤一中消毒处理后的外植体，在无菌条件下接种到三次改良培养基上，在组培室中继续培养，培养条件为：白天温度27℃，夜晚温度为20℃。
每种培养基接种20个培养皿，接种密度为每100mm培养皿15个花药。
步骤五 数据统计：
自花药置床后的第45天，统计各个处理的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率和再生效率。
实施例4
一种辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，包括如下步骤：
步骤一 外植体的选择及处理：
选择长度为4.4mm的花蕾为外植体，并对外植体进行消毒处理；此时花瓣与花萼等长或花瓣稍长于花萼，花药绿色，花药末端略带紫色，小孢子多处于单核靠边期，最适合诱导胚状体发生。
外植体的母株在26.5℃温度条件下生长。
外植体的消毒处理方法为：花蕾在4℃冰箱中低温预处理3d后，加入4滴吐温80，置于流水中冲洗2.2h；再采用体积浓度为75%的酒精消毒17s，无菌水冲洗4次；再用质量浓度为0.1%的升汞（氯化汞）消毒13min，最后用无菌水冲洗4次。
步骤二 制备辣椒提取液
选用与外植体同品种的鲜辣椒，并与3.4倍质量的纯水混合后榨汁，使用孔径为0.25mm的滤布进行过滤，得到辣椒提取液。
步骤三 准备改良培养基
在MS基本培养基中，加入辣椒提取液，辣椒提取液的加入量为25%(v/v)，得到一次改良培养基；
在一次改良培养基的基础上，去除微量元素中的硫酸铜，得到二次改良培养基；
在二次改良培养基的基础上，将MS基本培养基成分中，所有大量元素的含量减少到47%，其它成分不变；得到三次改良培养基。
MS基本培养基成分包括大量元素、微量元素、铁盐、有机成分。其中，
大量元素包括硝酸钾893mg·L-1，硝酸铵775.5mg·L-1，磷酸二氢钾79.9mg·L-1，硫酸镁173.9mg·L-1，氯化钙206.8mg·L-1；
微量元素包括碘化钾0.83mg·L-1，硼酸6.2mg·L-1，硫酸锰22.3mg·L-1，硫酸锌8.6mg·L-1，钼酸钠0.25mg·L-1，氯化钴0.025mg·L-1；
铁盐包括乙二胺四乙酸二钠37.3mg·L-1，硫酸亚铁27.8mg·L-1；
有机成分为包括肌醇100mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，盐酸硫胺素0.1mg·L-1，盐酸吡哆醇0.5mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1。
本发明MS基本培养基成分还包括附加激素：6-BA（6-苄氨基腺嘌呤）0.2mg·L-1、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）0.5mg·L-1，琼脂粉7.0g·L-1。
步骤四 外植体诱导培养：
将步骤一中消毒处理后的外植体，在无菌条件下接种到三次改良培养基上，在组培室中继续培养，培养条件为：白天温度28℃，夜晚温度为21℃。
每种培养基接种20个培养皿，接种密度为每100mm培养皿15个花药。
步骤五 数据统计：
自花药置床后的第45天，统计各个处理的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率和再生效率。
选用SP822080009黄色方椒，设置如下若干对比例，验证本发明辣椒花药培养方法的效果。各个对比例中的指标统计结果见表2。
对比例1
在实施例3的基础上，改良培养基中大量元素不减少，其他条件均一致。
对比例2
在实施例3的基础上，改良培养基中大量元素的含量减少到37%，其他条件均一致。
对比例3
在实施例3的基础上，改良培养基中大量元素的含量减少到55%，其他条件均一致。
对比例4
在实施例3的基础上，改良培养基中保留微量元素中的硫酸铜，其他条件均一致。
对比例5
在实施例3的基础上，改良培养基中辣椒提取液的加入量为0%，其他条件均一致。
对比例6
在实施例3的基础上，改良培养基中辣椒提取液的加入量为8%，其他条件均一致。
对比例7
在实施例3的基础上，改良培养基中辣椒提取液的加入量为12%，其他条件均一致。
对比例8
在实施例3的基础上，改良培养基中辣椒提取液的加入量为33%，其他条件均一致。
对比例9
在实施例3的基础上，改良培养基中，大量元素的含量减少到37%，保留微量元素中的硫酸铜，其他条件均一致。
对比例10
在实施例3的基础上，改良培养基中，大量元素的含量减少到37%，辣椒提取液的加入量为12%，其他条件均一致。
