CN108522270B - 一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法 - Google Patents

一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法 Download PDF

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CN108522270B CN201810182069.9A CN201810182069A CN108522270B CN 108522270 B CN108522270 B CN 108522270B CN 201810182069 A CN201810182069 A CN 201810182069A CN 108522270 B CN108522270 B CN 108522270B
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Abstract

本发明公开了一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，该方法包括花药愈伤组织诱导培养、愈伤组织分化培养、丛生芽生根培养、组培苗壮苗培养基、炼苗、染色体加倍和移栽、倍性鉴定和利用分子标记检测病毒的脱毒率等步骤，在进行组织培养过程中采用特定的培养基，特定的培养基为在常规培养基配方上利用以海藻糖代替蔗糖并添加黑果枸杞汁过滤液营养成分配制出来的培养基，培养完成后采用利用分子标记技术进行脱毒鉴定。本发明显著提高脱毒率，操作简单，成本低，花培苗移栽后成活率高，抗逆性强，易于推广，可以直接应用于生产，有较好的经济效益和社会效益。

Description

一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法
技术领域
本发明涉及农作物育种技术领域，尤其涉及一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，通过花药培养途径进行高效脱毒，并用分子标记技术快速检测脱毒率。
背景技术
中国是世界上黄瓜栽培面积最大、总产量最高的国家。黄瓜任一病害的流行，都可能使品质下降、产量显著降低，严重时近乎绝产。化学防治虽然对真菌和细菌性病害有较好的防效，但对于病毒病至今仍缺乏高效药物。因此，黄瓜脱病毒苗的培育是十分重要的。
黄瓜病毒病是20世纪六、七十年代骤然爆发并逐渐在世界各地蔓延。近年来，在保护地栽培生产中黄瓜病毒病发生非常严重，且有日益加剧的趋势。温室黄瓜感染病毒后，产量将下降64％～85％。据研究报道黄瓜花叶病毒(CMV)和西瓜花叶病毒(WMV)是侵染我国华北黄瓜的主要病毒，侵染率高达96.94％和77.55％。番木瓜环斑病毒西瓜株系(CGMMV)是中国重要的农业植物检疫性有害生物。但是目前对于病毒病仍缺乏高效药物，因此，黄瓜脱病毒苗的培育显得尤为重要。
发明内容
本发明的发明原理：本发明主要利用特定的培养基来进行花药单倍体培养，能够显著提高花药单倍体的成功率，减少和消除CMV、WMV和CGMMV病毒，并用分子标记技术快速检测脱毒效率。
本发明所要解决的技术问题是：提供一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，将海藻糖、黑果枸杞汁过滤液和三十烷醇应用于培养中，可提高愈伤组织诱导率并生产健壮组培苗。脱毒苗用分子标记技术快速准确鉴定脱毒效果。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，包括以下步骤：
a.花药愈伤组织诱导培养：选取黄瓜花药长度0.2～0.3厘米的花蕾为外植体，将花蕾在4℃条件下处理4天；花蕾用流水冲洗10～20分钟，进行消毒后，从花蕾中选取花药，接种到愈伤组织诱导培养基中；
其中愈伤组织诱导培养基：三十烷醇0～3.0mg·L-1、2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)0.2～0.8mg·L-1和6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.3～0.7mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20～30g·L-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；
b.愈伤组织分化培养：将步骤a中培育的愈伤组织转移到分化培养基中，分化形成丛生芽；
其中愈伤组织分化培养基：三十烷醇1～3mg·L-1和6-BA 0.3～0.7mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20～30g·L-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；
