CN102517384A

CN102517384A - 一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法

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Publication number: CN102517384A
Application number: CN201110417783XA
Authority: CN
Inventors: 王丽花; 瞿素萍; 杨秀梅; 吴学尉; 张丽芳; 张艺萍; 苏艳; 彭绿春
Original assignee: Flower Research Institute of YAAS
Current assignee: Flower Research Institute of YAAS
Priority date: 2011-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2012-06-27

Abstract

本发明公开了一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法。包括利用萃取裂解缓冲液和染色缓冲液进行单细胞悬浮液制备；采用德国partec公司生产的CyFlow?Cube型号的流式细胞仪测定样品DNA荧光强度进行倍性分析；对比待测样品与对照的DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，即可鉴定出待测样品的倍性水平。流式细胞仪倍性鉴定结果与根尖染色体计数倍性鉴别结果相一致。应用此法，可快速筛选鉴定出批量的非洲菊大孢子再生植株倍性，大大提高DH群体构建和遗传图谱绘制的效率，从而加速了育种进程。本发明制样简单、检测快速、具有稳定的高检出率。

Description

一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法

技术领域

本发明涉及一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法，属生物技术领域，专用于非洲菊大孢子再生植株倍性的快速鉴定。

背景技术

非洲菊(Gerbera jamesonil Bolus)又名扶郎花，为菊科大丁草属植物，其花色艳丽，可用作切花生产或盆栽观赏，全世界广泛分布，是一种观赏价值较高的花卉。目前，生产中迫切需要耐低温、耐弱光、抗疫病和抗病毒病的优质高产非洲菊新品种，但常规育种周期长而且变异谱范围有限，不易捕捉目标性状。通过花粉(花药)培养获得双单倍体是高效利用种质资源和提高选育效率的一种方法。

非洲菊为典型的异花授粉作物，自交衰退严重，且雄配子诱导反应较差，而且其特殊的花器构造导致花粉或小孢子培养的外植体灭菌难度较大，难以获得成功，因而，通过离体大孢子培养获得单倍体尤其具有独特的价值，并成为目前获得非洲菊双单倍体的唯一可行途径，可加速育种材料纯化，缩短育种周期，加速育种进程。

然而，通过非洲菊大孢子培养获得的再生大孢子植株群体或非洲菊单倍体经秋水仙碱处理的组培苗植株，在这些植株中，除育种家需要的单倍体、双单倍体(Doubled Haploid，DH)植株外，还包含四倍体及非整倍体等，育种家必须花费大量的时间来鉴别真正的单倍体和双单倍体植株。有效的倍性鉴定是了解其遗传背景和进一步应用大孢子再生植株的基础，特别是大量的非洲菊大孢子再生植株和大孢子再生单倍体植株经秋水仙碱处理的试管苗前期倍性鉴定，不仅可以大大减少育种工作量，加快育种进程，而且可以提前进行分子标记辅助选择和遗传图谱构建工作。

另外，非洲菊从苗期到开花期，没有明显的形态学性状可用于区别不同的倍性水平。尽管在开花期单倍体可能产生不正常的花和败育的花粉，个别四倍体植株可能产生较大的花，但二倍体和四倍体（如非洲菊品种‘金葵花’）仍然难以区别。因此，长期以来都是通过显微观察来鉴定个体的染色体倍性，主要方法有：花粉粒大小判别法、根尖染色体计数法、气孔保卫细胞叶绿体计数法、保卫细胞长度测量法等。这些显微方法不仅费时，而且技术难度大。此外，采用花粉大小判别法需在开花期进行，占地且费时；而采用保卫细胞长度测量法，由于单倍体和二倍体以及二倍体和四倍体的保卫细胞长度重叠而不准确。

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM) 是在单细胞水平上，应用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的大量细胞或生物颗粒的理、化及生物学特性进行分析的方法。它可定量地测定某一细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞群体中上述成分含量不同的细胞数量，特别是它还可将某一特异染色的细胞从数以万计的细胞群体中分离出来，因此近年来得到越来越广泛的应用。目前，流式细胞术已普遍应用于免疫学、血液学、肿瘤学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学等临床医学和基础医学研究领域，但在植物方面的应用直到20世纪80年代中期才开始。由于流式细胞仪可以直接测定细胞的DNA含量，从而快速鉴定出植株倍性水平，不受植株生长发育时期和环境条件的影响，不仅省时、高效，而且还可以快速、直观、高效的检测出非整倍体和混倍体。目前已被成功地用于花椰菜、青花菜、抱子甘蓝、葡萄、大白菜、猕猴桃植株的倍性鉴别上，但由于各种作物的遗传物质和倍体有所差异，运用流式细胞术对其进行倍性鉴别有特殊的要求，所以，至今还未见用流式细胞术用于非洲菊大孢子再生植株的倍性鉴定报道。

