CN103070076B

CN103070076B - 一种花生离体诱变定向筛选耐盐体的方法

Info

Publication number: CN103070076B
Application number: CN201310045768.6A
Authority: CN
Inventors: 王晶珊; 李冠; 张丹丹; 隋炯明; 乔利仙; 赵明霞; 纪瑞瑞; 王鹏; 姜德锋; 郭宝太
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2033-02-05
Also published as: CN103070076A

Abstract

本发明提供了一种花生离体诱变定向筛选耐盐体的方法，主要步骤是将花生种胚表面消毒；分离胚小叶接种到添加2,4-D和平阳霉素的体胚诱导及诱变培养基中诱变培养处理；将成活的形成体胚的外植体转移到添加了BAP和NaCl的体胚萌发及筛选培养基上，进行定向筛选耐盐体。本发明利用离体诱变结合组织培养定向筛选耐盐体，可节省大量的人力、物力、财力；耐盐体的再生通过胚胎发生途径，体细胞胚起源于一个细胞，可避免耐盐体的嵌合性。本发明以花生成熟种子作为诱变材料可不受季节限制，操作方便，可以创造花生耐盐新种质，丰富花生遗传基础，克服因花生栽培种中缺乏高耐盐性种质资源而使得高产耐盐新品种选育难以突破的困难。

Description

一种花生离体诱变定向筛选耐盐体的方法

技术领域

本发明涉及花生离体诱变定向筛选方法，具体地说，是涉及一种花生离体诱变定向筛选耐盐体的方法。

背景技术

随着灌溉地和设施栽培面积的不断扩大，海水倒灌形成海滨滩涂，盐碱地有不断扩大的趋势，可利用的耕地资源逐年减少。盐渍土会影响植被生长，造成农作物减产或绝收，同时间接造成生态环境的恶化。

花生是我国重要的油料作物和经济作物之一，花生是一种抗旱耐瘠、适应性强的作物，在世界各地种植极其广泛，但花生不是耐盐作物。我国人均耕地面积少，保证粮食安全是农业生产的重中之重，近年粮食种植面积不断扩大，而花生种植面积增加的很少，与此同时我国尚有大面积的盐碱地和沿海滩涂地有待开发，因此筛选耐盐花生种质、培育耐盐花生品种具有重要的意义。然而花生栽培种中缺乏高耐盐的品种资源，靠杂交育种难以获得耐盐后代，因此高产耐盐品种的选育一直是一个难以解决的问题。诱变技术的利用能够产生自然界不存在的新性状、新类型，利用诱变与组织培养相结合进行定向筛选耐盐体，能节省人力、物力、财力，并且不受时间和空间限制。因此，离体诱变定向筛选耐盐体是获得耐盐新种质的有效手段。

近年来，极少数报道有关花生离体诱变研究，但离体诱变定向筛选耐盐体目前未见报道。

发明内容

本发明提供了一种花生离体诱变定向筛选耐盐体的方法，可以解决花生遗传基础狭窄、缺乏耐盐性品种资源、常规育种难以培育高产耐盐花生品种的问题。

为达到解决上述问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种花生离体诱变定向筛选耐盐体的方法，包括如下步骤：

(1)将颗粒饱满的花生种子去子叶后的种胚进行表面消毒;

(2)在无菌条件下分离所述种胚的胚小叶作为外植体，接种到体胚诱导及诱变培养基中，进行诱变培养27~30天，部分外植体形成体胚；所述体胚诱导及诱变培养基以MS培养基为基本培养基，并添加4~5mg/L平阳霉素和5~10mg/L2,4-D；

(3)将形成体胚的外植体转移至体胚萌发及筛选培养基上培养，进行耐盐定向筛选，得到耐盐苗；所述体胚萌发及筛选培养基以MS培养基为基本培养基，并添加15~20g/LNaCl和4~6mg/LBAP；

