CN105115950A - 一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，结合了FDA荧光探针的细胞特异性标记、共聚焦显微成像的可视化生物信息和流式细胞术至少1万个细胞以上的数据统计的优势，实现了对耐盐椒样薄荷快速、高效、准确的评价和鉴定。

Description

一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法

技术领域

本发明涉及植物筛选检测技术领域，特别是涉及一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，具体为应用荧光探针特异性标记细胞技术、细胞显微成像技术以及流式细胞技术，通过图像信息分析和流式细胞定量统计来获取植物相关生理指标并用于耐盐椒样薄荷的筛选和评价，同时该方法可以扩展应用于其他耐盐植物的筛选和评价。

背景技术

我国盐碱地面积超过15亿亩，其中仅黄河三角洲地区就有国家鼓励开发的盐碱地271万亩，这些土地不利于常规农作物生长，被大量闲置。通过种植耐盐植物改良盐碱地不仅可以提高土地的生产能力，还有利于改善盐渍环境下农业生态的良性循环。

椒样薄荷是唇形科薄荷属多年生草本植物。原产欧洲及地中海沿岸一带，我国河北、江苏、浙江、安徽、陕西、四川等地有少量栽培。椒样薄荷是天然香料，主要含薄荷酮、薄荷醇、乙酸薄荷酯等118种成分，其香气纯正，清爽宜人，广泛用于日用化妆品、医药和糖果食品。据国际贸易中心(UNTAD/GATT)统计，全世界每年椒样薄荷精油产量为3300吨，而年需求量为6000吨，中国只在陕西、新疆规模化栽培，产量仅为70吨左右。黄河三角洲气候条件适宜椒样薄荷的生长，发掘和筛选出耐盐椒样薄荷品种，在盐碱地上规模化种植，不“与粮争地”成为解决椒样薄荷精油原料来源的选择。

一般情况下，椒样薄荷在NaCl含量超过0.3%(约75mM)的盐碱土壤中就不能正常生长，其生物量和精油产量大幅减产。山东省应用微生物重点实验室从国内引进17个不同种类的薄荷品种，经自然选育发现高耐盐性单株，后采取隔离种植措施进行种植，通过在分子和细胞水平测定各生理生化指标确定了一株耐盐椒样薄荷变异株系——“科院1号”。后经在山东东营、河北唐海等滨海盐碱地多年连续种植，性状表现稳定，确定为耐盐新品种。耐盐椒样薄荷除具有薄荷的一般功效外，作为耐盐碱的药赏两用植物逐渐被关注，适合在黄河三角洲地区盐渍土壤上大规模推广种植。

椒样薄荷采取种根无性繁殖的方式，薄荷母本植株组织的异质性和外界环境条件的影响，常常使薄荷母株无性后代产生多种多样的变异，造成品种退化、耐盐碱能力下降、产量减少。因此，一方面需要对老一代品种的耐盐性进行评价和筛选，对其种质进行复壮和改良；另一方面需要快速、准确的筛选出新的耐盐椒样薄荷品种，扩大种质资源储备的多样性。

椒样薄荷的耐盐性评价主要是在大田或者盆栽培养条件下对检测其形态特征(如植株生长健壮、叶片大、叶茎比高等)、生理生化指标(如细胞质膜透性、脯氨酸、叶绿素、离子通道及酶活性等)、以及开展分子鉴定等。

传统的形态和生理生化的检测方法，操作步骤繁复，速度慢，评价和鉴定过程需要较长时间，且难以用于植物发育早期的鉴定；而分子鉴定的方法成本高，费时费力，容易受环境因素的影响。对于研究者来说，迫切需要一种简单、便捷、高效、准确率高的评价和鉴定方法。

盐渍化土壤含有多种盐分，其中NaCl是最主要的成分之一，一般认为盐胁迫影响农林作物生长的主要原因是由高浓度Na⁺的渗透和离子胁迫综合效应造成的。细胞质中过多的Na⁺破坏细胞内的离子稳态，引起生物膜功能紊乱和许多细胞质酶活性的抑制，进而影响细胞分裂、生长、发育和光合，最终导致细胞的死亡。

发明内容

本发明的目的就是针对上述存在的缺陷而提供一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，本发明应用荧光探针特异性标记细胞技术、细胞显微成像技术以及流式细胞技术，通过图像信息分析和流式定量统计来快速、高效、准确的获取细胞的死亡率，用来对耐盐椒样薄荷进行评价和筛选。

本发明的一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法技术方案为，应用荧光探针特异性标记细胞技术、细胞显微成像技术以及流式细胞技术，通过图像信息分析和流式细胞定量统计来计算经过盐胁迫处理的细胞存活率并用于耐盐椒样薄荷的筛选和评价。