发明内容

本发明提供一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法。针对上述现有技术中非洲菊大孢子再生植株的倍性鉴定存在的问题，将流式细胞仪应用到非洲菊大孢子再生植株的倍性鉴定上，建立非洲菊大孢子再生植株的流式细胞仪倍性鉴定体系，从而提高非洲菊大孢子再生植株的倍性鉴定效率，加速育种材料的选育和遗传图谱的构建。

一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理制剂的制备：

样品前处理制剂由萃取裂解缓冲液和染色缓冲液组成，染色缓冲液需现配现用；

所述的萃取裂解缓冲液的配制：

用蒸馏水配制pH为3，终浓度为2 %质量分数的聚乙烯毗咯烷酮K30(Polyvinyl Pyrrolidone K30，PVPK30)，100 mM的一水柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O），0.5 %体积比的Tween 20的混合缓冲液，贮藏于4℃保存；

所述的染色缓冲液的配制：

1 mg 4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐（4’,6-Diamidino-2-phenylindole,dihydro-

chloride，DAPI）溶于浓度为400 mM的Na₂PO₄·12H₂O缓冲液500mL中，用蒸馏水配制， pH为9，现配现用；

（2）单细胞悬浮液的制备：

切取0.2～0.5 m²洁净的非洲菊大孢子再生试管苗幼叶置于培养皿中，加步骤（1）所述的萃取裂解缓冲液400μl，用刀从纵横两个垂直方向快速将小叶片切碎，并使碎片完全浸于萃取液中，避光静置萃取2～5min，后再加步骤（1）所述现配制的染色缓冲液1600 μl，混匀，避光静置染色5～8min，30μm滤网过滤，滤液收集于流式细胞仪机用标准样品管，所收集的滤液即为单细胞悬浮液；

（3）对照及待测样品的流式细胞术倍体水平鉴定

设置已知倍性的非洲菊试管苗为对照材料，将对照样品单细胞悬浮液置于德国partec公司生产的CyFlow? Cube型号流式细胞仪测定，流式细胞仪激发光源为20mW、488nm的蓝宝石固体激光；测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道畅通，喷嘴清洁；控制样品进样速度为0.1至20微升/秒，各通道的变异系数CV稳定且在0～3％，手动控制细胞流速在100～120个/秒以保持细胞分离纯度。通过与CyFlow? Cube型号流式细胞仪相连的Partec CyView 85计算机分析软件，调整电压以设置对照DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，即可进行待测样品的倍性鉴定；同对照相同的测试条件下，对比待测样品与对照产生的DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，鉴定出待测样品的倍性水平，具体是：

① 以已知的二倍体非洲菊试管苗为对照时，设置对照样品DNA含量荧光强度分离峰在横坐标100的位置，当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标100±5%的位置时，该待测样品为二倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标50±5%的位置时，该待测样品为单倍体；当待测样品的DNA含量直方图出现两个以上分离峰，且最高分离峰和最矮分离峰的高度相差不超过一半的为混倍体，混倍体的倍性组成由各分离峰所在横坐标的荧光强度位置确定。分离峰在横坐标的偏离允许范围为±5.0%，此步骤适用于单倍体的鉴定；

②以已知的非洲菊大孢子再生单倍体植株试管苗为对照时，将对照样品DNA含量荧光强度分离峰设置在横坐标50的位置，当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标50±5%的位置时，该待测样品为单倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标100±5%的位置时，该待测样品为双单倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标200±5%的位置时，该待测样品为四倍体；当待测样品的DNA含量直方图出现两个以上分离峰，且最高分离峰和最矮分离峰的高度相差不超过一半的为混倍体，混倍体的倍性组成可由各分离峰所在横坐标的荧光强度位置确定。分离峰在横坐标的偏离允许范围为±5.0%，此步骤适用于双单倍体的鉴定。

本发明将流式细胞仪应用于非洲菊大孢子再生植株的倍性鉴定，建立了非洲菊大孢子再生植株的流式细胞仪倍性鉴定体系。与现有技术相比，有益效果是：

(1) 基于DNA含量水平的倍性鉴定，准确、灵敏度和分辨率高，特别适合于倍性较为复杂的样品或样品数量较多的倍性检测分析，是一种专门适用于用流式细胞术快速鉴定非洲菊大孢子再生植株倍性水平的方法。