c.丛生芽生根培养：将步骤b中高1.8～2.2cm的丛生芽转入生根培养基；
其中生根培养基：IBA(吲哚丁酸)0.2～1mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20～30g·L-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；
d.组培苗壮苗培养基：将步骤c中完整组培苗植株转入壮苗培养基；
其中壮苗培养基：IBA 0.1～0.5mg·L-1和IAA(吲哚乙酸)0.5～1.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20～30g·L-1，其余成分与1/2MS培养基一致，pH值为5.8；
e.炼苗、染色体加倍和移栽：逐步降低相对湿度、增强光照进行炼苗；7～10天后将小苗取出，清洗根部的培养基，用浓度为0.1～0.5％的秋水仙素浸泡根系36小时，进行染色体加倍，移栽到温室；
f.倍性鉴定：将步骤e中处理后的苗培养20天后，利用流式细胞仪，以正常二倍体(2n＝14)黄瓜为对照，剔除单倍体和多倍体植株，来获得纯合二倍体黄瓜植株；
g.利用分子标记检测病毒的脱毒率：根据改良的CTAB法提取组培黄瓜苗全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，引物序列如下：
CMV上游引物：TAATTACAGGCCCTTACCCGC
CMV下游引物：TGAGTGGGCAGAGTCGAGTC
WMV上游引物：CATTGAAAATGGAGTGACACTG
WMV下游引物：GCCAAAACCTGCATCGCAC
CGMMV上游引物：CGATGGCTTACAATCCGATCACAC
CGMMV下游引物：CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC
其中，PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸10min；10℃保存。其中，PCR仪为BIO-RAD公司的S1000Thermal Cycler。扩增产物用2％的琼脂糖检测，在紫外透射仪上观察、拍照。
优选的，所述的步骤a中消毒处理是在无菌条件下，用75％酒精消毒30秒，再用浓度为0.1％升汞消毒10分钟，无菌水冲洗3～4次。
优选的，所述的步骤a、b、c中的MS培养基成分为，大量元素：硝酸钾1900mg·L-1，硝酸铵1650mg·L-1，磷酸二氢钾170mg·L-1，硫酸镁370mg·L-1，氯化钙440mg·L-1；微量元素：碘化钾0.83mg·L-1，硼酸6.2mg·L-1，硫酸锰22.3mg·L-1，硫酸锌8.6mg·L-1，钼酸钠0.25mg·L-1，硫酸铜0.025mg·L-1，氯化钴0.025mg·L-1；铁盐：乙二胺四乙酸二钠37.3mg·L-1，硫酸亚铁27.8mg·L-1；有机成分为：肌醇100mg·L-1，甘氨酸2.0mg·L-1，盐酸硫胺素0.1mg·L-1，盐酸吡哆醇0.5mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1。
优选的，所述的步骤d中1/2MS基本培养基成份为：硝酸钾950mg·L-1，硝酸铵825mg·L-1，磷酸二氢钾85mg·L-1，硫酸镁185mg·L-1，氯化钙220mg·L-1；微量元素为：碘化钾0.83mg·L-1，硼酸6.2mg·L-1，硫酸锰22.3mg·L-1，硫酸锌8.6mg·L-1，钼酸钠0.25mg·L-1，硫酸铜0.025mg·L-1，氯化钴0.025mg·L-1；铁盐为：乙二胺四乙酸二钠37.3mg·L-1，硫酸亚铁27.8mg·L-1；有机成分为：肌醇100mg·L-1，甘氨酸2mg·L-1，盐酸硫胺素0.1mg·L-1，盐酸吡哆醇0.5mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1。
优选的，所述的黑果枸杞汁过滤液为新鲜采摘的完全成熟的黑果枸杞，或采摘后晾干的干黑果枸杞经过蒸馏水常温浸泡24～48小时得到的黑果枸杞，经过果蔬榨汁机榨汁得到汁液，再经过三层纱布过滤后得到的黑果枸杞汁过滤液。