所述的荧光探针特异性标记细胞技术，以二乙酸荧光素为指示剂，对经过盐胁迫处理的椒样薄荷植株的叶肉细胞原生质体进行染色，在光源激发下，有活力的原生质体产生荧光，而无活力的原生质体无荧光产生。

激发光源波长为488nm，探测500-550nm的带通光。

染色时荧光染料FDA的终浓度为50-100μM，染色时于黑暗中静置5-15分钟。

染色时荧光染料FDA的终浓度为50μM。

叶肉细胞原生质体的状态要完整、均一，否则影响染色效果和检测的准确性。由于叶片柄部和顶部部分细胞发育分化不完全，叶绿体分布不均，提取的原生质体状态不一，所以选取叶片中部来提取原生质体，这样能够获得状态完整、均一的原生质体。

盐胁迫处理叶肉细胞原生质体时，选择化学纯的NaCl，溶液浓度为150mM，处理3小时。

所述的细胞显微成像技术，是采用共聚焦显微镜获取荧光图像，活细胞呈黄色，而死细胞呈红色，分别对呈黄色和红色的细胞进行计数，来统计活细胞和死细胞的数量，计算细胞存活率。

所示的流式细胞技术，是采用流式细胞仪，将525nm处的发射峰值作为测定FDA荧光强度的相对测定值，每次检测至少选取10,000个细胞，具有高FDA荧光强度的细胞数量越多，则表明细胞存活率高，反之，则细胞存活率越低。

在采用流式细胞仪检测开始之前，使用未经盐胁迫处理的正常细胞作为对照进行荧光补偿调节，用来去除光谱重叠以及设定Gate的位置。因检测细胞的类型、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经NaCl处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

本发明技术方案具体如下：

1.硬件和软件系统

本发明筛选和评价方法的硬件系统包括一台配有电脑的激光共聚焦显微镜以及一台配有电脑的流式细胞仪。软件系统包括共聚焦显微镜的高精度可控电动平台控制及图像采集和识别系统，以及流式细胞仪的智能分选控制系统和信号采集及数据处理系统。

2.细胞活力检测的荧光染料——二乙酸荧光素(Fluoresceindiacetate,FDA)

FDA是一种酯类化合物，它本身无荧光也无极性，可透过完整的细胞膜。一旦进入细胞后，由于受到细胞内酯酶的分解而产生有荧光的极性荧光素，这种极性的荧光素不能自由出入细胞膜。因此，在一定波长光源激发下，有活力的细胞便产生绿色荧光，而无活力的细胞不能分解FDA，因此无荧光产生。在共聚焦显微镜下，根据细胞荧光的有无，可以准确检测细胞活性，进而统计细胞存活率；在流式细胞仪下，根据细胞荧光的有无和强弱，则可以实现对细胞活性的准确、定量检测。

准确称取适量FDA溶解于二甲基亚砜(DMSO)中，配置成浓度为25mM的母液，分装于600μL离心管中，避光保存于-20^oC冰箱。使用时，将母液稀释10倍配成2.5mM的工作液。

FDA的激发和发射波长分别为488nm和530nm。实验中我们选择488nm激发，探测500~550的带通光。

3.椒样薄荷叶肉细胞原生质体的制备及染色方法

(1)叶肉细胞原生质体的提取

取椒样薄荷叶片，用锋利的刀片将其切割成0.5-1mm的小条。大约10-20个叶片溶解于5-10mL的酶解液中抽真空30-60min后，置于黑暗中继续酶解3h。用孔径为35-75μm的尼龙网过滤，100g离心力下离心3min，将下层原生质体小心的悬浮于W5溶液中，悬浮浓度1-2×10⁵个/ml。

酶解液配法为：1%-1.5%纤维素酶R10，0.2%-0.4%离析酶R10，0.4M甘露醇，20mMKCl，20mMMES(pH5.7)，10mMCaCl₂。W5溶液配法为：2mMMES(pH5.7)，154mMNaCl，125mMCaCl₂，5mMKCl。

由于叶片柄部和顶部部分细胞发育分化不完全，叶绿体分布不均，提取的原生质体状态不一，所以选取叶片中部切割成小条来提取原生质体。

(2)FDA染色方法

将分离好的原生质体(悬浮浓度2×10⁵protoplasts/mL)悬浮于96孔细胞培养板，然后加入150mM的氯化钠(NaCl)溶液，处理3小时。然后取浓度为2.5mM的FDA工作液，加入到原生质体悬浮液中，使FDA终浓度为50μM，并于黑暗中静置5-15min，然后轻轻的将上面的FDA溶液吸出，再加入新的W5悬浮液。之后进行共聚焦显微镜和流式细胞仪的检测。

