CN109156352A - 一种花生突变体的快速筛选方法及应用 - Google Patents

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CN109156352A CN201811173302.3A CN201811173302A CN109156352A CN 109156352 A CN109156352 A CN 109156352A CN 201811173302 A CN201811173302 A CN 201811173302A CN 109156352 A CN109156352 A CN 109156352A
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王晶珊
禹山林
乔利仙
隋炯明
杨庆利
李冠
赵明霞
姜德锋
郭宝太
朱虹
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    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
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    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture

Abstract

本发明公开了一种花生突变体的快速筛选方法及应用，属于花生育种领域。本发明花生突变体的快速筛选方法，是对花生离体诱变获得的再生苗，采用SSR方法进行基因型上的突变性鉴定，淘汰基因型未突变的再生苗，鉴定的基因型突变的再生苗即为花生突变体。本发明对组培苗的突变性进行鉴定方法简单，能够有效淘汰未突变的再生苗，节省未突变再生苗嫁接移栽及后续突变性鉴定的无效劳动，从而节省人力物力财力。通过SSR方法筛选花生基因型突变体结合子代性状筛选方法，能够缩短育种时间2‑3年。对于一些表型无明显变异，但品质性状发生变异的突变体，能通过SSR方法也能鉴定出。

Description

一种花生突变体的快速筛选方法及应用
技术领域
本发明属于花生育种领域，具体涉及一种花生突变体的快速筛选方法及应用。
背景技术
花生是我国重要的油料作物和经济作物之一，培育高产优质专用多抗性新品种是目前花生重要的育种目标。然而，花生栽培种遗传多样性较低，缺乏高抗、高油、耐盐、高产性的优良品种资源，因此依靠杂交育种难以获得突破性进展。诱变技术的应用可促进花生种质资源创新和加速品种改良进程，因为诱变育种可以诱导产生自然界不存在的或极为罕见的新性状、新类型。但常规诱变育种技术，往往突变体嵌合性严重，因为突变是单细胞行为，因此造成很多性状不能稳定遗传，尤其是一些隐性突变往往被掩盖。并且花生种子较大，在物理辐照时往往处理的种子较少，并且常以半致死量为适宜的诱变剂量，也即辐照处理的种子约一半不能正常发芽生长，因此达不到育种的选择群体，因为诱变育种往往需要足够大的群体才能获得有益突变体。诱变与组织培养相结合，可以得到丰富的变异体，提高变异频率，增加选择几率；克服突变体的嵌合性，提高变异性状的稳定性，隐性突变可充分表现。但在诱变结合组织培养的离体诱变中，可获得大量再生苗，包括突变的及未突变的再生苗。再生苗需经过嫁接、驯化炼苗才能移栽田间，程序复杂，需花费大量人力物力财力。并且移栽田间后获得的种子，第二年播种田间(M2代)，生育期间及收获后才能观察到表型明显变异的材料，而品质性状的变异需要各种测试，如含油率、蛋白含量、脂肪酸含量、各种糖分含量等。因此，离体诱变中突变体的常规鉴定，从诱变开始到可进行变异鉴定需要2～3年时间，不但时间长，并且各个阶段工作量大，需耗费大量人力物力财力。
目前，SSR方法在花生农艺性状标记上(周金超、杨鑫雷、崔顺立等，花生SSR标记与农艺性状的相关性，作物学报，2014，40(7)：1197-1204)，花生SSR指纹图谱构建及遗传多样性分析(胡晓辉、毛瑞喜、苗华荣等，山东省46个花生品种SSR指纹图谱构建及遗传多样性分析，核农学报，2016，30(10)：1925—1933)等方面有利用。苗华荣等(苗华荣、胡晓辉、崔凤高等，花生辐照后M2代突变材料的SSR分析，核农学报，2012,24(4)：680-683)对花生种子辐照后，表型明显变异的M2代突变材料进行SSR分析，结果表明突变体的DNA分子有重复或缺失等结构性变异。但利用SSR方法进行突变体筛选(鉴定)，尚未见报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明针对离体诱变获得的再生苗，即试管苗，采用SSR方法进行突变性鉴定，淘汰基因型未突变的再生苗，突变的再生苗经嫁接炼苗移栽田间，采用如此方法，花生育种可节省大量人力物力财力。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种花生突变体的快速筛选方法，步骤为：
