CN105606519B - 一种快速鉴定杨柳科植物倍性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速鉴定杨柳科植物倍性的方法，包括细胞核提取缓冲液的配制、细胞核染色缓冲液的配制、细胞核悬液的制备、细胞核DNA特异性染色、流式细胞仪检测和倍性判断步骤。利用本发明的方法对杨柳科植物进行倍性测定，具有适用范围广、样品用量少、制备方法简单，提取的细胞核DNA平均荧光强度高、变异系数小的优点，其测定结果也比较快速准确，分辨率也比较高。本方法为杨柳科植物多倍体育种提供了可靠的技术手段，其应用前景广泛。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速鉴定杨柳科植物倍性的方法。
背景技术
杨柳科植物隶属于被子植物门（Magnoliophyta）双子叶植物纲（Magnoliopsida）五桠果亚纲（Dilleniidae）杨柳目（Salicales）杨柳科（Salicaceae）。作为重要的工业用材树种，杨柳科植物生长迅速、适应性强以及易于营养繁殖等优良特征使其在我国林业生产中占据十分重要的地位。此外，杨柳在植物修复和生态系统复原中扮演重要角色，同时也是重要的园林观赏树种（涂忠虞，1989；Ball等，2005；唐桂梅等，2007）。杨柳科植物具有很高的生物量产量，近年来也被用作重要的生物质能源树种（Adegbidi等，2001；Perlack等，2011；Zalesny等，2011；Kiser等，2013；Zamora等，2014）。
多倍体育种是植物育种的一种重要手段（Li等，2005）。多倍体是植物界普遍存在的现象，多倍体植物含有3套以上的染色体组（Otto，2007）。在有些植物中，多倍体对个体往往产生积极的影响，如与二倍体比较，细胞体积更大（Cavalier-Smith，1978；Gregory，2001），个体生长量增加，对环境的适应性增强等（Gregory等，2005）。杨柳科植物中，杨树主要以二倍体形式存在，但也存在少量天然多倍体，尤其是白杨派树种（Kong等，2013）。与杨树相比，柳树的倍性变化范围较大，从二倍体（2n=38）到十二倍体（2n=228）都存在，甚至同种也有倍性变化（Thibault，1998；Serapiglia等，2014）。多倍体育种对杨柳科植物新品种培育起着重要作用。
杨柳科植物中，杨树多倍体育种开始于上世纪三十年代，到现在已取得了很好的效果（Nilsson-Ehle，1936；康向阳，2010），尤其是三倍体杨树在材积生长、木材纤维、抗病抗逆等性状上表现突出。Einspahr（1984）和Weisgerber等人（1980）曾利用四倍体欧洲山杨与二倍体美洲山杨杂交进行三倍体山杨的选育，分别获得了适于制浆造纸的杂交山杨以及生长迅速、适应性强，且抗锈病的山杨新品系“Astria”，并在生产中大面积推广。我国朱之悌等（1995）利用2n花粉进行杂交育种，得到的三倍体毛白杨在生长性状方面表现突出。张守攻等人的研究显示，在我国广泛种植的“中林46”、“银中杨”等品种都是三倍体，因此，多倍体育种对杨树新品种培育有很高的应用价值（张守攻等，2003，2005；陈成彬等，2004）。近年来，多倍体育种手段在也开始柳树新品种选育中得到应用。如Serapiglia等（2014）报道，二倍体灌木柳单位面积的生物量约为8.29 Mg ha-1 yr-1，而三倍体达到了12.65 Mg ha-1yr-1，超过二倍体50%以上，最高达16 Mg ha-1 yr-1。三倍体灌木柳在树高、茎截面积（stemarea）及密度等方面都明显优于二倍体和四倍体。