优选的，所述的步骤a、b、c和d中的培养基为：愈伤组织诱导培养基：三十烷醇2mg·L-1、2,4-D 0.5mg·L-1、6-BA 0.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1、黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；愈伤组织分化培养基：三十烷醇3mg·L-1、6-BA0.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1、黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；生根培养基：IBA 0.2mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；壮苗培养基：IBA 0.5mg·L-1、IAA 1mg·L-1、海藻糖30g·L-1、黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与1/2MS培养基一致，pH值为5.8。
优选的，所述的步骤a、b、c和d中的培养条件为：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
优选的，所述的步骤c和步骤d中pH值用1％的NaOH或HCl来调节。
优选的，所述的步骤c和步骤d中培养基的灭菌的条件是121℃，20分钟。
优选的，上述的步骤b中用75％酒精消毒及其之后的操作均在无菌条件下进行。
优选的，上述的步骤b至步骤e中的操作均在无菌条件下进行。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明培养基中用海藻糖取代了传统培养基中的蔗糖，在为植物提供碳源和能源，调节渗透压的基础上，可以在培养物细胞表面形成独特的保护膜，对其体内多种生物活性物质起到非特异性保护作用，显著提高培养物抗逆性，一定程度上抵御培养过程中不利因素(包括不利渗透压、弱光、高湿等)对培养物的伤害，提高黄瓜花药培养的成功率，而蔗糖、葡萄糖等其它糖类，均不具备这一功能。
2、培养基中加入了黑果枸杞汁过滤液，而黑枸杞中氨基酸种类、矿质元素、花青素等相对较丰富：亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸等含量相对较高；果实所含的微量元素也很丰富，除常量元素Na、K、Mg、Ca、Fe之外，还含有一定量的微量元素Mn、Sr、Se、Zn、Cr、Cu等，由于微量元素对多种酶的活性和核酸、蛋白质的合成，对细胞增殖等具有直接或间接地作用；另外花青素具有深入细胞保护细胞膜不被自由基氧化的作用，具有强力抗氧化功能，促进了愈伤组织的形成。
3、优化生长促进剂用量。三十烷醇2.0mg·L-1，6-BA 0.5mg·L-1和2,4-D0.5mg·L-1。三十烷醇是天然生物产品，其可增强淀粉酶、多氧化酶、过氧化物酶活性；还能促进发芽、生根、增强抗寒、抗旱能力，和其它激素相比，加入三十烷醇可以促使愈伤组织变绿，并提高植株愈伤组织诱导率。三十烷醇与6-BA、2,4-D的结合，有效的促进了辣椒细胞生长、分化的能力，使得细胞生长速度快、组织代谢旺盛，抗逆性强。
4、提高病毒检测精确度和效率。
5、与传统的方法相比，本发明对3种病毒的脱毒效果显著高于常规方法。
具体实施方式
实施例1：
目前黄瓜花药培养存在诱导率低，重复性差等问题。本发明中采用植物生长促进剂三十烷醇和活性物质黑果枸杞汁过滤液，可显著提高黄瓜愈伤组织诱导率。具体步骤如下：
取黄瓜花药作为外植体，设4种不同培养基处理，各3次重复，各培养基处理生长促进剂成分用量及实验结果如表1。具体技术方案如下：
选取黄瓜花药长度0.2～0.3厘米的花蕾为外植体，将花蕾在4℃条件下处理4天。花蕾用流水冲洗10～20分钟，在无菌条件下，用75％酒精消毒30秒，再用浓度为0.1％升汞消毒10分钟，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中选取花药，接种到愈伤组织诱导培养基中。愈伤组织诱导培养基：三十烷醇0～3mg·L-1、2,4-D 0.5mg·L-1和6-BA 0.7mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
将大小为2～3毫米的愈伤组织转移到分化培养基中，分化形成丛生芽。愈伤组织分化培养基：三十烷醇2mg·L-1和6-BA 0.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
将高1.8～2.2厘米的丛生芽转入生根培养基。生根培养基：IBA0.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
将完整组培苗植株转入壮苗培养基。壮苗培养基：IBA 0.3mg·L-1、IAA0.3mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与1/2MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
逐步降低相对湿度、增强光照进行炼苗。7～10天后将黄瓜小苗取出，清洗根部的培养基，用浓度为0.1～0.5％秋水仙素浸泡根系36小时，进行染色体加倍，移栽到温室。
利用流式细胞仪，以正常二倍体(2n＝14)黄瓜为对照，剔除单倍体和多倍体植株，来获得纯合二倍体黄瓜植株。
