CN104782481A - 借助游离小孢子培养和ems诱变创制大白菜突变体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种借助游离小孢子培养和EMS诱变创制大白菜突变体的方法，在游离小孢子培养过程中，利用EMS溶液对小孢子进行诱变处理，在培养获得的双单倍体植株中筛选和鉴定突变体。该方法旨在快速创制出纯合的大白菜突变体，为大白菜育种研究提供了新的种质资源,也可为大白菜功能基因组学研究提供突变材料。

Description

借助游离小孢子培养和EMS诱变创制大白菜突变体的方法

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种在游离小孢子培养过程中与EMS诱变相结合创制大白菜突变体的方法。

背景技术

大白菜属于十字花科芸薹属A基因组植物，是我国种植面积最大的蔬菜作物。大白菜的基因组序列已经于2011年释放，其分子生物学研究进入了功能基因组阶段，大白菜突变体是其功能基因组学研究的重要材料。

人工诱变可以产生丰富的突变体材料。人工诱变的方法有很多种，包括物理(如辐射)诱变，化学诱变(如EMS诱变),T-DNA插入诱变和AC/DS转座诱变等。其中，EMS是化学诱变中应用最广泛的诱变剂。与其他诱变剂相比，EMS诱变产生的点突变频率高，且多为显性突变，染色体畸变相对较少。

传统的诱变方法是利用诱变技术处理植株的种子,并在田间对诱变植株进行鉴定和选择。种子是最早也是最常用来作为EMS诱变处理的材料，但通常EMS诱变种子效率很低。游离小孢子培养可以为离体诱变提供新的途径，其在创制突变体方面具有明显的优势，可以快速获得目标性状、缩短创制纯合突变体的时间、提高诱变效率。本发明将游离小孢子培养和EMS诱变相结合，旨在快速创制纯合的大白菜 突变体。

发明内容

本发明的目的是创建一种快速创制大白菜突变体的新方法，将游离小孢子培养技术和EMS诱变相结合，旨在快速获得纯合的大白菜突变体，提高构建突变体库的效率。

本发明提供的借助游离小孢子培养和EMS诱变创制大白菜突变体的方法，主要步骤包括：

(1)所用的诱变材料为双单倍体纯系(DH系)，在开花期选取小孢子发育期为单核晚期至二核早期的未开放花蕾，即长度为2-4mm，进行游离小孢子培养；

(2)在小孢子培养过程中，采用不同浓度0.04％、0.08％、0.12％[v/v]EMS溶液对小孢子进行诱变处理，处理时间均为10min，经过培养获得小孢子再生植株(M₀)；

(3)将M₀代再生植株移栽到温室，利用流式细胞仪对其进行倍性鉴定，筛选出双单倍体植株；

(4)在获得的双单倍体植株中，通过对叶色、叶形、花瓣颜色、花瓣形态、雄蕊育性和株型等植物学性状鉴定，筛选出M₀变异植株；

(5)将所有的M₀代双单倍体植株自交，获得M₁代种子；

(6)播种M₁种子，进一步鉴定突变性状，筛选稳定遗传的突变体材料；

(7)经试验筛选，创制大白菜突变体的适宜EMS溶液浓度为0.08％；

上述步骤(2)的具体内容：将长度为2-4mm的未开放花蕾在超净工作台上经浓度为75％乙醇溶液表面消毒30s后，用浓度为0.1％氯化汞溶液消毒8min，再用无菌水冲洗3次，每次5min。

消毒后的花蕾放入灭过菌的小烧杯内，加入蔗糖浓度为130g·L^-1，PH值为5.8的B5培养基，用无菌研棒碾压花蕾，使小孢子游离出来，用40μm孔径的尼龙网过滤含小孢子的悬浮液，收集滤液于10mL离心管中，1000rpm离心3min，弃上清液，沉淀加10mL B5培养基，摇匀，1000rpm离心3min，弃上清液，所得沉淀物即为纯净小孢子。此时，分别加入浓度为0(对照)，0.04％，0.08％，0.12％(v/v)的EMS溶液，摇匀，处理10min后，1000rpm离心3min，弃上清液，将诱变处理后的小孢子用NLN培养基稀释，稀释密度至1～2×10⁵个·mL^-1，以每皿5mL小孢子悬浮液分装入直径60mm的无菌培养皿内,每皿添加100μL高温灭菌后的0.5g·L^-1琼脂糖和10g·L^-1活性炭混合液；用石蜡膜封口，33℃恒温箱中暗培养24小时,再转移至25℃培养箱暗培养10～15天，肉眼可见胚状体后，将培养皿转移到转数为40～60转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25℃；将子叶期胚状体转接到MS培养基上，在25℃，16h/8h光周期条件下培养；获得小孢子再生植株后，再进一步将再生植株接种到MS培养基上进行生根培养。