开展杨柳多倍体育种的一个关键就是要有可靠的倍性鉴定手段。传统的倍性鉴定主要是通过观察植株器官的形态差异、测定生理生化指标、检测气孔大小和花粉形态等方法进行推测，但准确度不高（Tao等，2009）；而对植物组织细胞压片后进行染色体计数虽然可直接、准确地得到倍性数据，但这一方法步骤繁琐，技术要求高，并且杨柳科植物染色体数量多（2n=38到228不等，Ollitrault-Sammarcelli等，1994；Thibault，1998），单条染色体大小极小，呈点状，用这一方法对杨柳科植物染色体计数非常困难（Tao等，2009；田新民等，2011）。上世纪80年代，Galbraith首次用流式细胞仪（Flow cytometer，FCM）成功测定了植物细胞核DNA含量（Galbraith，1983）。流式细胞仪可以对处于液流状态中带有荧光标记的微粒进行分析、分选并快速准确地测定其DNA含量和倍性水平（田新民等，2011）。这一方法样品制备简便、分析迅速、结果可靠，且不受样品取材部位及环境干扰，已成为植物细胞核DNA含量测定和倍性鉴别的首选方法（Doležel等，2005，2007；Tao等，2009）。
利用流式细胞仪测定植物倍性时需要制备细胞核悬浮液。通过物理方法破碎细胞，对细胞破坏大，难以得到完整细胞核。加入合适的解离液可在促进细胞核释放的同时保持细胞核的完整性（Loureiro等，2006；田新民等，2011）。但不同解离液对于不同物种的解离效果差异显著。解离液选择不当，不仅不能使细胞核解离，反而会加大细胞核破碎，导致错误的实验结果（田新民等，2011）。因此合适解离液的选择是利用流式细胞仪测定植物倍性的关键。目前，国内外尚没有采用流式细胞仪检测杨柳科植物倍性的实验体系的报道。
发明内容
发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种快速鉴定杨柳科植物倍性的方法，建立利用流式细胞仪测定杨柳科植物倍性的实验体系，提高了倍性鉴定效率，为杨柳科植物多倍体育种提供可靠的技术手段。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种快速鉴定杨柳科植物倍性的方法，包括以下步骤：
（1）按如下成分和比例配制细胞核提取缓冲液：0.5 mM四盐酸精胺，30 mM柠檬酸钠，200 mM Tris，80 mM氯化钾，0.5%Triton X-100；用1M盐酸或1M氢氧化钠将pH调节至7.5，于4℃保存；
（2）将1 mg碘化丙啶粉末溶于1 mL去离子水中，配制成1 mg/mL的PI贮存液，4℃保存；
（3）取新鲜嫩叶30~50 mg，用去离子水将叶片表面尘土冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，置于预冷的培养皿中，加入1 mL预冷的细胞核提取缓冲液，在冰上用锋利的双面刀片快速切碎约1 min，整个过程叶片须浸于解离液中；之后用移液器将核悬液反复轻轻吹打，使其充分混匀，之后经40 μm尼龙网将核悬液过滤至1.5 mL离心管中，除去大碎片；同样方法制备对照样；
（4）用移液器吸取472.5 μL核悬液，转移至流式细胞仪专用上样管中，加入25 μLPI贮存液及2.5 μL RNase A，至其终浓度均为50 μg/mL，4℃避光染色10 min；
（5）采用流式细胞仪进行检测和分析样本，每个样本重复测定三次；
（6）以对照样品的出峰位置为对照，判断出未知样品的倍体即可。
步骤（5）中，采用美国BD公司的Influx流式细胞仪进行检测和分析，氩离子激光发射器的激发光波长采用为488 nm，检测通道为670/30[488]；检测前先用SpheroTM Rainbow标准微粒将仪器调试到最佳状态，且变异系数在3%以内；之后检测待测样品，利用Influx流式细胞仪随机自带软件BD FACS™ Sortware 1.0.0.650收集至少5000个颗粒；整个检测过程仪器参数保持不变，每个样本重复测定三次。