利用分子标记技术快速检测CMV、WMV和CGMMV 3种病毒的脱毒率：根据改良的CTAB法提取组培黄瓜苗全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，引物序列如下：
CMV上游引物：TAATTACAGGCCCTTACCCGC
CMV下游引物：TGAGTGGGCAGAGTCGAGTC
WMV上游引物：CATTGAAAATGGAGTGACACTG
WMV下游引物：GCCAAAACCTGCATCGCAC
CGMMV上游引物：CGATGGCTTACAATCCGATCACAC
CGMMV下游引物：CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC
试验结果见表1：
表1三十烷醇对黄瓜花药愈伤组织形成的影响
Figure BDA0001589144760000071
试验结果表明：2号培养基对黄瓜愈伤组织形成最佳。在0～2mg·L-1随着三十烷醇使用量的增加，愈伤组织颜色由黄绿逐渐变为深绿，并显著提高愈伤组织诱导率。三十烷醇最佳用量2mg·L-1对愈伤组织诱导率是不添加三十烷醇的7.1倍；当使用量高于2mg·L-1，愈伤组织诱导率显著下降。3号培养基对愈伤组织的诱导率只有2号的33.8％。
实施例2：
培养基中影响黄瓜花药分化主要因素是生长调节剂。本发明中生长调节剂的优化，为其他植物组培提供借鉴。具体步骤如下：
取黄瓜花药作为外植体，设12种不同培养基处理，各3次重复，各培养基处理生长促进剂成分用量及实验结果如表2。具体技术方案如下：
选取黄瓜花药长度0.2～0.3厘米的花蕾为外植体，将花蕾在4℃条件下处理4天。花蕾用流水冲洗10～20分钟，在无菌条件下，用75％酒精消毒30秒，再用浓度为0.1％升汞消毒10分钟，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中选取花药，接种到愈伤组织诱导培养基中。愈伤组织诱导培养基：三十烷醇0～3mg·L-1、2,4-D 0.2～0.8mg·L-1和6-BA 0.3～0.7mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
将大小为2～3毫米的愈伤组织转移到分化培养基中，分化形成丛生芽。愈伤组织分化培养基：三十烷醇2mg·L-1和6-BA 0.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
将高为1.8～2.2厘米的丛生芽转入生根培养基。生根培养基：IBA 0.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
将完整组培苗植株转入壮苗培养基。壮苗培养基：IBA 0.3mg·L-1、IAA 0.3mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与1/2MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
逐步降低相对湿度、增强光照进行炼苗。7～10天后将黄瓜小苗取出，清洗根部的培养基，用浓度为0.1～0.5％秋水仙素浸泡根系36小时，进行染色体加倍，移栽到温室。
利用流式细胞仪，以正常二倍体(2n＝14)黄瓜为对照，剔除单倍体和多倍体植株，来获得纯合二倍体黄瓜植株。
利用分子标记技术快速检测CMV、WMV和CGMMV 3种病毒的脱毒率：根据改良的CTAB法提取组培黄瓜苗全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，引物序列如下：
CMV上游引物：TAATTACAGGCCCTTACCCGC
CMV下游引物：TGAGTGGGCAGAGTCGAGTC
WMV上游引物：CATTGAAAATGGAGTGACACTG
WMV下游引物：GCCAAAACCTGCATCGCAC
CGMMV上游引物：CGATGGCTTACAATCCGATCACAC
CGMMV下游引物：CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC
试验结果表明：三十烷醇2mg·L-1、6-BA 0.5mg·L-1和2,4-D 0.5mg·L-1的配比条件为最佳，使黄瓜花药愈伤组织的形态紧密、色泽深绿并且诱导率最高为38.2％(见试验结果表2)。
表2三十烷醇、6-BA和2，4-D配比优化
Figure BDA0001589144760000091
实施例3：
健壮的组培苗是影响炼苗成活率重要因数之一。本发明中的海藻糖和黑果枸杞汁过滤液对黄瓜愈伤组织诱导率和黄瓜组培苗壮苗指标都有显著提高。具体步骤如下：
取黄瓜花药作为外植体，设6种不同培养基处理，各3次重复，具体技术方案如下：
处理1：按本发明的方法进行黄瓜花药单倍体培养。