对比例11
在实施例3的基础上，改良培养基中，大量元素的含量减少到37%，辣椒提取液的加入量为33%，其他条件均一致。
对比例12
在实施例3的基础上，改良培养基中，大量元素的含量减少到55%，保留微量元素中的硫酸铜，其他条件均一致。
对比例13
在实施例3的基础上，改良培养基中，大量元素的含量减少到55%，辣椒提取液的加入量为12%，其他条件均一致。
对比例14
在实施例3的基础上，改良培养基中，大量元素的含量减少到55%，辣椒提取液的加入量为33%，其他条件均一致。
对比例15
在实施例3的基础上，改良培养基中，保留微量元素中的硫酸铜，辣椒提取液的加入量为12%，其他条件均一致。
对比例16
在实施例3的基础上，改良培养基中，保留微量元素中的硫酸铜，辣椒提取液的加入量为33%，其他条件均一致。
对比例17
在实施例3的基础上，改良培养基中，使用现有技术中的MS基本培养基（大量元素不减少，保留微量元素中的硫酸铜，辣椒提取液的加入量为0%），其他条件均一致。
1、通过实施例1-4和对比例17中的数据分析，实施例1-4按照本发明的方法对培养基进行改良，对比例17使用现有技术中的MS基本培养基进行辣椒花药培养；数据显示，在同一种辣椒品种中，实施例1-4中外植体的褐化指数最高为35.02，而对比例17中的褐化指数达到82.46，说明本发明的方法能够使外植体的褐化指数显著降低；实施例1-4中外植体的愈伤组织诱导率最低为38.24%、胚状体诱导率最低为7.04%，再生效率最低为45.35%，而对比例17中，外植体的愈伤组织诱导率为5.33%，胚状体诱导率为1.75%，再生效率为7.08%，说明本发明的方法能够使外植体的愈伤组织诱导率、胚状体诱导率和再生效率均显著升高。
2、通过实施例1-4中的四组数据分析，实施例3中的外植体，相较于实施例1、2和4，褐化指数相对较低，愈伤组织诱导率、胚状体诱导率和再生效率相对较高。因此，MS基本培养基的最优改良方案为：大量元素的含量减少到45%；去除硫酸铜；辣椒提取液的加入量为20%。
3、通过实施例3和对比例1中的数据分析可以看出，如果在MS基本培养基中加入适量的辣椒提取液，去除微量元素中的硫酸铜，但是大量元素的含量不减少，则培养出的外植体的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率以及再生效率等指标，效果均比实施例3差，说明大量元素中的Mg2+、Ca2+等2价离子，有助于酶活性和酚类氧化、促进褐变。
4、通过实施例3和对比例2、对比例3中的数据分析可以看出，MS基本培养基中加入适量的辣椒提取液，去除微量元素中的硫酸铜，但是大量元素的含量不减少到40-50%这个范围，培养出的外植体的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率以及再生效率等指标，效果还是不理想。
5、通过实施例3和对比例4中的数据分析可以看出，MS基本培养基中加入适量的辣椒提取液，大量元素的含量减少到40-50%这个范围，但是保留微量元素中的硫酸铜，培养出的外植体的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率以及再生效率等指标，效果均比实施例3差，说明铜离子促进了酚类氧化酶的辅酶的合成，提高了外植体的褐化。
6、通过实施例3和对比例5中的数据分析可以看出，MS基本培养基中大量元素的含量减少到40-50%这个范围，去除微量元素中的硫酸铜，但是不加入辣椒提取液，培养出的外植体的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率以及再生效率等指标，明显比实施例3中的指标差。说明辣椒中含有的抗坏血酸和胡萝卜素等还原剂，能够有效减少花药培养中外植体的褐化现象的发生，辣椒中含有的维生素能够有效促进外植体的生长。
7、通过实施例3和对比例6-7中的数据分析可以看出，MS基本培养基中大量元素的含量减少到40-50%这个范围，去除微量元素中的硫酸铜，但是加入的辣椒提取液的量低于15%，培养出的外植体的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率以及再生效率等指标，效果比实施例3中的指标差。
8、通过实施例3和对比例8中的数据分析可以看出，MS基本培养基中大量元素的含量减少到40-50%这个范围，去除微量元素中的硫酸铜，但是加入的辣椒提取液的量高于30%，培养出的外植体的褐化指数降低很小，愈伤组织诱导率、胚状体诱导率以及再生效率等指标增大量很小，因此，当辣椒提取液的加入量大于30%之后，对于外植体各指标的改变量很小，因此，从成本方向考虑，辣椒提取液的加入量不高于30%。