EMS溶液设0.04％，0.08％，0.12％(v/v)3个浓度梯度，将EMS溶于蔗糖浓度为130g·L^-1，PH值为5.8的B5培养基中，抽滤备用，以未处理的小孢子作对照。

NLN培养基为含130g·L^-1蔗糖，添加激素0.05mg·L^-16-BA(6-苄氨基腺嘌呤)和0.05mg·L^-1NAA(α-萘乙酸)，PH值为5.8的NLN培养基。

诱导再生植株的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，6.5～7.5g·L^-1琼脂，pH值为5.8～6.0，未添加任何激素的MS培养基；诱导再生植株生根的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，5.5g·L^-1琼脂，0.1mg·L^-1NAA(α-萘乙酸)，pH值为5.8～6.0的MS培养基。

上述步骤(3)的具体内容：利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定，筛选出双单倍体植株。首先，取直径为1～2cm大小的新鲜嫩叶放入培养皿内，加入1.5～2.0mL Chopping Buffer缓冲液(15mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷，2mmol·L^-1乙二胺四乙酸二钠，0.5mmol·L^-1精胺，80mmo1·L^-1氯化钾，20mmo1·L^-1氯化钠，0.1％[v/v]聚乙二醇辛基苯基醚和15mmo1·L^-1二巯基乙醇，pH 7.5)，用手术剪刀将叶片剪碎，然后，吸取上清液，用300目筛网将样品过滤到离心管内，1000rpm离心10min，离心后弃上清，沉淀加1mL PI(碘化丙啶)染液，混匀避光染色15min，最后，将样品用500目筛网过滤到上样管中，混匀上机检测，20s后分析仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量峰值图；以已知二倍体的野生型诱变材料作为对照,使对照的DNA吸收峰处在200道(X轴)位置，每个待测植株分别测定3次,DNA吸收峰值处在200道的样本即为二倍体,而峰值处在100和400道的分别为单倍体和四倍体。

上述步骤(7)的具体内容:在获得的稳定遗传的突变体材料中， 其中绝大多数突变体(83.33％)均来自于浓度为0.08％的EMS溶液处理，由此，经本试验筛选，创制大白菜突变体的适宜EMS溶液浓度为0.08％。

本发明的积极效果

(1)所用的诱变原始材料为小孢子双单倍体系(DH系)，它是遗传意义上的纯系。如果获得突变体，与野生型之间的遗传背景完全一致，只是在突变位点上存在差异，可以为克隆突变基因提供了理想的试验材料。

(2)在小孢子培养过程中，对单倍体小孢子进行诱变处理，突变了的小孢子再生成的双单倍体，即为纯合突变体，突变性状在当代就能表现，可以快速筛选出突变材料。

(3)以单倍体小孢子为诱变处理材料，便于扩大诱变处理的群体规模。游离小孢子培养技术具有快速获得纯合育种材料的优点，将其与EMS诱变相结合，可以极大地提高诱变效率，加快创制突变体的速度。