(4)在体胚萌发及筛选培养基上获得的耐盐苗生长至1.5～2.5cm时，便可进行无菌嫁接,，以耐盐苗为接穗，无菌萌发的花生实生苗为砧木，嫁接苗无菌培养3~4天后，移栽于育苗基质中，经驯化后移栽到田间。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(3)中采用加筛选压和不加筛选压各培养4w进行交替培养。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(3)中体胚萌发阶段的NaCl筛选浓度为15g/L，继代培养时NaCl抗逆筛选浓度为20g/L。

对上述技术方案的进一步改进：所述步骤(2)和(3)中培养基pH调整至5.8，培养条件为：培养室温度为25～27℃、光照强度为2000～3000Lx、光照时间为12～14h/d。

对上述技术方案的进一步改进所述步骤(4)中以苗龄11-13天的花生无菌苗为砧木，耐盐苗为接穗进行无菌嫁接。

对上述技术方案的进一步改进：所述体胚诱导及诱变培养基为MS+10mg/L2,4-D+4mg/L平阳霉素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；所述体胚萌发及筛选培养基为MS+4mg/LBAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+15g/L或20g/LNaCl。

对上述技术方案的进一步改进：所述驯化培养的条件为20~22℃，驯化室培养18～21天。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明以花生成熟种子胚的胚小叶为外植体，在基本培养基中添加4~5mg/L平阳霉素和5~10mg/L2,4-D（氯化苯氧乙酸类除草剂）进行诱变处理，形成体胚的外植体转移到添加15~20g/LNaCl和4~6mg/LBAP（6-苄氨基嘌呤）的培养基上促使体胚萌发成苗，同时进行定向筛选耐盐体。获得的耐盐体（NaCl耐性植株）经嫁接驯化后移栽田间，获得的成熟种子次年播种田间，与诱变亲本相比，大部分耐盐体M₂代植株发生明显变异和分离，部分单株结果数明显多于诱变亲本。耐盐体的M₃代种子盐胁迫下（0.7%NaCl溶液）发芽试验，30%以上发芽率极显著高于诱变亲本。SSR检测结果显示耐盐体的M₃代植株与诱变亲本的多态性很高，所有被检测植株都有4个以上位点不同于诱变亲本。

2、本发明以花生成熟种子作为诱变材料可不受季节限制，常年可以进行诱变处理和定向筛选，操作方便。可以创造花生耐盐新种质，丰富花生遗传基础，克服因花生栽培种中缺乏高耐盐性种质资源而使得高产耐盐新品种选育难以突破的困难。

3、利用离体诱变结合组织培养定向筛选耐盐体，筛选过程于培养基中进行，大量不具有耐盐性的培养材料被淘汰，可节省大量的人力、物力、财力；耐盐体的再生通过胚胎发生途径，体细胞胚起源于一个细胞，可避免耐盐体的嵌合性。

附图说明

图1表明本发明中NaCl对体胚萌发的影响，a：未添加NaCl的体胚萌发培养基；b：添加15g/LNaCl的体胚萌发培养基；c:添加20g/LNaCl的体胚萌发培养基。

图2表明本发明中继代培养时NaCl对体胚萌发成苗的影响，a：未添加NaCl的体胚萌发培养基；b：添加20g/LNaCl的体胚萌发培养基；c：添加25g/LNaCl的体胚萌发培养基。

图3是本发明中花育22号胚小叶离体诱变、耐盐定向筛选、耐盐苗（体）嫁接及结实；a：在添加4mg/LPYM的诱导培养基上形成的体胚及褐化愈伤组织；b：在添加15g/LNaCl的体胚萌发培养基上成活的萌发体胚及褐化愈伤组织；c：先后在添加15g/LNaCl和20g/LNaCl的体胚萌发培养基上筛选成活的耐盐小苗；d：嫁接的耐盐苗；E：耐盐苗结果。

图4是本发明中花育22号胚小叶离体诱变及NaCl定向筛选获得的耐盐体M₂代表型及其分离情况；a：13号耐盐体后代苗期植株大小分离（播种6w）；b：27号耐盐体后代株高明显分离（播种9w）；c：10号耐盐体后代的其中1株突变为密枝、半匍匐型、交替开花（播种9w）；d：诱变亲本花育22号株型直立、连续开花（播种9周）。

