CN112616673B - 一种用于花生耐盐体筛选的培养基以及筛选花生耐盐体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于花生耐盐体筛选的培养基以及筛选花生耐盐体的方法，属于花生抗逆性育种技术领域。本发明用于花生耐盐体筛选的培养基，包括体胚诱导培养基和体胚萌发及耐盐定向筛选培养基；其中，所述体胚萌发及耐盐定向筛选培养基中添加有终浓度为15g/L的NaCl。采用本发明的培养基进行花生耐盐体的筛选，有利于加快育种进程，提高耐盐体的存活率，节省大量的人力、物力、财力。

Description

一种用于花生耐盐体筛选的培养基以及筛选花生耐盐体的 方法
技术领域
本发明属于花生抗逆性育种技术领域，具体涉及一种用于花生耐盐体筛选的培养基以及筛选花生耐盐体的方法。
背景技术
花生是重要的油料作物和经济作物，在我国农业生产乃至整个国民经济中具有重要地位。盐碱等非生物胁迫抑制了花生的生长，导致植株萎蔫、荚果产量降低、品质变劣。随着环境的不断恶化，盐碱等逆境胁迫已经成为世界性的问题，培育具有多种抗逆性的作物新品种已成为广大育种家研究的主要目标之一。然而花生缺乏耐盐资源，利用常规杂交方法难以选育出耐盐品种。
因此高产耐盐品种的选育一直是一个难以解决的问题。花生耐盐体在正常花生中的发生率极低，因而为了筛选获得耐盐苗，则需要建立足够大的样本；大的筛选群体则会带来大量的人力、物力和财力的消耗。因而，亟需一种可以加快育种进程，降低人力、物力和财力的花生耐盐体的筛选方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种用于花生耐盐体筛选的培养基以及筛选花生耐盐体的方法，有利于花生耐盐性品种的筛选，加快育种进程，提高耐盐体的存活率。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于花生耐盐体筛选的培养基，包括体胚诱导培养基和体胚萌发及耐盐定向筛选培养基；
所述体胚诱导培养基是在MS培养基中添加2,4-D，使其终浓度为6mg/L；
所述体胚萌发及耐盐定向筛选培养基是在MS培养基中添加NaCl和6-苄氨基嘌呤，且使NaCl和6-苄氨基嘌呤的终浓度分别为15g/L、5mg/L。
一种筛选花生耐盐体的方法，使用上述培养基进行筛选。
在上述方案的基础上，所述筛选花生耐盐体的方法，步骤如下：
(1)选取籽粒饱满的花生种子，去子叶保留种胚，将种胚用蒸馏水浸泡10-12小时；
(2)将浸泡后的种胚置于75％的酒精浸泡20s，再用0.1％的升汞浸泡l0min，进行表面消毒，用无菌水漂洗5次；
(3)将经表面消毒的种胚，置于无菌培养皿中分离胚小叶，然后接种到添加体胚诱导培养基上培养4w，诱导体胚的形成；
(4)将形成体胚的外植体转移到体胚萌发及耐盐定向筛选培养基中促使体胚萌发，并进行定向筛选耐盐体，直至成苗；
(5)无菌嫁接后进行移栽
待筛选获得的耐盐体生长至2cm，从基部切下作为接穗，以无菌萌发11-13天的花生实生苗为砧木进行无菌嫁接；嫁接苗无菌培养4天后，移栽于育苗基质中，然后放置到人工气候室内，温度为19～23℃、光照强度为1500～2000Lx，湿度为80-90％。
本发明技术方案的优点：
花生耐盐体在正常花生中的发生率极低，因而为了筛选获得耐盐苗，则需要建立足够大的样本；大的筛选群体则会带来大量的人力、物力和财力的消耗。
本发明利用组织培养定向筛选耐盐体，在培养基中添加NaCl进行筛选，本发明所采用的NaCl浓度适宜，对体胚的萌发具有一定的抑制作用，而又不会完全抑制导致体胚死亡；该筛选方法可以在育种的早期进行筛选，培育成苗的样本量，可节省大量的人力、物力、财力。
此外，本发明将筛选获得的耐盐体嫁接与实生苗砧木上，再放于人工气候室内培养可以大大提高耐盐体的成活率到98％以上
附图说明
图1本发明中NaCl对体胚萌发的影响，A为未添加NaCl的体胚萌发培养基；B为添加15g/L NaCl的体胚萌发及耐盐定向筛选培养基；C为胚小叶在添加15g/L NaCl体胚萌发及耐盐定向筛选培养基上，经筛选成活的耐盐苗；
图2本发明中鲁花11号及耐盐体后代种子在0.7％NaCl溶液中的发芽情况；A为亲本鲁花11号种子；B为耐盐体后代种子。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
一种筛选花生耐盐体的方法，步骤如下：
(1)选取籽粒饱满的鲁花11号种子，去子叶保留种胚，将种胚用蒸馏水浸泡10-12小时；
(2)将浸泡处理后的种胚置于75％的酒精浸泡20s，再用0.1％的升汞浸泡l0min,进行表面消毒，用无菌水漂洗5次；
(3)取出经表面消毒的种胚，置于无菌培养皿中分离胚小叶，然后接种到添加6mg/L 2,4-D的体胚诱导培养基上培养4w，诱导体胚的形成。
其中，所述体胚诱导培养基为添加6mg/L 2,4-D的MS培养基，pH为5.8；培养室温度为25-27℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～14h的条件下进行培养。
(4)将形成体胚的外植体转移到体胚萌发及耐盐定向筛选培养基中促使体胚萌发，并进行定向筛选耐盐体，直至成苗，如图1C所示，最终获得了鲁花11号NaCl耐盐苗。
其中，所述体胚萌发及耐盐定向筛选培养基为添加15g/L NaCl和5mg/L 6-苄氨基嘌呤(BAP)的MS培养基，pH值为5.8。在培养室温度为25-27℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～14h的条件下进行培养。耐盐定向筛选和体胚萌发同时进行。
(5)NaCl耐性苗的嫁接与移栽
待上述筛选获得的耐盐体生长至2cm左右时，从基部切下作为接穗，以无菌萌发11-13天的花生实生苗为砧木在超净台内进行无菌嫁接。嫁接苗无菌培养4天后，移栽于育苗基质中，然后放置到人工气候室内，温度为19～23℃、光照强度为1500～2000Lx，湿度为80-90％，可提高移栽成活率(98％以上)。
对比例1
采用不添加NaCl的培养基作为体胚萌发及耐盐定向筛选培养基，其他条件与实施例1相同。
对比例1与实施例1的外植体在体胚萌发及耐盐定向筛选培养基上的生长情况分别如图1A和1B所示；从图1中可以看出，在未添加NaCl的体胚萌发培养基上(图lA所示)，体胚萌发正常；在添加15g/L NaCl的体胚萌发培养基上(图lB所示)，体胚虽没有完全致死，但是已严重抑制其生长，因此，以15g/L NaCl作为此培养阶段的耐盐筛选浓度。
NaCl耐性苗后代的耐盐性测定
选取筛选的NaCl耐性苗后代和亲本鲁花11号籽粒饱满的种子进行耐盐鉴定。以0.7％NaCl作为盐胁迫，设2次重复，每个重复30粒种子。用0.7％NaCl溶液浸泡8h，然后倒掉浸泡液，将种子放于培养皿中，培养皿底部和上部各放1张滤纸，加适量0.7％NaCl溶液，之后每天更换同样溶液。培养条件为25-27℃，12h光照/12h黑暗。处理7天后调查统计发芽率，以胚根长大(等)于种子长为发芽标准。如图2所示，亲本鲁花11号种子在0.7％NaCl溶液中的发芽率为6.7％，而经NaCl定向筛选获得的耐性苗后代种子在0.7％NaCl溶液中的发芽率可以达到40.0％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (1)