(1)提取诱变亲本花生品种和诱变后再生苗叶片的全基因组DNA，进行SSR的PCR扩增；
(2)对比诱变亲本花生和诱变后再生苗的SSR扩增结果，选择扩增结果呈现多态性的再生苗即为花生突变体，淘汰基因型未突变的再生苗。
在上述方案的基础上，所述扩增结果呈现多态性是指扩增片段减少、扩增片段增加或扩增片段长度差异。
在上述方案的基础上，所述SSR的PCR扩增结果的检测方法为：
将扩增产物在8％非变性PAGE凝胶上电泳，电泳缓冲液位1×TBE，每个点样孔加1.5μL样品，200伏恒电压下电泳约90分钟，电泳结束后，进行银染检测。
在上述方案的基础上，
所述SSR的PCR扩增体系为：模板1.5μL，Taq酶0.2μL，10×Taq buffer 7.5μL，正反向引物各0.6μL，ddH2O 4.6μL；
所述SSR的PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性13min，55℃退火1min，72℃延长90s，34个循环；72℃延长10min。
上述花生突变体的快速筛选方法在花生育种上的应用。
一种花生快速育种方法，步骤如下：
(1)选择颗粒饱满的花生种子进行诱变育种；
所述的诱变育种可以是快中子辐照或高能混合粒子场辐照处理，其中，辐照剂量为9.7Gy～18.0Gy或67Gy～105Gy；
(2)经辐照处理的花生种子去子叶，取种胚，对种胚进行表面消毒处理；
(3)将消毒后的种胚置于无菌水中浸泡10～14h后，分离浸泡处理后种胚的胚小叶；
(4)将胚小叶作为外植体置于添加10mg/L 2,4-D的体胚诱导培养基上培养4周，诱导体胚形成；
(5)将形成体胚的胚小叶外植体转移到添加4mg/LBAP的体胚萌发和再生培养基上进行培养，诱导体胚萌发成再生苗，每4周继代培养一次；
(6)采用SSR方法筛选基因型发生突变的再生苗为花生突变体，淘汰基因型未突变的再生苗；
(7)将花生突变体无菌嫁接到砧木上，经炼苗后种植于大田，收获种子；
(8)将收获的种子连续自交至M5代，通过生育期间及收获后性状观察和/或种子营养成分测定，选择各种变异的花生突变体。
在上述方案的基础上，所述的表面消毒处理为：将种胚置于75％的酒精浸泡20s，再用0.1％的升汞浸泡10min，最后用无菌水漂洗5次。
在上述方案的基础上，
所述体胚诱导培养基为MS+10mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH调至5.8；
所述体胚萌发和再生培养基为MS+4mg/LBAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH调至5.8。
在上述方案的基础上，
所述体胚诱导培养、体胚萌发和再生培养的培养条件为：温度为25～26℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～15h。
本发明技术方案的优点
本发明对组培苗的突变性进行鉴定方法简单，能够有效淘汰未突变的再生苗，节省未突变再生苗嫁接移栽及后续突变性鉴定的无效劳动，从而节省人力物力财力。通过SSR方法筛选花生基因型突变体结合子代性状筛选方法，能够缩短育种时间2-3年。对于一些表型无明显变异，但品质性状发生变异的突变体，能通过SSR方法也能鉴定出。
附图说明
图1辐照处理后种子胚小叶外植体形成的体胚和愈伤组织；
图2辐照处理种子胚小叶外植体形成的体胚萌发长成的小苗；
图3SSR引物WH070的扩增产物电泳图(CK：诱变亲本鲁花11号；1-19：再生苗)；
图4SSR引物PM348的扩增产物电泳图(CK：诱变亲本鲁花11号；1-15：再生苗)；
图5SSR引物WH015的扩增产物电泳图(CK：诱变亲本鲁花11号；1-12：再生苗)；
图6SSR表现多态性、株高和分枝数明显变异的植株及诱变亲本鲁花11号植株；
图7SSR表现多态性、形状和大小明显变异的荚果及诱变亲本鲁花11号的荚果；
图8SSR表现多态性、种皮颜色突变为紫色的突变体种子和诱变亲本鲁花11号的种子(粉红色)；