选取黄瓜花药长度0.2～0.3厘米的花蕾为外植体，将花蕾在4℃条件下处理4天。花蕾用流水冲洗10～20分钟，在无菌条件下，用75％酒精消毒30秒，再用0.1％升汞消毒10分钟，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中选取花药，接种到愈伤组织诱导培养基中。愈伤组织诱导培养基：三十烷醇2.0mg·L-1、2,4-D 0.5mg·L-1和6-BA 0.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
将培育的大小为2～3毫米愈伤组织转移到分化培养基中，分化形成丛生芽。愈伤组织分化培养基：三十烷醇3.0mg·L-1和6-BA 0.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
在丛生芽长至1.8～2.2厘米时转入生根培养基。生根培养基：IBA 0.2mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS基本培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
将完整组培苗植株将其转入壮苗培养基。壮苗培养基：IBA 0.5mg·L-1和IAA1.0mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与1/2MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
逐步降低相对湿度、增强光照进行炼苗。7～10天后将黄瓜小苗取出，清洗根部的培养基，用浓度为0.1～0.5％秋水仙素浸泡根系36小时，进行染色体加倍，移栽到温室。
利用流式细胞仪，以正常二倍体(2n＝14)黄瓜为对照，剔除单倍体和多倍体植株，来获得纯合二倍体黄瓜植株。
利用分子标记技术快速检测CMV、WMV和CGMMV 3种病毒的脱毒率：根据改良的CTAB法提取组培黄瓜苗全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，引物序列如下：
CMV上游引物：TAATTACAGGCCCTTACCCGC
CMV下游引物：TGAGTGGGCAGAGTCGAGTC
WMV上游引物：CATTGAAAATGGAGTGACACTG
WMV下游引物：GCCAAAACCTGCATCGCAC
CGMMV上游引物：CGATGGCTTACAATCCGATCACAC
CGMMV下游引物：CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸10min；10℃保存。其中，PCR仪为BIO-RAD公司的S1000Thermal Cycler。扩增产物用2％的琼脂糖检测，在紫外透射仪上观察、拍照。
处理2：将上述处理1提到的诱导培养基、分化培养基、生根培养基和壮苗培养基中30g·L-1海藻糖更换为蔗糖30g·L-1，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。
处理3：将上述处理1提到的诱导培养基、分化培养基、生根培养基和壮苗培养基中不添加黑果枸杞汁过滤液，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。
处理4：将上述处理1提到的诱导培养基、分化培养基、生根培养基和壮苗培养基中黑果枸杞汁过滤液20g·L-1更换为黑果枸杞汁过滤液30g·L-1，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。
处理5：将上述处理1提到的诱导培养基、分化培养基、生根培养基和壮苗培养基中30g·L-1海藻糖更换为蔗糖30g·L-1，不添加黑果枸杞汁过滤液，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。
处理6：将上述处理1提到的诱导培养基、分化培养基、生根培养基和壮苗培养基中30g·L-1海藻糖更换为蔗糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1更换为黑果枸杞汁过滤液30g·L-1，其它培养基成分及培养环境与处理1完全相同。试验的培养基变化情况及试验结果见表3和表4：
表3 6种不同培养基处理的比较
Figure BDA0001589144760000111
Figure BDA0001589144760000121
表4不同培养基对花培苗的影响
Figure BDA0001589144760000122