1.一种筛选花生耐盐体的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)选取籽粒饱满的花生种子，去子叶保留种胚，将种胚用蒸馏水浸泡10-12小时；
(2)将浸泡后的种胚置于75％的酒精浸泡20s，再用0.1％的升汞浸泡l0min，进行表面消毒，用无菌水漂洗5次；
(3)将经表面消毒的种胚，置于无菌培养皿中分离胚小叶，然后接种到添加体胚诱导培养基上培养4w，诱导体胚的形成；所述体胚诱导培养基是在MS培养基中添加2,4-D，使其终浓度为6mg/L；
(4)将形成体胚的外植体转移到体胚萌发及耐盐定向筛选培养基中促使体胚萌发，并进行定向筛选耐盐体，直至成苗；所述体胚萌发及耐盐定向筛选培养基是在MS培养基中添加NaCl和6-苄氨基嘌呤，且使NaCl和6-苄氨基嘌呤的终浓度分别为15g/L、5mg/L；
(5)无菌嫁接后进行移栽，具体为：待筛选获得的耐盐体生长至2cm，从基部切下作为接穗，以无菌萌发11-13天的花生实生苗为砧木进行无菌嫁接；嫁接苗无菌培养4天后，移栽于育苗基质中，然后放置到人工气候室内，温度为19～23℃、光照强度为1500～2000Lx，湿度为80-90％。
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