图9SSR表现多态性、内种皮颜色突变为桔黄色的突变体的种子和诱变亲本鲁花11号的种子(内种皮白色红色)。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
鲁花11号突变体快速筛选及育种方法
1、辐照处理
选择颗粒饱满的鲁花11号种子(由青岛农业大学种植保存)，在中国原子能科学研究院进行快中子辐照处理，辐照剂量为9.7Gy，以不进行辐照为对照。
2、制备培养基
(1)制备体胚诱导培养基：选取MS为基本培养基，在此MS培养基中添加5～15mg/L2,4-D(氯化苯氧乙酸类除草剂)形成体胚诱导培养基。
本实施例中体胚诱导培养为MS+10mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH调至5.8；
2,4-D是一种氯化苯氧乙酸类除草剂，也可用作植物生长调节，是用于诱导愈伤组织形成的常用生长素，在本发明中用来诱导体胚形成。
(2)制备体胚萌发和再生培养基：选取MS为基本培养基，在此MS培养基中添加4～6mg/L BAP形成体胚萌发培养基。
本实施例中体胚萌发和再生培养基为MS+4mg/LBAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH调至5.8。
3、辐照处理种子的胚小叶离体培养及植株再生
将辐照处理的鲁花11号种子去子叶，将种胚置于75％的酒精浸泡20s，再用0.1％的升汞浸泡10min，进行表面消毒，用无菌水漂洗5次后，置于装有无菌水的广口瓶中浸泡10～14h。取出经表面消毒浸泡好的种胚，置于无菌培养皿中分离胚小叶，然后将胚小叶作为外植体接种到添加10mg/L2,4-D的体胚诱导培养基上培养4w，诱导体胚的形成，培养条件为：培养室温度为25～26℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～15h。
培养3～5d后胚小叶外植体切口处开始膨大，颜色由乳白色变为嫩黄色。外植体在诱导培养基上培养4周后，对照组胚小叶外植体90％以上直接诱导形成了黄绿色的体胚或体胚丛，少部分形成了乳白色的愈伤组织。而辐照组40％左右的外植体形成了体胚，其余外植体形成了愈伤组织(图1)。
将形成体胚的外植体转移到添加4mg/L BAP的体胚萌发和再生培养基上进行培养，诱导体胚萌发成苗，每4周继代培养一次，培养条件为：培养室温度为25～26℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～15h。转移3周后，部分体胚开始萌发，在体胚萌发和再生培养基上继代培养，体胚萌发长成了小苗(图2)。
4、再生植株的SSR鉴定
(1)DNA提取方法
采用CIAB法提取全基因组DNA。
(2)SSR的PCR扩增方法
采用15μL PCR反应体系，模板：1.5μL，Taq酶：0.2μL，10×Taq buffer7.5μL，正反向引物：各0.6μL，ddH2O：4.6μL。SSR反应程序：94℃预变性3分钟；94℃变性13分钟，55℃退火1分钟，72℃延长90秒，34个循环；72℃延长10分钟。
(3)PCR扩增产物的检测方法
PCR扩增产物在8％非变性PAGE凝胶上电泳。电泳缓冲液为1×TBE，每个点样孔加1.5微升样品。200伏恒电压下电泳约90分钟。电泳结束后，进行银染检测。
(4)再生苗的SSR检测
取126个再生的试管苗叶片及亲本鲁花11号叶片基因组全DNA，进行SSR的PCR扩增。扩增产物的检测结果显示，9个引物对(WH070、WH015、WH039、WH090、WH091、PM660、PM348、PM377、PM297)在再生植株与诱变亲本鲁花11间扩增出多态性(图3-5所示)。有的扩增片段减少，有的扩增片段增加，还有的扩增片段长度差异。被检测的126个再生苗中，42个再生苗扩增出多态性。
5、SSR多态性再生苗后代性状表现
经SSR方法检测，42个再生苗检测出多态。将这42个再生苗作为接穗，培养瓶中无菌萌发的种子实生苗作为砧木，在超净工作台内进行无菌嫁接。嫁接苗栽植于培养瓶中，在培养室培养2-3天，再开瓶口炼苗1-2天后，移栽于田间，浇足水。移栽初期，加塑料拱棚，保持空气湿度，上午9点至下午4点加遮阴网，防止太阳直射。2周后撤掉遮阴网，3周后撤掉塑料拱棚，按常规进行田间管理。最终41株嫁接苗成活，并全部获得种子。