注：培养45天时，调查愈伤组织诱导率，愈伤组织诱导率＝(诱导愈伤组织外植体个数/接种外植体数)×100％；培养70天时，调查不定芽分化率，愈伤组织不定芽分化率＝(具有不定芽分化的愈伤组织块数/继代愈伤组织块数)×100％；将分化出芽的材料转移到生根培养基上诱导生根，培养20天时，测量组培苗株高株茎，目测观察根的生长情况，生根率＝(具有根系的组培苗/诱导生根组培苗总数)×100％；平均根数＝诱导生根组培苗出根总数/诱导生根组培苗个数；移栽后30天统计炼苗成活率，炼苗成活率＝(炼苗后成活的组培苗数目/炼苗组培苗总数)×100％。
试验结果表明：本发明中的海藻糖和黑果枸杞汁过滤液对黄瓜愈伤组织诱导率和黄瓜组培苗壮苗指标都有显著提高。30g·L-1海藻糖和20g·L-1黑果枸杞汁过滤液对黄瓜组培苗的培养效果最好(见表4)。
实施例4：
选取黄瓜花药长度0.2～0.3厘米的花蕾为外植体，将花蕾在4℃条件下处理4天。花蕾用流水冲洗10～20分钟，在无菌条件下，用75％酒精消毒30秒，再用0.1％升汞消毒10分钟，无菌水冲洗3～4次后，从花蕾中选取花药，接种到愈伤组织诱导培养基中。愈伤组织诱导培养基：三十烷醇2.0mg·L-1、2,4-D 0.5mg·L-1和6-BA 0.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
将培育的大小为2～3毫米愈伤组织转移到分化培养基中，分化形成丛生芽。愈伤组织分化培养基：三十烷醇3.0mg·L-1和6-BA 0.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
在丛生芽长至1.8～2.2厘米时转入生根培养基。生根培养基：IBA 0.2mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS基本培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
将完整组培苗植株将其转入壮苗培养基。壮苗培养基：IBA 0.5mg·L-1和IAA1.0mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与1/2MS培养基一致。培养条件：培养温度25～30℃，相对湿度80％，光照强度1500～2000勒克斯，光照每天8～12小时。
逐步降低相对湿度、增强光照进行炼苗。7～10天后将黄瓜小苗取出，清洗根部的培养基，用浓度为0.1～0.5％秋水仙素浸泡根系36小时，进行染色体加倍，移栽到温室。
利用流式细胞仪，以正常二倍体(2n＝14)黄瓜为对照，剔除单倍体和多倍体植株，来获得纯合二倍体黄瓜植株。
利用现有分子标记对组培苗CMV、WMV和CGMMV病毒的脱毒效果进行快速准确的检测，检测方法如下：
(1)改良CTAB法提取的黄瓜脱毒苗DNA。
(2)PCR反应体系(20μL体系)为：2×Taq Mix 10μL，1F(10μM)0.5μL，1R(10μM)0.5μL，DNA模板20～100ng，ddH2O补足体系。
CMV上游引物：TAATTACAGGCCCTTACCCGC
CMV下游引物：TGAGTGGGCAGAGTCGAGTC
WMV上游引物：CATTGAAAATGGAGTGACACTG
WMV下游引物：GCCAAAACCTGCATCGCAC
CGMMV上游引物：CGATGGCTTACAATCCGATCACAC
CGMMV下游引物：CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC
PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环；72℃延伸10min；10℃保存。其中，PCR仪为BIO-RAD公司的S1000Thermal Cycler。扩增产物用2％的琼脂糖检测，在紫外透射仪上观察、拍照。
试验结果表明：本发明利用分子标记技术对黄瓜花药培养苗进行检测，提高病毒检测精确度和效率。花药培养对CMV脱毒率达到93.56％、WMV脱毒率达到95.89％、CGMMV脱毒率达到94.93％(见试验结果表5)。由此可见，花药培养对黄瓜病毒CMV、WMV和CGMMV的脱毒效果显著高于种子脱毒和连续热处理茎尖培养脱毒。
表5本发明与常规方法对黄瓜主要病毒CMV、WMV和CGMMV脱毒效果
脱毒方法 CMV脱毒率 WMV脱毒率 CGMMV脱毒率
种子脱毒 40.23％ 54.64％ 46.27％
连续热处理茎尖培养 70.43％ 86.72％ 82.58％
花药培养 93.56％ 95.89％ 94.93％
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.一种基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.花药愈伤组织诱导培养
选取花蕾为外植体，在4℃条件下处理4天；流水冲洗，再进行消毒后，从花蕾中选取花药，接种到愈伤组织诱导培养基中；
其中愈伤组织诱导培养基：三十烷醇1.0～2.0mg·L-1、2,4-D 0.2～0.8mg·L-1、6-BA0.3～0.7mg·L-1、海藻糖30g·L-1、黑果枸杞汁过滤液20～30g·L-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；