（2）制样简单，该方法不受植物体取材部位和细胞所处时期限制，取材部位可以是叶片、茎、根、花、果皮、种子等。特别是在离体培养过程中，试管中的芽或小植株很小和很嫩时，此方法仅用1 cm²的样品就很容易鉴定其材料倍性。

(3)测试速度快，仅用1～3 min就可以分析上万个细胞，测定出单个细胞核内DNA含量，并且DNA含量变异可在分布图上直观地看出。

（4）本发明提供的一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法，实现了非洲菊倍性鉴定的批量快速检测，可节省大量的人力、物力和财力，加速育种进程，为非洲菊新品种选育提供了技术支撑。

附图说明

图1是实施例1对照样品即非洲菊品种‘菊派王’的二倍体植株叶片样品DNA含量直方图。

图2是实施例1待测非洲菊品种‘菊派王’大孢子培养再生的单倍体植株叶片样品DNA含量直方图。

图3是实施例1待测非洲菊品种‘菊派王’大孢子培养再生的二倍体植株叶片样品DNA含量直方图。

图4是实施例1待测非洲菊品种‘菊派王’大孢子培养再生的混倍体植株叶片样品DNA含量直方图。

图5是实施例2对照样品即非洲菊品种‘热带草原’单倍体植株叶片样品DNA含量直方图。

图6是实施例2待测非洲菊品种‘热带草原’大孢子培养再生单倍体植株，经秋水仙碱处理获得的双单倍体植株叶片DNA含量直方图。

图7是实施例2待测非洲菊品种‘热带草原’大孢子培养再生单倍体植株，经秋水仙碱处理无加倍现象的单倍体植株叶片DNA含量直方图。

图8是实施例2待测非洲菊品种‘热带草原’大孢子培养再生单倍体植株，经秋水仙碱处理获得的四倍体植株叶片DNA含量直方图。

图9是实施例2待测非洲菊品种‘热带草原’大孢子培养再生单倍体植株，经秋水仙碱处理的混倍体植株叶片DNA含量直方图。

图1～图9的横坐标为样品DNA含量荧光强度，纵坐标为样品细胞计数。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的内容并不仅限于这些。以下实施例所采用的非洲菊品种材料不是利用该品种的遗传特异性，因此，也可以采用其它非洲菊品种采用本发明方法鉴定其倍性，并且这些非洲菊品种材料均是商业化品种，可以通过商业渠道购买到，如可以在云南云科花卉有限公司购买，地址是：云南省昆明市北郊龙头街桃园村。

实施例1 非洲菊大孢子再生植株的倍性鉴定

1、材料与样品处理制剂的制备

①待测样品材料：非洲菊品种‘菊派王’，该品种来源于云南农科院花卉所非洲菊种质资源保存圃的，用王丽花等(王丽花等.非洲菊未授粉胚株离体诱导和植株再生[J].生理学通讯,2007,43(6)1089-1092)的方法对其进行大孢子诱导培养，获得大孢子再生植株24株，采用德国partec公司生产的CyFlow? Cube型号的流式细胞仪，对大孢子再生植株进行流式细胞仪倍性分析。应用的分析软件为Partec CyView 85软件。

②对照样品材料：非洲菊品种‘菊派王’的常规试管苗，经根尖染色体鉴定为二倍体(2n=2x=50)材料。

③样品处理制剂的制备：样品处理制剂由萃取裂解缓冲液和染色缓冲液组成，染色缓冲液现用现配。

所述的萃取裂解缓冲液的配制：

用蒸馏水配制pH为3，终浓度为2 %质量分数的聚乙烯毗咯烷酮K30(Polyvinyl Pyrrolidone K30，PVPK30)，100 mM的一水柠檬酸（C₆H₈O₇·H₂O），0.5 %体积比的Tween 20的混合缓冲液，贮藏于4℃保存。

所述的染色缓冲液的配制：

chloride，DAPI）溶于浓度为400 mM的Na₂PO₄·12H₂O缓冲液500mL中，用蒸馏水配制，pH为9，现配现用。

2、单细胞悬浮液的制备：

①对照样品的制备：切取对照样品试管苗幼叶0.5 m²，加萃取裂解缓冲液400μl，用锋利的新手术刀片从纵横两个垂直方向快速切碎，并使碎片完全浸于萃取裂解缓冲液中，避光静置萃取2 min，后再加1600μl染色缓冲液，快速混匀，避光静置染色5min，30μm滤网过滤，滤液收集于德国partec公司生产的CyFlow? Cube型号流式细胞仪机用标准样品管，所收集的滤液即为对照样品单细胞悬浮液，迅速上机测定。