成熟后按单株收获种子，次年将收获的种子按单株种成株行(M2代)。生育期及收获后观察，41个SSR多态性再生植株的后代株行中，有36个株行在主茎高、分枝数、荚果形状、荚果大小、种皮颜色、内种皮颜色等表型方面发生明显分离，并且与诱变亲本鲁花11号相比发生明显变异(图6-9)。
M3代观察，SSR多态性再生苗后代性状继续分离。对M4代植株结的荚果(M5代)测定籽仁含油率与蛋白含量，结果5个SSR表现多态性，但表型无明显变异的再生植株中，有4个再生植株后代(M5代)籽仁含油率和蛋白含量，与亲本相比发生明显变异(表1)。
表1SSR检测多态性，但表型无明显变异的再生植株后代(M4代)含油率及蛋白含量
突变体编号 含油率(％) 蛋白含量(％)
9 57.6 26.1
23 58.3 24.6
27 49.1 28.5
39 47.3 30.1
鲁花11号(亲本) 52.2 27.2
6、SSR多态性再生苗后代新品种选育
经SSR检测，表现多态性的再生苗后代，采用系谱育种法进行选育，从后代中育成了宇花6号和宇花7号花生新品种，已通过国家非主要农作物品种登记，登记号分别为：GPD花生(2018)370104和GPD花生(2018)370105。
实施例2
花育22号突变体快速筛选及育种方法
1、材料
花生品种花育22号作为试验材料。
1、辐照处理
选择颗粒饱满的花育22号种子(由青岛农业大学种植保存)，在中国原子能科学研究院进行高能混合粒子场辐照处理，辐照剂量为105Gy，以不进行辐照为对照。
2、制备培养基
(1)制备体胚诱导培养基：选取MS为基本培养基，在此MS培养基中添加5～15mg/L2,4-D形成体胚诱导培养基。本实施例中体胚诱导培养为MS+10mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH调至5.8；
(2)制备体胚萌发和再生培养基：选取MS为基本培养基，在此MS培养基中添加4～6mg/L BAP形成体胚萌发培养基；本实施例中体胚萌发和再生培养基为MS+4mg/L BAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH调至5.8；
3、辐照处理种子的胚小叶离体培养及植株再生
将辐照处理的花育22号种子去子叶，将种胚置于75％的酒精浸泡20s，再用0.1％的升汞浸泡10min，进行表面消毒，用无菌水漂洗5次后，置于装有无菌水的广口瓶中浸泡10～14h。取出经表面消毒浸泡好的种胚，置于无菌培养皿中分离胚小叶，然后将胚小叶作为外植体接种到添加10mg/L2,4-D的体胚诱导培养基上培养4w，诱导体胚的形成，培养条件为：培养室温度为25～26℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～15h。
将形成体胚的外植体转移到添加4mg/LBAP的体胚萌发和再生培养基上继续培养，诱导体胚萌发成苗，每4周继代培养一次，培养条件为：培养室温度为25～26℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～15h。转移3周后，部分体胚开始萌发，在体胚萌发和再生培养基上继代培养，体胚萌长成了小苗。
4、再生植株的SSR鉴定
(1)DNA提取方法
采用CIAB法提取全基因组DNA。
(2)SSR的PCR扩增方法
采用15μL PCR反应体系，模板：1.5μL，Taq酶：0.2μL，10×Taq buffer7.5μL，正反向引物：各0.6μL，ddH2O：4.6μL。SSR反应程序：94℃预变性3分钟；94℃变性13分钟，55℃退火1分钟，72℃延长90秒，34个循环；72℃延长10分钟。
(3)PCR扩增产物的检测方法
PCR扩增产物在8％非变性PAGE凝胶上电泳。电泳缓冲液位1×TBE，每个点样孔加1.5微升样品。200伏恒电压下电泳约90分钟。电泳结束后，进行银染检测。
(4)再生苗的SSR检测
取69个再生的试管苗叶片及亲本花育22号叶片基因组全DNA，进行SSR的PCR扩增。扩增产物的检测结果显示，10个引物对(PM137、PM297、PM348、PM375、PM188、PM032、PM015、WH033、WH090、PM660)在再生植株与诱变亲本花育22号间扩增出多态性。有的扩增片段减少，有的扩增片段增加，还有的扩增片段长度差异。被检测的69个再生苗中，20个再生苗扩增出多态性。
5、SSR多态性再生苗后代性状表现