(4)本发明获得的大白菜纯合突变体，不仅可以为大白菜育种研究提供新的种质资源,还可为大白菜功能基因组学研究提供优良的突变材料。

附图说明

图1：经EMS诱变后培养获得的小孢子胚状体。

图1中：a:0处理；b:0.04％处理；c:0.08％处理；d:0.12％处理；

图2：经EMS诱变后小孢子胚状体的成苗情况。

图2中：a:直接成苗；b:愈伤组织；c：形成次生胚；d：胚褐化和白化；

图3：经EMS诱变后小孢子植株生根及移栽成活情况。

图3中：a：小孢子再生植株；b：生根的小孢子植株；c：待移栽的小孢子植株；d：移栽成活的小孢子植株；

图4：利用流式细胞仪鉴定再生植株中的单倍体。

图5：利用流式细胞仪鉴定再生植株中的双单倍体。

图6：利用流式细胞仪鉴定再生植株中的四倍体。

图7：M₀代筛选出的变异植株。

图7中：a:叶片(‘FT’)；b:叶片颜色深，较厚，叶脉明显；c:叶片卷曲，颜色深；d:叶片边缘锯齿；e：花器官(‘FT’)；f:花瓣数目变异；g:花瓣发育退化；h:柱头外露；

图8：M₁代鉴定出的株型突变体材料。

图8中：a:‘FT’；b:生长缓慢突变体；c：生长缓慢突变体的叶球(左)和‘FT’(右)；d：结竖球突变体；e：结竖球突变体的叶球(左)和‘FT’(右)；

图9：M₁代鉴定出的花器官突变体材料。

图9中：a:早抽薹突变体(单株)；b:早抽薹突变体(群体)；c:早抽薹突变体，苗期叶缘上卷(深，右)和‘FT’(左)；d：早抽薹突变体，苗期叶缘上卷(浅，右)和‘FT’(左)；

图10：M₁代鉴定出的叶片突变体材料。

图10中：a:‘FT’(左)；b:苗期叶片黄化突变体(右)；

注：‘FT’是指所用的诱变原始材料，它是小孢子DH系。

具体实施方式

实施例1，EMS诱变处理过程

一、植物材料

所用的诱变材料是大白菜早熟品种‘福田50’经小孢子培养获得的DH系，我们将其命名为‘FT’，它具有耐热、白花、叶球卵圆型特点。

本实验室中刘洋等人以‘FT’作为试验材料，在国际重要学术期刊《Euphytica》上已经发表了大白菜产量相关数量性状基因定位论文，英文题目为《Mapping quantitative trait loci for yield-related traits in Chinese cabbage(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)》。

二、诱变处理

‘FT’的种子经过2℃低温春化处理15天后，于2013年9月播种于温室中。2013年12月，在开花期选取小孢子发育期为单核晚期至二核早期的未开放花蕾(长度为2-4mm)进行游离小孢子培养。在小孢子培养过程中，采用不同浓度0(对照)，0.04％，0.08％，0.12％(v/v)的EMS溶液对小孢子进行诱变处理，每处理重复3次。

实施例2，游离小孢子培养过程

一、游离小孢子培养

将长度为2-4mm的未开放花蕾(小孢子发育期为单核晚期至二核早期)在超净工作台内经浓度为75％乙醇溶液表面消毒30s后， 用浓度为0.1％氯化汞溶液消毒8min，再用无菌水冲洗3次，每次5min。

消毒后的花蕾放入灭过菌的小烧杯内，加入蔗糖浓度为130g·L^-1，PH值为5.8的B5培养基，用无菌研棒碾压花蕾，使小孢子游离出来，用40μm孔径的尼龙网过滤含小孢子的悬浮液，收集滤液于10mL离心管中，1000rpm离心3min，弃上清液，沉淀加10mL B5培养基，摇匀，1000rpm离心3min，弃上清液，所得沉淀物即为纯净小孢子。此时，分别加入浓度为0(对照)，0.04％，0.08％，0.12％(v/v)的EMS溶液，摇匀，处理10min后，1000rpm离心3min，弃上清液，将诱变处理后的小孢子用NLN培养基稀释，稀释密度至1～2×10⁵个·mL^-1，以每皿5mL小孢子悬浮液分装入直径60mm的无菌培养皿内,每皿添加100μL高温灭菌后的0.5g·L^-1琼脂糖和10g·L^-1活性炭混合液；用石蜡膜封口,33℃恒温箱中暗培养24小时,再转移至25℃培养箱暗培养10～15天，肉眼可见胚状体后，将培养皿转移到转数为40～60转/分钟摇床上继续暗培养，培养温度为25℃；将子叶期胚状体转接到MS培养基上，在25℃，16h/8h光周期条件下培养；获得小孢子再生植株后，再进一步将再生植株接种到MS培养基上进行生根培养。