根据不同实验材料的差异，如果50μM的终浓度染色效果不佳，可以提高FDA工作液的加入量使终浓度达到100μM。

4.FDA荧光的共聚焦显微成像及细胞存活率的统计

将经FDA染色的叶肉细胞原生质体转移到96孔板的内60孔中，每组5个复孔，放到共聚焦显微镜的载物平台上，读取荧光图像。荧光拍摄参数为：使用氩离子激光中的488nm激光作为激发光源，选择合适的分色镜后通过500-550nm的带通滤光片探测。叶绿素自发荧光用488nm激光激发，长通650nm探测。曝光时间500ms，物镜放大倍数10倍。每孔拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统导出数据，进行下一步的细胞存活率统计。

在共聚焦获得的荧光图像中，活细胞呈黄色(叶绿体的红色荧光与FDA的绿色荧光叠加的结果)，而死细胞呈红色(由于死细胞不能染上FDA的绿色荧光，只有叶绿体的红色荧光)。在获得的荧光图像中，分别对呈黄色和红色的细胞进行计数，来统计活细胞和死细胞的数量，计算细胞存活率。至少选取5张荧光图像，每张图像中计数的细胞不少于200个。

5.FDA荧光的流式细胞仪检测及细胞存活率的统计

将经FDA染色的叶肉细胞原生质体移入流式管中，送进流式细胞仪进行检测。采用488nm激发，收集500-600nm的发射光谱，然后将525nm处的发射峰值作为测定FDA荧光强度的相对测定值，每次检测至少选取10,000个细胞。

荧光补偿调节：在检测开始之前，使用未经NaCl处理的正常细胞作为对照进行荧光补偿调节，用来去除光谱重叠以及设定Gate的位置。因检测细胞的类型、使用的检测仪器不同，因而流式检测的荧光补偿也不同，因此建议每次检测均需使用未经NaCl处理的细胞作为对照，进行荧光补偿的调节。

使用Cellquest软件获取数据，并利用FCSExpress软件进行数据分析，根据FDA荧光强度的分布来统计细胞存活率的高低。具有高FDA荧光强度的细胞数量越多，则表明细胞存活率高，反之，具有高FDA荧光强度的细胞数量越少，细胞存活率越低。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，结合了荧光探针的细胞特异性标记、共聚焦显微成像的可视化生物信息和流式细胞术至少1万个细胞以上的数据统计优势，实现了对耐盐椒样薄荷快速、高效、准确的评价和鉴定。

本发明方法设计合理，提供的筛选和评价系统结构完善，具有很高的应用价值。而且与传统生理生化和分子的手段相比，该方法具省工省时，有效压缩了田间试验的规模，且不受季节和环境的影响，提高了评价和鉴定效率。通过该方法在发育早期快速、准确、高效的淘汰不耐盐的品系，能够加速椒样薄荷现有品种的优化和新品种的选育，加快耐盐植物育种的步伐，具有十分广阔的应用前景，同时该方法对其他作物的耐盐能力的快速鉴定具有重要的参考价值。

附图说明

图1所示为椒样薄荷叶肉细胞原生质体图像；

图2所示为150mMNaCl处理3小时后FDA荧光的共聚焦显微成像结果；

图3所示为150mMNaCl处理3小时后共聚焦显微镜成像细胞存活率统计图；

图4所示为150mMNaCl处理3小时后FDA荧光的流式细胞仪检测结果。

具体实施方式：

为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。

实施例1

以不耐盐的野生型椒样薄荷(WT)和耐盐椒样薄荷“科院1号”(Keyuan-1)为例进行说明。

野生型椒样薄荷在NaCl含量超过0.3%(约75mM)的土壤中就不能正常生长，其生物量和精油产量大幅减产。“科院1号耐”盐椒样薄荷是山东省应用微生物重点实验室从国内引进17个不同种类的薄荷品种，经自然选育发现高耐盐性单株，后采取隔离种植措施进行种植，通过在分子和细胞水平测定各生理生化指标确定其为耐盐变异株系，于2014年被山东省草品种审定委员会审定登记为育成品种(品种登记号：038)，适合在黄河三角洲地区盐渍土壤上大规模推广种植。“科院1号”能够耐受0.8%(约150mM)的NaCl胁迫，在该浓度下，植株能正常生长，叶片能够保持正常的光合活性，且能维持较高的精油品质和产量。

试剂：

二乙酸荧光素(FDA)，购自Sigma-AldrichChina；

二亚基亚砜(DMSO)购自Sigma-AldrichChina；

酶解液，包括纤维素酶cellulaseR10(YakultHonsha,Japan)和离析酶macerozymeR10(YakultHonsha,Japan)，购自北京鼎国生物技术公司；