9、通过实施例3和对比例9、对比例12中的数据分析可以看出，MS基本培养基中，只有辣椒提取液的加入量为15-30%，但是大量元素的含量没有减少到40-50%的范围内，且保留微量元素中的硫酸铜，则培养出的外植体的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率以及再生效率等指标，效果显著比实施例3中的指标差。
10、通过实施例3和对比例10-11以及13-14中的数据分析可以看出，MS基本培养基中，只是除去微量元素中的硫酸铜，但是辣椒提取液的加入量不在15-30%的范围内，大量元素的含量也没有减少到40-50%的范围内，则培养出的外植体的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率以及再生效率等指标，效果显著比实施例3中的指标差。
11、通过实施例3和对比例15、对比例16中的数据分析可以看出，MS基本培养基中，只有大量元素的含量减少到40-50%的范围内，但是辣椒提取液的加入量不在15-30%的范围内，且保留微量元素中的硫酸铜，则培养出的外植体的褐化指数、愈伤组织诱导率、胚状体诱导率以及再生效率等指标，效果显著比实施例3中的指标差。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤一选择长度为4.0-4.49mm的花蕾为外植体，并对外植体进行消毒处理；
步骤二选用与所述外植体同品种的辣椒，与2.5-4倍质量的纯水混合后榨汁，使用孔径为0.1-0.3mm的滤布进行过滤，得到辣椒提取液；
步骤三在MS基本培养基中，加入辣椒提取液，辣椒提取液的加入量为15-30%(v/v)，得到一次改良培养基；
在所述一次改良培养基上，去除微量元素中的硫酸铜，得到二次改良培养基；
在所述二次改良培养基上，将所有大量元素的含量减少到40-50%，得到三次改良培养基；
步骤四将步骤一中消毒处理后的外植体，在无菌条件下接种到所述三次改良培养基上继续培养。
2.如权利要求1所述的辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，其特征在于：所述步骤三中，所有大量元素的含量减少到45%。
3.如权利要求1所述的辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，其特征在于：所述步骤三中，加入辣椒提取液时，辣椒提取液的加入量为20%(v/v)。
4.如权利要求1所述的辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，其特征在于：所述MS基本培养基的成分包括大量元素、微量元素、铁盐和有机成分；其中，
所述大量元素包括硝酸钾，硝酸铵，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钙；
所述微量元素包括碘化钾，硼酸，硫酸锰，硫酸锌，钼酸钠，硫酸铜，氯化钴；
所述铁盐包括乙二胺四乙酸二钠，硫酸亚铁；
所述有机成分为包括肌醇，甘氨酸，盐酸硫胺素，盐酸吡哆醇，烟酸。
5.如权利要求1所述的辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，其特征在于：所述外植体的消毒处理方法为：花蕾在3-5℃冰箱中低温预处理2.5-4d后，加入3-5滴吐温80，置于流水中冲洗1.5-2.5h；再采用体积浓度为75%的酒精消毒13-20s，无菌水冲洗3-5次；再用体积浓度为0.1%的升汞消毒10-15min，最后用无菌水冲洗3-5次。
6.如权利要求1所述的辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，其特征在于：所述步骤二中，过滤过程中的滤布设置三层。
7.如权利要求1所述的辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，其特征在于：所述步骤四中，培养条件为：白天温度24-30℃，夜晚温度为16-24℃，接种密度为每100mm培养皿15个花药。
8.如权利要求1所述的辣椒花药培养中减轻外植体褐化的方法，其特征在于：所述外植体的母株在26.4±0.4℃温度条件下生长。
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