其中，EMS溶液设0.04％，0.08％，0.12％(v/v)3个浓度梯度，将EMS溶于蔗糖浓度为130g·L^-1，PH值为5.8的B5培养基中，抽滤备用，以未处理的小孢子作对照；

NLN培养基为含130g·L^-1蔗糖，添加激素0.05mg·L^-16-BA(6- 苄氨基腺嘌呤)和0.05mg·L^-1NAA(α-萘乙酸)，PH值为5.8的NLN培养基；

诱导再生植株的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，6.5～7.5g·L^-1琼脂，pH值为5.8～6.0，未添加任何激素的MS培养基；诱导再生植株生根的MS培养基为含30g·L^-1蔗糖，5.5g·L^-1琼脂，0.1mg·L^-1NAA(α-萘乙酸)，pH值为5.8～6.0的MS培养基。

二、EMS对小孢子胚发生的影响

如图1所示，经过EMS诱变处理后，小孢子胚状体的发生出现了明显的剂量效应。采用不同浓度的EMS溶液处理小孢子，对小孢子胚状体的发生会产生不同的影响，我们在小孢子培养后第25天统计小孢子胚状体的诱导率(表1)。结果表明EMS抑制了小孢子胚发生和胚状体的发育，并且随着EMS溶液浓度的增加，小孢子胚状体的诱导率逐渐下降，不同浓度处理之间差异显著。

表1EMS对小孢子胚发生的影响

注：表中数据为3次重复平均值，邓肯新复极差测验，不同小写 字母为差异显著(P＝0.05)。

三、EMS对胚状体成苗的影响

将胚状体转接到MS培养基上，在光照培养室中进行培养，3周后统计成苗率。统计结果表明，有的胚状体直接发育成再生植株(图2-a)，有的胚状体形成了愈伤组织(图2-b)，有的胚状体膨大的子叶或者胚轴上形成了次生胚(图2-c)，有的胚状体发生褐化或者白化(图2-d)。如表2所示，经过EMS诱变处理后，与对照相比，小孢子胚状体的直接成苗率明显提高了，同时，形成愈伤率显著下降了，但形成次生胚，胚状体褐化和白化所占的比例没有发生明显的变化。结果表明，EMS诱变对胚状体直接成苗起到了一定的促进作用。

表2EMS对胚状体成苗的影响

注：总计是0.04％，0.08％和0.12％三个处理的总和。

百分比＝100％×(胚数)/转胚数。

四、EMS对小孢子植株生根及移栽成活的影响

获得小孢子再生植株后，将再生植株接种到MS培养基上进行生 根培养(图3-a)，2周后统计小孢子植株生根情况(图3-b)。待再生植株生根后，于2014年4月将再生植株移栽到温室进行培养(图3-c)，3周后统计移栽成活率(图3-d)。结果表明，与对照相比，经过EMS诱变处理后，小孢子再生植株的生根率和移栽成活率均得到显著提高(表3)。

表3EMS对小孢子植株生根及移栽成活的影响

注：总计是0.04％，0.08％和0.12％三个处理的总和。

百分比＝100％×(株数)/再生植株数。

实施例3，再生植株群体的倍性鉴定过程

一、利用流式细胞仪鉴定再生植株倍性

我们主要利用流式细胞仪对再生植株进行倍性鉴定，筛选出双单倍体植株。首先，取直径为1～2cm大小的新鲜嫩叶放入培养皿内，加入1.5～2.0mL Chopping Buffer缓冲液(15mmol·L^-1三羟甲基氨基甲烷，2mmol·L^-1乙二胺四乙酸二钠，0.5mmol·L^-1精胺，80mmo1·L^-1氯化钾，20mmo1·L^-1氯化钠，0.1％[v/v]聚乙二醇辛基苯基醚和15mmo1·L^-1二巯基乙醇，pH 7.5)，用手术剪刀将叶片剪碎，然后，吸 取上清液，用300目筛网将样品过滤到离心管内，1000rpm离心10min，离心后弃上清，沉淀加1mL PI(碘化丙啶)染液，混匀避光染色15min，最后，将样品用500目筛网过滤到上样管中，混匀上机检测，约20s后分析仪自动形成代表该样品倍性的DNA含量峰值图；以已知二倍体的野生型诱变材料作为对照,使对照的DNA吸收峰处在200道(X轴)位置，每个待测植株分别测定3次,DNA吸收峰值处在200道的样本即为二倍体(图5),而峰值处在100和400道的分别为单倍体(图4)和四倍体(图6)。