图5是本发明中诱变亲本花育22号和耐盐体M₂代植株结果（M₃代荚果）及分离情况；a、花育22号和27号耐盐体M₂代田间植株及结果，其中27-2突变为密枝、结果多；b：花育22号荚果和27号耐盐体后代表现的荚果大小、果型分离，27-2结果多；c：10号耐盐体后代荚果突变为串珠形，花育22号果型为普通型；d：10号耐盐体后代种皮突变为紫色，花育22号种皮为粉红色；e：21号耐盐体后代荚果形状、大小明显变异和分离；f：5号耐盐体后代荚果形状、大小明显变异和分离（荚果图片右下角为诱变亲本花育22号-Huayu22）。

图6是本发明中花育22号及耐盐体M₃代种子在0.7%NaCl溶液中催芽7d后发芽情况；a：诱变亲本花育22号；b：10号耐盐体M₃代种子；c：24号耐盐体M₃代种子。

图7是本发明中花育22号和11个耐盐体M₃代SSR电泳图；

引物对为PM348；CK：诱变亲本花育22号；其他为耐盐体的M₃代。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本发明所述花生离体诱变定向筛选耐盐体的方法具体包括如下步骤：

1、培养基的制备

（1）制备体胚诱导及诱变培养基：选取MS培养基为基本培养基，在此MS培养基中添加平阳霉素和2,4-D形成体胚诱导及诱变培养基。平阳霉素的添加量为4~5mg/L，2,4-D的添加量为5~10mg/L。本实施例中体胚诱导培养基为MS+10mg/L2,4-D+4mg/L平阳霉素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；将所述体胚诱导及诱变培养基的pH调至5.8，在培养室温度为25~27℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～14h的条件下进行培养。诱变和体胚诱导同时进行。

平阳霉素（PYM）是一种抗生素，属于博莱霉素的一类，是博莱霉素的A5组分，它作为诱变剂具有安全、高效、诱变频率高、范围大等特点。2,4-D是一种氯化苯氧乙酸类除草剂，也可用作植物生长调节，是用于诱导愈伤组织形成的常用生长素，在本发明中用来诱导体胚形成。

（2）制备体胚萌发及筛选培养基：选取MS培养基为基本培养基，在此MS培养基中添加NaCl和6-苄氨基嘌呤（BAP）形成体胚萌发及耐盐定向筛选培养基，NaCl的添加量为15～20g/L，BAP的添加量为4~6mg/L。本实施例中体胚萌发及筛选培养基为MSB5+15～20g/LNaCl+4mg/LBAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，将所述体胚萌发及筛选培养基的pH调至5.8，在培养室温度为25~27℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～14h的条件下进行培养。耐盐定向筛选和体胚萌发同时进行。

2、NaCl筛选浓度的确定

以NaCl作为耐盐筛选压力添加于培养基中进行定向筛选耐盐体。

外植体材料为目前广泛推广栽培的花生品种花育22号，选取籽粒饱满的种子去子叶后的种胚作为试验材料。

花生各个生长发育时期对逆境的耐受性不同。同理，组织培养条件下各阶段对逆境胁迫的耐受程度亦不同。以NaCl模拟逆境条件，添加于培养基中进行定向筛选耐盐体，研究了花生胚小叶组织培养通过体细胞胚胎发生途径再生植株的二个不同阶段中NaCl的最佳筛选浓度。处理Ⅰ，在未添加平阳霉素的体胚诱导培养基上形成体胚的外植体转移到体胚萌发培养基上培养，体胚萌发培养基中添加0,10,15,20,25g/LNaCl；处理Ⅱ，在未添加NaCl的体胚萌发培养基上获得的已经萌发的体胚丛，转移到新鲜的体胚萌发培养基上培养，培养基中添加0,15,20,25,30g/LNaCl。