②待测样品的制备方法与对照样品的制备相同，各测试样品设置3个以上重复。

3、流式细胞仪对样品倍性的测定及倍性分析

测定前自动清洗流式细胞仪使管道畅通，喷嘴清洁，仪器处于最佳状态；控制样品进样速度为0.1至20微升/秒，各通道的变异系数CV稳定且在0～3％，手动控制细胞流速在100～120个/秒以保持细胞分离纯度，荧光强度由仪器自动检出。通过与CyFlow? Cube型号流式细胞仪相连的Partec CyView 85计算机分析软件，调节电压值为317伏，使对照DNA含量荧光强度分离峰设置于横坐标100的位置（见图1）。

由于对照样品材料为已知二倍体，因而待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处于横坐标100±0.05的位置为二倍体（峰值在横坐标偏离的允许范围为±5.0%）；而待测样品的DNA含量峰值处于横坐标的50±0.05为单倍体。出现两个或多个高度相近（最高和最矮分离峰的高度相差不超过一半）分离峰的为混倍体。即待测样品的荧光强度分离峰在横坐标上的位置与对照标样荧光强度分离峰处于横坐标上的位置相近的为二倍体，为对照1／2的为单倍体，出现2个或以上分离峰的为混倍体，混倍体又可根据各峰值与对照的倍数关系确定其构成细胞的倍性组成，从而确定出待测样品的倍性水平。待测非洲菊‘菊派王’的24株大孢子再生植株中，有9株为单倍体(见图2)，14株为二倍体(见图3)，1株为混倍体(见图4)。

单倍体与根尖染色体鉴定结果和植株形态鉴别相吻合，但混倍体、二倍体与正常二倍体植株应用根尖染色体计数或形态特征难以区分，而利用流式细胞仪可在几分钟内快速鉴定出其倍性水平。这样可以在瓶苗诱导早期就可对大孢子再生植株进行倍性鉴定，鉴定出的单倍体迅速扩繁后便可进行加倍处理，获得双单倍体，避免浪费过多的人力和药品。特殊倍性的植株还可应用于细胞遗传学方面的研究。

实施例2 非洲菊大孢子再生单倍体植株经秋水仙碱处理获得的试管苗倍性鉴定。

1、材料与方法

①待测样品材料：非洲菊品种‘热带草原’，该品种来源于云南农科院花卉所非洲菊种质资源保存圃，利用王丽花等(王丽花等.非洲菊未授粉胚株离体诱导和植株再生[J].生理学通讯,2007,43(6)1089-1092)的方法对其进行大孢子诱导培养，获得大孢子再生植株11株，经根尖染色体鉴定，获得单倍体3株，扩繁此3株单倍体分别至50株以上，置于添加0.025%的秋水仙碱的扩繁培养基MS+BA 0.6 mg.L^-1+NAA 0.1 mg.L^-1 (pH 5.8)中处理6天。处理结束后转入MS+BA 0.3 mg.L^-1+NAA 0.1 mg.L^-1 (pH 5.8)培养基中恢复培养30～50 d。后加倍处理的正常成活植株114株采用德国partec公司生产的CyFlow? Cube型号流式细胞仪对其进行流式细胞术倍性分析。应用的分析软件为Partec CyView 85软件。

②对照样品材料：通过根尖染色体计数法鉴定非洲菊品种‘热带草原’大孢子再生植株，而获得的单倍体试管苗(2n=x=25)。

2、单细胞悬浮液的制备：

待测样品和对照样品的单细胞悬浮液的制备除以下措施不同外，其余措施与实施例1相同，不再赘述。

（1）切取的待测样品试管苗幼叶和对照样品试管苗幼叶为0.2 m²；

（2）避光静置萃取5 min；

（3）避光静置染色8min。

3、流式细胞仪倍性分析

测定前自动清洗流式细胞仪使管道畅通，喷嘴清洁，仪器处于最佳状态，样品进样速度为0.1至20微升/秒；各通道的变异系数CV稳定且在0～2％以下，荧光强度由仪器自动检出，通过手动控制细胞流速在100～120个/秒以保持细胞分离纯度。以根尖染色体计数鉴定出的‘热带草原’单倍体(2n=x=25)组培苗为标样，峰值与对照相近的为单倍体（所述的“相近”是指分离峰在横坐标位置的偏离允许范围为±5.0%。），为对照2倍的为双倍体，3倍的为三倍体、4倍的为四倍体，出现2个或以上分离峰的为混倍体，混倍体根据各分离峰与单倍体分离峰的倍数关系确定其构成细胞的倍性组成，从而确定出待测样品的倍性水平。峰值偏离允许范围为±5.0%。