步骤（6）中，若已知倍性对照样品为二倍体，则在检测时将出峰位置设定在10×1000检测通道；之后检测未知样品，并根据出峰位置判断倍性：若出峰位置与对照接近，则为二倍体；若为20×1000，则为四倍体；若为30×1000，则为六倍体；以此类推。
若已知倍性对照样品为四倍体，则在检测时将出峰位置设定在20×1000检测通道；之后检测未知样品，并根据出峰位置判断倍性：若出峰位置为10×1000，则为二倍体；若与对照位置接近，则为四倍体；若为30×1000，则为六倍体；以此类推。
步骤（6）中，未知样品的出峰位置误差不超过±5%。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点包括：
（1）利用流式细胞术检测植物倍性具有快速、准确、分辨率高的优点，尤其适合单个染色体小、染色体数目多、倍性变化复杂的杨柳科植物。
（2）样品用量少，仅需30-50 mg。
（3）样品制备方法简单，耗时在5 min以内，且不受季节限制。
（4）测定速度快，流式细胞仪分析只需5 min内即可得出结果。整个测定过程从样品制备到得出结果可在15 min内完成。
（5）本发明专门针对杨柳科植物建立了利用流式细胞仪测定倍性的实验体系，提高了倍性鉴定效率，为杨柳科植物多倍体育种提供可靠的技术手段。
附图说明
图1是鉴定垂柳倍性时所用的对照样品簸箕柳的荧光光谱图；
图2是鉴定垂柳倍性时得到的垂柳荧光光谱图；
图3是鉴定杞柳倍性时所用的对照样品腺柳的荧光光谱图；
图4是鉴定杞柳倍性时得到的杞柳荧光光谱图；
图5是鉴定63杨倍性时所用的对照样品毛白杨的荧光光谱图；
图6是鉴定63杨倍性时得到的毛白杨荧光光谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的方法作进一步详细的说明。
实施例1 垂柳（Salix babylonica）倍性鉴定
待测样品垂柳的嫩叶采自南京玄武湖公园，以二倍体簸箕柳（S. suchowensis）为对照。实验前，采集新鲜嫩叶，用湿滤纸包好带回，存放于4℃冰箱，3天内可用。
（1）细胞核提取缓冲液的配制
按如下成分和比例配置细胞核提取缓冲液：0.5 mM四盐酸精胺，30 mM柠檬酸钠，200 mM Tris，80 mM氯化钾，0.5%（v/v）Triton X-100。用1M盐酸或1M氢氧化钠将pH调节至7.5，于4℃保存。
（2）细胞核染色缓冲液的配制
将1 mg碘化丙啶（propidium iodide，PI）粉末溶于1 mL去离子水中，配置成1 mg/mL的PI贮存液，4℃保存。
（3）细胞核悬液的制备
取新鲜嫩叶30~50 mg，用去离子水将叶片表面尘土冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，置于预冷的培养皿中，加入1 mL预冷的缓冲液，在冰上用锋利的双面刀片快速切碎约1min，整个过程叶片须浸于解离液中。之后用移液器将核悬液反复轻轻吹打，使其充分混匀，之后经40 μm尼龙网将核悬液过滤至1.5 mL离心管中，除去大碎片。
（4）细胞核DNA特异性染色
用移液器吸取472.5 μL细胞核悬液，转移至流式细胞仪专用上样管中，加入25 μLPI贮存液（1 mg/mL）及2.5 μL RNase A（10 mg/mL），至其终浓度均为50 μg/mL，4℃避光染色10 min。
（5）流式细胞仪检测
待测样品于对照样品均采用美国BD公司的Influx流式细胞仪进行检测和分析。检测前先用SpheroTM Rainbow标准微粒（美国Spherotech公司）将仪器调试到最佳状态，且变异系数在3%以内。之后检测待测样品，利用Influx流式细胞仪随机自带软件BD FACS™Sortware 1.0.0.650收集至少5000个颗粒。整个检测过程仪器参数保持不变，每个样本重复测定三次。