处理Ⅰ，在未添加平阳霉素的诱导培养基上形成体胚的外植体转移到添加NaCl（0,10,15,20,25g/L）的体胚萌发培养基上进行培养。培养4w后试验结果如图1所示，从图1中可以看出，在未添加NaCl的体胚萌发培养基上（图1a所示），体胚萌发正常；在添加15g/LNaCl的体胚萌发培养基上（图1b所示），体胚虽没有完全致死，但是已严重抑制其生长；在添加20g/LNaCl的体胚萌发培养基上（图1c所示）体胚完全褐化死亡。因此，以15g/LNaCl作为此培养阶段的耐盐筛选浓度。

处理Ⅱ，在体胚萌发阶段不进行耐盐筛选，而进行正常的培养。胚小叶外植体在未添加平阳霉素的诱导培养基上培养4w后形成体胚丛，将形成体胚丛的外植体转移到未添加NaCl的体胚萌发培养基上再培养4w，大部分体胚萌发。然后将已萌发的体胚丛转移到新鲜的体胚萌发培养基上进行继代培养，培养基中添加0,15,20,25,30g/LNaCl。4w后试验结果如图2所示，从图2中可以看出，在未添加NaCl的培养基上（图2a所示），体胚萌发长成的小苗生长正常；在添加20g/LNaCl的培养基上（图2b所示），由体胚萌发长成的小苗生长严重受到抑制；在添加25g/LNaCl的体胚萌发培养基上（图2c）体胚萌发长成的小苗完全褐化死亡。因此，以20g/LNaCl作为此培养阶段的耐盐筛选浓度。

3、平阳霉素诱变处理

以花育22号种子胚小叶为诱变培养材料，以平阳霉素（PYM）作为诱变剂，添加于体胚诱导培养基中进行诱变处理。

选取籽粒饱满的花育22号种子去子叶，将种胚置于75%的酒精浸泡20s，再用0.1%的升汞浸泡10min，进行表面消毒，用无菌水漂洗5次后，置于装有无菌水的广口瓶中浸泡10～14h。取出经表面消毒浸泡好的种胚，置于无菌培养皿中分离胚小叶，然后接种到添加4mg/LPYM和10mg/L2,4-D的体胚诱导及诱变培养基上培养4w，进行诱变处理及诱导体胚的形成。

花育22号种子胚小叶培养在添加4mg/LPYM的诱导培养基上进行诱变处理。培养10d后，外植体开始形成乳白色愈伤组织，培养4w，约50%的愈伤组织逐渐褐化或者形成玻璃化愈伤组织，另有部分能够形成体胚，如图3a所示。

4、NaCl耐性苗的定向筛选

诱变培养4w后，将形成体胚的外植体转移到体胚萌发培养基上促使体胚萌发，并进行定向筛选耐盐体。利用上述确定的NaCl筛选浓度，进行定向筛选耐盐体。首先在体胚萌发培养基中添加15g/LNaCl，继代培养时增加到20g/L。为避免筛选的培养材料生长过慢或褐变，在体胚萌发培养基上筛选时，采用加筛选压和不加筛选压各培养4w进行交替培养。

具体为：将形成有体胚的外植体转移至体胚萌发及筛选培养基上进行耐盐定向筛选及体胚萌发培养。首先选用添加15g/LNaCl的筛选培养基，培养4周后，大部分外植体及体胚死亡，仅有少数存活，如图3b所示。经筛选成活的带有体胚的外植体转移到无筛选压的体胚萌发培养基上培养4周，使其恢复生长，接触培养基的部分形成大量绿色致密的愈伤组织。之后再转移到添加20g/LNaCl的筛选培养基上。筛选培养4周后，再转移到无筛选压的培养基上培养4周，再用添加20g/LNaCl的培养基筛选，如此交替进行，直至成苗，如图3c所示，最终获得了花育22号耐盐苗（体）。