b.愈伤组织分化培养
将步骤a中培育的愈伤组织转移到分化培养基中，分化形成丛生芽；
其中愈伤组织分化培养基：三十烷醇1～3mg·L-1、6-BA 0.3～0.7mg·L-1、海藻糖30g·L-1、黑果枸杞汁过滤液20～30g·L-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；
c.丛生芽生根培养
将步骤b中高1.8～2.2cm的丛生芽转入生根培养基；
其中生根培养基：IBA 0.2～1mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20～30g·L-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；
d.组培苗壮苗培养基
将步骤c中完整组培苗植株转入壮苗培养基；
其中壮苗培养基：IBA 0.1～0.5mg·L-1、IAA 0.5～1.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1、黑果枸杞汁过滤液20～30g·L-1，其余成分与1/2MS培养基一致，pH值为5.8；
e.炼苗、染色体加倍和移栽
逐步降低相对湿度、增强光照进行炼苗；然后用秋水仙素浸泡根系进行染色体加倍，移栽到温室；
f.倍性鉴定
将步骤e中得到苗培养20天后，进行倍性鉴定获得纯合二倍体植株；
g.利用分子标记检测病毒的脱毒率
提取组培黄瓜苗全基因组DNA，利用现有引物序列进行分子标记的检测，引物序列如下：
CMV上游引物：5＇-TAATTACAGGCCCTTACCCGC-3＇
CMV下游引物：5＇-TGAGTGGGCAGAGTCGAGTC-3＇
WMV上游引物：5＇-CATTGAAAATGGAGTGACACTG-3＇
WMV下游引物：5＇-GCCAAAACCTGCATCGCAC-3＇
CGMMV上游引物：5＇-CGATGGCTTACAATCCGATCACAC-3＇
CGMMV下游引物：5＇-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC-3＇。
2.如权利要求1所述的基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，其特征在于，所述步骤a中消毒处理是在无菌条件下，用75％酒精消毒30秒，再用浓度为0.1％升汞消毒10分钟，无菌水冲洗3～4次。
3.如权利要求1所述的基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，其特征在于，所述步骤a、b、c和d中的培养基为：愈伤组织诱导培养基：三十烷醇2mg·L-1、2,4-D0.5mg·L-1、6-BA 0.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1、黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；愈伤组织分化培养基：三十烷醇3mg·L-1、6-BA 0.5mg·L-1、海藻糖30g·L-1、黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；生根培养基：IBA 0.2mg·L-1、海藻糖30g·L-1，黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与MS培养基一致，pH值为5.8；壮苗培养基：IBA 0.5mg·L-1、IAA 1mg·L-1、海藻糖30g·L-1、黑果枸杞汁过滤液20g·L-1，其余成分与1/2MS培养基一致，pH值为5.8。
4.如权利要求1所述的基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，其特征在于，所述黑果枸杞汁过滤液为新鲜采摘的完全成熟的黑果枸杞，或采摘后晾干的干黑果枸杞经过蒸馏水常温浸泡24～48小时得到的黑果枸杞，经过果蔬榨汁机榨汁得到汁液，再经过三层纱布过滤后得到的黑果枸杞汁过滤液。
5.如权利要求1所述的基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，其特征在于，所述步骤e中染色体加倍处理为将炼苗7～10天后的小苗取出，清洗根部的培养基，用浓度为0.1～0.5％的秋水仙素浸泡根系36小时，进行染色体加倍。
6.如权利要求1所述的基于黄瓜花药培养提高脱毒率和炼苗成活率的方法，其特征在于，所述步骤f中的倍性鉴定为利用流式细胞仪，以正常二倍体黄瓜为对照，剔除单倍体和多倍体植株。
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