（6）倍性判断
对照样品为二倍体，在检测时将其出峰位置设定在10×1000检测通道左右（见图1）。待测样品垂柳的出峰位置在20×1000左右，且位置偏离误差在5%以内，因此判断其为四倍体（见图2）。
实施例2 杞柳（S. integra）倍性鉴定
待测样品杞柳为水培苗，来自南京林业大学在江苏泗洪陈圩林场的种质资源圃，以二倍体腺柳（S. chaenomeloides）为对照。
（1）细胞核提取缓冲液的配制
按如下成分和比例配置细胞核提取缓冲液：0.5 mM四盐酸精胺，30 mM柠檬酸钠，200 mM Tris，80 mM氯化钾，0.5%（v/v）Triton X-100。用1M盐酸或1M氢氧化钠将pH调节至7.5，于4℃保存。
（2）细胞核染色缓冲液的配制
将1 mg碘化丙啶（propidium iodide，PI）粉末溶于1 mL去离子水中，配置成1 mg/mL的PI贮存液，4℃保存。
（3）细胞核悬液的制备
取新鲜嫩叶30~50 mg，用去离子水将叶片表面尘土冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，置于预冷的培养皿中，加入1 mL预冷的缓冲液，在冰上用锋利的双面刀片快速切碎约1min，整个过程叶片须浸于解离液中。之后用移液器将核悬液反复轻轻吹打，使其充分混匀，之后经40 μm尼龙网将核悬液过滤至1.5 mL离心管中，除去大碎片。
（4）细胞核DNA特异性染色
用移液器吸取472.5 μL细胞核悬液，转移至流式细胞仪专用上样管中，加入25 μLPI贮存液（1 mg/mL）及2.5 μL RNase A（10 mg/mL），至其终浓度均为50 μg/mL，4℃避光染色10 min。
（5）流式细胞仪检测
待测样品于对照样品均采用美国BD公司的Influx流式细胞仪进行检测和分析。检测前先用SpheroTM Rainbow标准微粒（美国Spherotech公司）将仪器调试到最佳状态，且变异系数在3%以内。之后检测待测样品，利用Influx流式细胞仪随机自带软件BD FACS™Sortware 1.0.0.650收集至少5000个颗粒。整个检测过程仪器参数保持不变，每个样本重复测定三次。
（6）倍性判断
对照样品为二倍体，在检测时将其出峰位置设定在10×1000检测通道左右（见图3）。待测样品垂柳的出峰位置在10×1000左右，且位置偏离误差在5%以内，因此判断其为二倍体（见图4）。
实施例3 63杨（Populus deltides ‘Harvord’）倍性鉴定
待测样品63杨来自南京林业大学校园，采集其枝条稍部嫩叶为测定材料，以二倍体毛白杨（P. tomentosa）为对照。
（1）细胞核提取缓冲液的配制
按如下成分和比例配置细胞核提取缓冲液：0.5 mM四盐酸精胺，30 mM柠檬酸钠，200 mM Tris，80 mM氯化钾，0.5%（v/v）Triton X-100。用1M盐酸或1M氢氧化钠将pH调节至7.5，于4℃保存。
（2）细胞核染色缓冲液的配制
将1 mg碘化丙啶（propidium iodide，PI）粉末溶于1 mL去离子水中，配置成1 mg/mL的PI贮存液，4℃保存。
（3）细胞核悬液的制备
取新鲜嫩叶30~50 mg，用去离子水将叶片表面尘土冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，置于预冷的培养皿中，加入1 mL预冷的缓冲液，在冰上用锋利的双面刀片快速切碎约1min，整个过程叶片须浸于解离液中。之后用移液器将核悬液反复轻轻吹打，使其充分混匀，之后经40 μm尼龙网将核悬液过滤至1.5 mL离心管中，除去大碎片。
（4）细胞核DNA特异性染色
用移液器吸取472.5 μL细胞核悬液，转移至流式细胞仪专用上样管中，加入25 μLPI贮存液（1 mg/mL）及2.5 μL RNase A（10 mg/mL），至其终浓度均为50 μg/mL，4℃避光染色10 min。