W5溶液；

仪器：

激光共聚焦扫描显微镜(LSMFV1000,Olympus,Japan)；

流式细胞仪(FACSCalibur,BectonDickinson,USA)；

人工光照培养气候箱(Conviron,modelE7/2,Canada)；

1.准确称取10.4mgFDA溶于1mLDMSO中，配成25mM的母液，分装于600μL离心管中，避光保存于-20^oC冰箱。使用时，将母液稀释10倍配成2.5mM的工作液待用。

2.利用酶解液提取WT椒样薄荷和Keyuan-1椒样薄荷的叶肉细胞原生质体，W5溶液悬浮。在96孔板中分别加入100μLWT椒样薄荷和Keyuan-1椒样薄荷的叶肉细胞原生质体。加入150mM的NaCl溶液，处理3小时。每组处理5个重复，且只加在96孔板的中间60孔。

3.取2μL浓度为2.5mM的FDA工作液，加入到100μL原生质体悬浮液中，使FDA终浓度为50μM，并于黑暗中静置5-15min，然后轻轻的将上面的FDA溶液吸出，再加入新的W5悬浮液。之后进行共聚焦显微镜和流式细胞仪的检测。

4.取100μL样品放到共聚焦显微镜的载物平台上，读取荧光图像。使用氩离子激光中的488nm激光作为激发光源，选择合适的分色镜后通过500-550nm的带通滤光片探测。叶绿素自发荧光用488nm激光激发，长通650nm探测。曝光时间500ms，物镜放大倍数10倍。每孔拍摄6幅图像，并经过荧光图像拼接、图像识别以及数据输出系统导出数据，进而统计出细胞存活率，如说明书附图图2、图3所示。

5.取100μL将样品转移到流式管中，送进流式细胞仪进行检测。采用488nm激发，收集500-600nm的发射光谱，然后将525nm处的发射峰值作为测定FDA荧光强度的相对测定值，每次检测选取10,000个细胞。使用Cellquest软件获取数据，并利用FCSExpress软件进行数据分析，根据FDA荧光强度的分布来统计细胞存活率的高低，如说明书附图图4所示。

6.基于荧光标记的叶肉细胞原生质体成活率与耐盐性的相关性分析：

FDA荧光检测的实验结果表明，在150mMNaCl处理3小时后，耐盐椒样薄荷科院1号的叶肉细胞原生质体死亡率明显低于野生型椒样薄荷。科院1号能保持90%左右的存活率，与对照无明显差异。而野生型椒样薄荷的原生质体大部分丧失了细胞活力。说明椒样薄荷的耐盐能力与FDA标记的细胞活力高度相关，用150mMNaCl处理，通过统计细胞活力，能快速、准确的筛选出耐盐椒样薄荷。

Claims (10)

1.一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，其特征在于，应用荧光探针特异性标记细胞技术、细胞显微成像技术以及流式细胞技术，通过图像信息分析和流式细胞定量统计来计算经过盐胁迫处理的细胞存活率并用于耐盐椒样薄荷的筛选和评价。

2.根据权利要求1所述的一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，其特征在于，所述的荧光探针特异性标记细胞技术，以二乙酸荧光素为指示剂，对经过盐胁迫处理的椒样薄荷植株的叶肉细胞原生质体进行染色，在光源激发下，有活力的原生质体产生荧光，而无活力的原生质体无荧光产生。

3.根据权利要求2所述的一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，其特征在于，激发光源波长为488nm，探测500-550nm的带通光。

4.根据权利要求2所述的一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，其特征在于，染色时荧光染料FDA的终浓度为50-100μM，染色时于黑暗中静置5-15分钟。

5.根据权利要求4所述的一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，其特征在于，染色时荧光染料FDA的终浓度为50μM。

6.根据权利要求2中所述的一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，其特征在于，叶肉细胞原生质体的状态要完整、均一。

7.根据权利要求2中所述的一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，其特征在于，盐胁迫处理叶肉细胞原生质体时，选择化学纯的NaCl，溶液浓度为150mM，处理3小时。

8.根据权利要求1中所述的一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，其特征在于，所述的细胞显微成像技术，是采用共聚焦显微镜获取荧光图像，活细胞呈黄色，而死细胞呈红色，分别对呈黄色和红色的细胞进行计数，来统计活细胞和死细胞的数量，计算细胞存活率。

9.根据权利要求1中所述的一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，其特征在于，所示的流式细胞技术，是采用流式细胞仪，将525nm处的发射峰值作为测定FDA荧光强度的相对测定值，每次检测至少选取10,000个细胞，具有高FDA荧光强度的细胞数量越多，则表明细胞存活率高，反之，则细胞存活率越低。

10.根据权利要求9中所述的一种耐盐椒样薄荷的筛选和评价方法，其特征在于，在采用流式细胞仪检测开始之前，使用未经盐胁迫处理的正常细胞作为对照进行荧光补偿调节，用来去除光谱重叠以及设定Gate的位置。