二、EMS对小孢子再生植株倍性的影响

经过EMS诱变后，游离小孢子培养获得的再生植株的倍性没有发生明显的变化。与对照相比，再生植株群体中单倍体所占的比例升高了，但双单倍体和四倍体的比例有所下降(表4)。

表4EMS对小孢子再生植株倍性的影响

注：总计是0.04％，0.08％和0.12％三个处理的总和。

百分比＝100％×(株数)/鉴定再生植株数。

实施例4，筛选和鉴定突变体过程

一、突变体的筛选与鉴定

经游离小孢子培养共获得1304株再生植株(M₀)，流式细胞仪鉴定倍性后，在获得的双单倍体植株中，通过对叶色、叶形、花瓣颜色、花瓣形态、雄蕊育性和株型等植物学性状的鉴定，筛选出大量发生表型变异的植株(表5)。将所有的M₀代双单倍体植株自交，获得M₁代种子。

2014年8月，播种M₁种子，通过在田间进一步鉴定突变性状，筛选出可以稳定遗传的突变体材料(表6)，并构建了一个包括株型、花器官和叶片等多种变异类型的突变体库。如表6所示，在获得的稳定遗传的突变体材料中，结竖球、早抽薹和叶片黄化突变体均来自于浓度为0.08％的EMS溶液处理，生长缓慢突变体来自于浓度为0.04％的EMS溶液处理，由此，经本试验筛选，创制大白菜突变体的适宜EMS溶液浓度为0.08％。

在筛选突变体的过程中，发现很多突变性状仅仅出现在M₀代，经过自交后，M₁代便恢复正常(图7)，说明它们是不可遗传的突变性状，可能是由于生理损伤造成的，并且易受环境条件影响。

表5M₀代变异植株的分类

表6M₁代突变体性状的分类

二、突变体的分类与特征

1.株型突变体 

‘FT’的叶球呈卵圆型，叶片皱缩、叠抱(图8-a)。

(1)生长缓慢突变体

突变体在结球期表现出生长缓慢的趋势，最终导致其结球非常的小，变异频率为0.08％(图8-b,c)。

(2)结竖球突变体 

突变体的球形发生了变化，表现为结竖球，变异频率为0.15％(图8-d,e)。

2.花器官突变体 

突变体表现为早抽薹性状，变异频率为0.15％(图9-a,b)。在苗期时，‘FT’的叶片平滑，无皱褶，突变体的叶片亮且较硬，同时叶片边缘出现上卷现象，其中一个上卷程度较深(图9-c)，另一个上卷程度较浅(图9-d)。

3.叶片突变体 

‘FT’的叶片呈绿色(图10-a)，在苗期，突变体表现为叶片黄化，变异频率为0.08％(图10-b)。

Claims (1)

1.一种借助游离小孢子培养和EMS诱变创制大白菜突变体的方法，其特征在于步骤如下：

（1）所用的诱变材料为小孢子双单倍体纯系，在开花期选取小孢子发育期为单核晚期至二核早期的未开放花蕾，即长度为2-4 mm，进行游离小孢子培养；

（2）在小孢子培养过程中，采用不同浓度0.04%，0.08%，0.12% [v/v] EMS溶液对小孢子进行诱变处理，处理时间均为10 min，经过培养获得小孢子再生植株（M₀）；

（3）将M₀代再生植株移栽到温室，利用流式细胞仪对其进行倍性鉴定，筛选出双单倍体植株；

（4）在获得的双单倍体植株中，通过对叶色、叶形、花瓣颜色、花瓣形态、雄蕊育性和株型等植物学性状鉴定，筛选出M₀变异植株；

（5）将所有的M₀代双单倍体植株自交，获得M₁代种子；

（6）播种M₁种子，进一步鉴定突变性状，筛选稳定遗传的突变体材料；

（7）经试验筛选，创制大白菜突变体的适宜EMS溶液浓度为0.08%。