5、耐盐体的嫁接与移栽

上述筛选获得的耐盐体生长至1.5~2.5cm时，从基部切下作为接穗，以无菌萌发11~13天的花生实生苗为砧木在超净台内进行无菌嫁接，如图3d所示。嫁接苗无菌培养3~4天后，移栽于育苗基质中，在驯化室培养18～21天后，移栽田间。移栽初期搭遮荫网，根据需要浇水保持土壤湿度。2~3周嫁接苗成活后，撤去遮荫网，按常规田间管理。成熟后分单株收获荚果，共有26株耐盐体得到了M₂代种子。如图3e所示。

6、耐盐体M₂代表型变异和分离情况

2012年将单株收获的种子（M₂代）播种于大田，以诱变亲本花育22号作对照。苗期、生长发育期及成熟收获后观察结果显示，26个耐盐体的后代（M₂代）中，23个耐盐体的后代在生长势、株型、开花习性，荚果形状、种皮颜色等方面与诱变亲本不同，明显表现出变异及性状发生分离。

苗期大部分耐盐体后代的小苗生长势、棵大小明显表现出分离，有的单株生长发育慢，开花较晚，如图4a所示，之后有的植株高矮也有明显差异，如图4b所示。10号耐盐体后代的其中2株突变为交替开花、半匍匐型，如图4c所示。27号耐盐体后代的其中1株（27-2）突变为密枝，总分枝数22条，同一植株后代的其他单株总分枝数5~10条不等，如图5a所示。而诱变亲本花育22号株型直立、疏枝，连续开花，总分枝数11~12条，如图4d和图5a所示。

荚果性状观察结果显示，耐盐体后代荚果有的变大，而大部分荚果变小。27号耐盐体的后代之间不但分枝数存在明显差异，并且单株结果数和荚果大小也存在明显差异，其中27-2单株结果数明显多于同一植株后代的其他单株结果数，也明显比诱变亲本花育22号单株结果数多，如图5a和图5b所示。10号耐盐体的后代除株型和开花习性明显变异和分离外，荚果形状均突变为串珠形，每个荚果3-4粒种子，种皮颜色均突变为紫红色，如图5c和图5d所示。其他耐盐体的后代荚果有的突变为葫芦形，有的(蚕)茧形，还有的蜂腰形，如图5e和图5f所示。而诱变亲本花育22号荚果为普通形，双仁果（每个荚果2粒种子），种皮粉红色，如图5所示（图5d的右边及图5b、c、e、f右下方为花育22号）。

7、耐盐体后代的耐盐性鉴定

选取耐盐体后代(M3)和诱变亲本花育22号籽粒饱满的种子进行耐盐鉴定。以0.7%NaCl作为盐胁迫，设3次重复，每重复约15粒种子。首先用0.7%NaCl溶液浸泡8h，然后倒掉浸泡液，将种子放于培养皿中，培养皿底部和上部各放1张滤纸，加适量0.7%NaCl溶液，之后每天更换同样溶液。以蒸馏水作为空白对照，每个材料也均设3次重复。试验在25~27℃，每日13h光照条件下进行。处理7天后调查统计发芽率。以胚根长大（等）于种子长为发芽标准。

盐胁迫处理处理7d后统计发芽率，结果表明，盐胁迫下参试的18个耐盐体的后代中，10号、24号、19号、20号、6号、2号耐盐体M3代种子的发芽率均极显著高于亲本，特别是10号和24号耐盐体M3代种子的发芽率均超过50%，而诱变亲本花育22号种子发芽率仅为6.7%，如图6和表1所示。以蒸馏水为空白对照情况下，18个耐盐体M3代种子及诱变亲本花育22号种子发芽率均在88%以上，各材料之间无显著性差异，如表2所示。结果说明，盐胁迫情况下种子发芽率的差异是由于其对盐胁迫的反应不同所致，并非种子质量（种子本身发芽率）的区别。

表1耐盐体M3代种子及花育22号种子在0.7%NaCl盐溶液中催芽7天的发芽率(Duncan新复极差法)

表2耐盐体M3代种子及花育22号种子在蒸馏水中催芽7天的发芽率(Duncan新复极差法)