（5）流式细胞仪检测
待测样品于对照样品均采用美国BD公司的Influx流式细胞仪进行检测和分析。检测前先用SpheroTM Rainbow标准微粒（美国Spherotech公司）将仪器调试到最佳状态，且变异系数在3%以内。之后检测待测样品，利用Influx流式细胞仪随机自带软件BD FACS™Sortware 1.0.0.650收集至少5000个颗粒。整个检测过程仪器参数保持不变，每个样本重复测定三次。
（6）倍性判断
对照样品为二倍体，在检测时将其出峰位置设定在10×1000检测通道左右（见图5）。待测样品垂柳的出峰位置在10×1000左右，且位置偏离误差在5%以内，因此判断其为二倍体（见图6）。
本发明针对杨柳科植物倍性多变的特点建立了利用流式细胞术测定杨柳科植物倍性的实验体系，为杨柳科植物倍性的快速准确鉴定以及多倍体育种研究提供了可靠的技术手段。
Claims (4)
1.一种快速鉴定杨柳科植物倍性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)按如下成分和比例配制细胞核提取缓冲液：0.5mM四盐酸精胺，30mM柠檬酸钠，200mM Tris，80mM氯化钾，0.5％Triton X-100；用1M盐酸或1M氢氧化钠将pH调节至7.5，于4℃保存；
(2)将1mg碘化丙啶粉末溶于1mL去离子水中，配制成1mg/mL的PI贮存液，4℃保存；
(3)取新鲜嫩叶30～50mg，用去离子水将叶片表面尘土冲洗干净，用滤纸吸干表面水分，置于预冷的培养皿中，加入1mL预冷的细胞核提取缓冲液，在冰上用锋利的双面刀片快速切碎约1min，整个过程叶片须浸于解离液中；之后用移液器将核悬液反复轻轻吹打，使其充分混匀，之后经40μm尼龙网将核悬液过滤至1.5mL离心管中，除去大碎片；同样方法制备对照样；
(4)用移液器吸取472.5μL核悬液，转移至流式细胞仪专用上样管中，加入25μL PI贮存液及2.5μL RNase A，至其终浓度均为50μg/mL，4℃避光染色10min；
(5)采用流式细胞仪进行检测和分析样本，每个样本重复测定三次；
(6)以对照样品的出峰位置为对照，判断出未知样品的倍体即可。
2.根据权利要求1所述的快速鉴定杨柳科植物倍性的方法，其特征在于，步骤(5)中，采用美国BD公司的Influx流式细胞仪进行检测和分析，氩离子激光发射器的激发光波长采用为488nm，检测通道为670/30[488]；检测前先用SpheroTM Rainbow标准微粒将仪器调试到最佳状态，且变异系数在3％以内；之后检测待测样品，利用Influx流式细胞仪随机自带软件BD FACSTM Sortware 1.0.0.650收集至少5000个颗粒；整个检测过程仪器参数保持不变，每个样本重复测定三次。
3.根据权利要求1所述的快速鉴定杨柳科植物倍性的方法，其特征在于，步骤(6)中，若已知倍性对照样品为二倍体，则在检测时将出峰位置设定在10×1000检测通道；之后检测未知样品，并根据出峰位置判断倍性：若出峰位置与对照接近，且位置偏离误差在5％以内，则为二倍体；若为20×1000，则为四倍体；若为30×1000，则为六倍体；以此类推；若已知倍性对照样品为四倍体，则在检测时将出峰位置设定在20×1000检测通道；之后检测未知样品，并根据出峰位置判断倍性：若出峰位置为10×1000，则为二倍体；若与对照位置接近，则为四倍体；若为30×1000，则为六倍体；以此类推。
4.根据权利要求1所述的快速鉴定杨柳科植物倍性的方法，其特征在于，步骤(6)中，未知样品的出峰位置误差不超过±5％。
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