经SSR方法检测，20个再生苗检测出多态。将这20个再生苗作为接穗，培养瓶中无菌萌发的种子实生苗作为砧木，在超净工作台内进行无菌嫁接。嫁接苗栽植于培养瓶中，在培养室培养2-3天，再开瓶口炼苗1-2天后，移栽于田间，浇足水。移栽初期，加塑料拱棚，保持空气湿度，上午9点至下午4点加遮阴网，防止太阳直射。2周后撤掉遮阴网，3周后撤掉塑料拱棚，按常规进行田间管理。
成熟后按单株收获种子，次年将收获的种子按单株种成株行(M2代)。生育期及收获后观察，20个SSR多态性再生植株的后代株行中，有16个株行在主茎高、分枝数、开花习性、荚果形状、荚果大小、种皮颜色、内种皮颜色等表型方面发生明显分离，并且与诱变亲本花育22号相比发生明显变异。
M3代观察，SSR多态性再生苗后代性状继续分离。对M4代植株结的荚果(M5代)测定籽仁含油率、蛋白含量、油酸含量、亚油酸含量，结果4个表型无明显变异的SSR多态性再生植株的M4代，籽仁含油率、蛋白含量、油酸含量、亚油酸含量与亲本相比发生明显变异(表2)。
表2SSR检测多态性，但表型无明显变异的再生植株后代含油率、油酸含量、亚油酸含量及蛋白含量
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种花生突变体的快速筛选方法，其特征在于：对花生离体诱变获得的再生苗，采用SSR方法进行基因型上的突变性鉴定，淘汰基因型未突变的再生苗，鉴定的基因型突变的再生苗即为花生突变体。
2.根据权利要求1所述花生突变体的快速筛选方法，其特征在于：步骤为：
(1)提取诱变亲本花生品种和诱变后再生苗叶片的全基因组DNA，进行SSR的PCR扩增；
(2)对比诱变亲本花生和诱变后再生苗的SSR扩增结果，选择扩增结果呈现多态性的再生苗即为花生突变体，淘汰基因型未突变的再生苗。
3.根据权利要求2所述花生突变体的快速筛选方法，其特征在于：所述扩增结果呈现多态性是指扩增片段减少、扩增片段增加或扩增片段长度差异。
4.根据权利要求1～3任一项所述花生突变体的快速筛选方法，其特征在于：所述SSR的PCR扩增结果的检测方法为：
将扩增产物在8％非变性PAGE凝胶上电泳，电泳缓冲液位1×TBE，每个点样孔加1.5μL样品，200伏恒电压下电泳约90分钟，电泳结束后，进行银染检测。
5.根据权利要求4所述花生突变体的快速筛选方法，其特征在于：
所述SSR的PCR扩增体系为：模板1.5μL，Taq酶0.2μL，10×Taq buffer 7.5μL，正反向引物各0.6μL，ddH2O 4.6μL；
所述SSR的PCR扩增反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性13min，55℃退火1min，72℃延长90s，34个循环；72℃延长10min。
6.权利要求1～5任一项所述花生突变体的快速筛选方法在花生育种上的应用。
7.一种花生快速育种方法，其特征在于：步骤如下：
(1)选择颗粒饱满的花生种子进行诱变育种；
(2)经诱变处理的花生种子去子叶，取种胚，对种胚进行表面消毒处理；
(3)将消毒后的种胚置于无菌水中浸泡10～14h后，分离浸泡处理后种胚的胚小叶；
(4)将胚小叶作为外植体置于添加10mg/L 2,4-D的体胚诱导培养基上培养4周，诱导体胚形成；
(5)将形成体胚的胚小叶外植体转移到添加4mg/LBAP的体胚萌发和再生培养基上进行培养，诱导体胚萌发成再生苗，每4周继代培养一次；
(6)采用SSR方法筛选基因型发生突变的再生苗为花生突变体，淘汰基因型未突变的再生苗；
(7)将花生突变体无菌嫁接到砧木上，经炼苗后种植于大田，收获种子；
(8)将收获的种子连续自交至M5代，通过生育期间及收获后性状观察和/或种子营养成分测定，选择各种变异的花生突变体。
8.根据权利要求7所述花生快速育种方法，其特征在于：所述的表面消毒处理为：将种胚置于75％的酒精浸泡20s，再用0.1％的升汞浸泡10min，最后用无菌水漂洗5次。
9.根据权利要求7或8所述花生快速育种方法，其特征在于：
所述体胚诱导培养基为MS+10mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH调至5.8；
所述体胚萌发和再生培养基为MS+4mg/LBAP+30g/L蔗糖+8g/L琼脂，pH调至5.8。
10.根据权利要求9所述花生快速育种方法，其特征在于：
所述体胚诱导培养、体胚萌发和再生培养的培养条件为：温度为25～26℃、光照强度为2000～3000Lx、每日光照为12～15h。
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