4、结果与分析

经根尖染色体鉴定为单倍体（2n=x=25）的‘热带草原’组培苗设定为对照标样，设置其荧光强度的分离峰处于横坐标50的位置（见图5）。流式细胞仪倍性鉴定结果表明，待测植株峰值处于50附近（所述的“附近”是指分离峰在横坐标位置的偏离允许范围为±5.0%。）的视为单倍体，而处在100和200附近的分别视为双单倍体和四倍体。出现两个或多个高度相近分离峰的为混倍体。扩繁的非洲菊大孢子再生单倍体植株经秋水仙碱加倍处理后正常成活114株，其中，59株为双单倍体(见图6)，占51.7%；14株无加倍现象为单倍体(见图7)，占12.3%；17株为四倍体(见图8)，占14.9%；24株为混倍体(见图9)，占21.1%。

本发明针对对大量的非洲菊大孢子再生植株和大孢子再生单倍体植株经秋水仙碱处理的试管苗，建立了适宜非洲菊大孢子培养再生植株的流式细胞仪倍性鉴定的方法，大大提高了DH群体构建和遗传图谱绘制的效率，从而加速了育种进程。

Claims

1.一种用流式细胞术快速鉴定非洲菊倍性的方法，包括以下步骤：

（1）样品前处理制剂的制备：

样品前处理制剂由萃取裂解缓冲液和染色缓冲液组成，染色缓冲液需现配现用；所述的萃取裂解缓冲液的配制：用蒸馏水配制pH为3，终浓度为2 %质量分数的聚乙烯毗咯烷酮K30，100 mM的一水柠檬酸，0.5 %体积比的Tween 20的混合缓冲液，贮藏于4℃保存；所述的染色缓冲液的配制：1mg 4’,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐溶于浓度为400 mM的Na₂PO₄·12H₂O缓冲液500mL中，用蒸馏水配制，pH为9；

（2）单细胞悬浮液的制备：

切取0.2～0.5 m²洁净的非洲菊大孢子再生试管苗幼叶置于平底培养皿中，加步骤（1）所述的萃取裂解缓冲液400μl，用刀片从纵横两个垂直方向快速将小叶片切碎，并使碎片完全浸于萃取液中，避光静置萃取2～5min，后再加步骤（1）所述现配制的染色缓冲液1600 μl混匀，避光静置染色5～8min，30μm滤网过滤，滤液收集于流式细胞仪机用标准样品管，所收集的滤液即为单细胞悬浮液；

（3）对照及待测样品的流式细胞术倍体水平鉴定

设置已知倍性的非洲菊试管苗为对照材料，将对照样品单细胞悬浮液置于德国partec公司生产的CyFlow? Cube型号流式细胞仪测定，流式细胞仪激发光源为20mW、488nm的蓝宝石固体激光；测定前流式细胞仪自动清洗内部使管道畅通，喷嘴清洁；控制样品进样速度为0.1至20微升/秒，各通道的变异系数CV稳定且在0～3％，手动控制细胞流速在100～120个/秒以保持细胞分离纯度；通过与CyFlow? Cube型号流式细胞仪相连的Partec CyView 85计算机分析软件，调整电压设置对照DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，即可进行待测样品的倍性鉴定；同对照相同的测试条件下，对比待测样品与对照产生的DNA含量荧光强度分离峰所在横坐标的位置，即可鉴定出待测样品的倍性水平，具体是：

①以已知的二倍体非洲菊试管苗为对照时，设置对照样品DNA含量荧光强度分离峰在横坐标100的位置，当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标100±5%的位置时，该待测样品为二倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标50±5%的位置时，该待测样品为单倍体；当待测样品的DNA含量直方图出现两个以上分离峰，且最高分离峰和最矮分离峰的高度相差不超过一半的为混倍体，混倍体的倍性组成由各分离峰所在横坐标的位置确定；

②以已知的非洲菊大孢子再生单倍体植株试管苗为对照时，将对照样品DNA含量荧光强度分离峰设置在横坐标50的位置，当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标50±5%的位置时，该待测样品为单倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标100±5%的位置时，该待测样品为双单倍体；当待测样品的DNA含量荧光强度分离峰处在横坐标200±5%的位置时，该待测样品为四倍体；当待测样品的DNA含量直方图出现两个以上分离峰，且最高分离峰和最矮分离峰的高度相差不超过一半的为混倍体，混倍体的倍性组成由各分离峰所在横坐标的位置确定。