8.耐盐体的SSR检测

随机选择19个耐盐体的M₃代种子催芽，2~3周后提取叶片总DNA，利用39对SSR引物对进行检测分析DNA变异，如图7所示。其中有11对引物的扩增产物能够揭示突变材料与原品种间的多态性，且19个被检测的材料均呈现4个以上位点突变，如表3所示。由表3可以看出，和诱变亲本花育22号相比较，SSR标记多态性的具体表现形式有:扩增片段数目减少(标记为A)；扩增片段数目增加(标记为B)；扩增片段长度差异(标记为C)。A、B、C这三种形式所占比例分别是32.08%、9.43%、58.49%。表明PYM诱变可使花生的DNA分子多个区段内发生突变。其中在盐胁迫下发芽率极显著高于亲本的10号、24号、19号、20号、6号和2号均检测出4个以上位点不同于诱变亲本，说明这些材料的耐盐性提高是由于基因突变的原因；27-2也检测出7个位点不同于亲本，说明27-2单株荚果数比亲本明显增多也是由于基因突变的原因。

表3耐盐体M3代和诱变亲本花育22号SSR多态分析

本发明利用安全、高效的PYM作为诱变剂进行花生离体诱变，以NaCl作为筛选压力，获得的耐盐体经嫁接移栽田间，26个耐盐体获得了成熟种子。次年按单株播种，其中23个耐盐体后代发生变异和分离。对耐盐体M₃代种子盐胁迫下进行发芽试验，参试的18个耐盐体的后代中，6个耐盐体的M₃代种子发芽率极显著高于诱变亲本。利用SSR方法检测分析DNA变异，被测的19个耐盐体的后代均检测出4个以上位点不同于诱变亲本，并且6个耐盐性极显著提高的耐盐体的后代均检测出4个以上位点不同于诱变亲本，说明这些材料的耐盐性提高是由于基因突变的原因；另外27号耐盐体M₂代的其中1个单株（27-2）单株结果数明显多于诱变亲本，也检测出7个位点不同于亲本，说明27-2单株荚果数比亲本明显增多也是由于基因突变的原因。

Claims

1.一种花生离体诱变定向筛选耐盐体的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)将颗粒饱满的花生种子去子叶后的种胚进行表面消毒；(2)在无菌条件下分离所述种胚的胚小叶作为外植体，接种到体胚诱导及诱变培养基中，进行诱变培养27~30天，部分外植体形成体胚；所述体胚诱导及诱变培养基为MS+10mg/L2,4-D+4mg/L平阳霉素+30g/L蔗糖+8g/L琼脂；(3)将形成体胚的外植体转移至体胚萌发及筛选培养基上培养，进行耐盐定向筛选，得到耐盐苗；所述体胚萌发及筛选培养基为MS+4mg/LBAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂+15g/L或20g/LNaCl；(4)在体胚萌发及筛选培养基上获得的耐盐苗生长至1.5～2.5cm时，进行无菌嫁接，以耐盐苗为接穗，无菌萌发的花生实生苗为砧木，嫁接苗无菌培养3~4天后，移栽于育苗基质中，经驯化后移栽到田间；所述步骤(3)中采用加筛选压和不加筛选压各培养4w进行交替培养；所述步骤(3)中体胚萌发阶段的NaCl筛选浓度为15g/L，继代培养时NaCl抗逆筛选浓度为20g/L；所述步骤(2)和(3)中培养基pH调整至5.8，培养条件为：培养室温度为25～27℃、光照强度为2000～3000Lx、光照时间为12～14h/d；所述花生品种为花育22号。

2.根据权利要求1所述的花生离体诱变定向筛选耐盐体的方法，其特征在于：所述步骤(4)中以苗龄11-13天的花生无菌苗为砧木，耐盐苗为接穗进行无菌嫁接。

3.根据权利要求1所述的花生离体诱变定向筛选耐盐体的方法，其特征在于：所述驯化培养的条件为20~22℃，驯化室培养18～21天。