CN109100188A - 一种对鲑鳟鱼胚胎进行倍性鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

一种对鲑鳟鱼胚胎进行倍性鉴定的方法，它涉及一种对鱼胚胎进行倍性鉴定的方法。本发明方法能够缩短倍性鉴定周期，避免养殖过程中外界因素导致的生产损失。鉴定方法：一、将鲑鳟鱼胚胎用固定液固定；二、制胚胎细胞悬浊液；三、用细胞核染液将切除头部及其它可辨识胚胎组织后的剩余胚胎细胞冲洗至步骤二胚胎细胞悬浊液中，过滤，获得检测样本；四、已知鲑鳟鱼二倍体样本用倍性分析仪检测，并调整荧光信号值至100处设定为对照样本；将检测样本染色后用倍性分析仪检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与对照样本峰值图比较，确定检测样本的倍性大小。

Description

一种对鲑鳟鱼胚胎进行倍性鉴定的方法
技术领域
本发明涉及一种对鱼胚胎进行倍性鉴定的方法。
背景技术
鱼类染色体操作技术(雌核发育和多倍体诱导)在水产动物育种领域发挥着重要作用。目前，国际上有关多倍体诱导的研究工作进展很快。在鲑鳟类、鲆鲽类、罗非鱼等海、淡水鱼类中诱导出三倍体，在鲑科鱼类中己获得了大西洋鲑、硬头鳟、虹鳟、细鳞大麻哈鱼、大鳞大麻哈鱼和美洲红点等同源三倍体。近年来国内也成功地诱导出了三倍体团头鲂、水晶彩鲫、真鲷、黑鲷、牙鲆和虹鳟，尤其在上世纪八十年代中期到九十年代初期，中国水产科学研究院黑龙江水产研究所就开展了虹鳟全雌培育技术研究，并本世纪初完成了虹鳟三倍体制种技术研究，初步实现了三倍体的规模化生产；之后，中国水产科学研究院黑龙江水产研究所还开展了三倍体山女鳟和三倍体金鳟制种技术的研究。
有关鱼类倍性鉴定方法有很多种，包括：染色体计数法、红细胞及细胞核体积测量法、核仁组织区银染计数法、体细胞DNA相对含量测定法等。染色体技术法需要获得鱼类体细胞有丝分裂中期分裂相(染色体核型)，通过对染色体进行配对，人工挑选出所有同源染色体，并进行计数，并与参考染色体组进行比较鉴定出鱼类的倍性的一种方法，该方法目前是公认的最准确的鱼类倍性鉴定方法，但由于存在有丝分裂中期分裂相制备成功率低与同源染色体配对人为判断存在误差几率高、一级步骤繁琐和专业性太强等特点，不适合进行大批量检测，尤其在生产实践中进行大批量多倍体筛选实用性不强。红细胞及细胞核体积测量法和核仁组织区银染计数法测定倍性准确性较低，且不易用于批量处理诱导多倍体后代的倍性鉴定。
在开展鱼类染色体加倍实验时，需要对所设定的实验条件进行有效评估，例如压力强度、压力效应时间以及受精后压力介入窗口期等；而且对于苗种创制企业在进行多倍体规模化制种生产中也要对制备的多倍体苗种进行倍性验证，都需要一套稳定、快速和便捷的倍性鉴定方法，尤其在胚胎阶段。因为多倍体苗种生产企业在卖出去苗种的同时要在第一时间知道倍性情况。目前，对鱼类雌核发育和多倍体诱导结果的评估都是等制种后代发育至幼鱼期之后再进行倍性鉴定，继而评估染色体操作实验所设定参数及条件的优劣。这样就存在一些缺陷：(1)由于雌核发育和多倍体诱导技术所获得的后代须等到进入幼鱼阶段才能进行倍性鉴定，尤其像鲑鳟鱼发育周期长，发育到幼鱼阶段需要6个月，这导致必须等很长时间才能评估染色体操作实验的结果；(2)由于评估倍性操作实验结果前，有较长一段养殖过程，在这个过程中因养殖环境变化、养殖技术及病害等原因造成鱼类的死亡也是不可预知，染色体操作实验制备的后代没等检测就全部死亡的案例也比比皆是。
发明内容
为了能够缩短倍性鉴定周期，避免养殖过程中外界因素导致的生产损失，本发明提供了一种对鲑鳟鱼胚胎进行倍性鉴定的方法。
本发明对鲑鳟鱼胚胎进行倍性鉴定的方法如下：
一、将鲑鳟鱼胚胎用固定液固定；
二、将鲑鳟鱼眼点期胚胎从固定液中取出，放入PBS缓冲液中浸泡洗去表面的固定剂，随后取出用刀片将卵切开去除卵皮，再用刀片切取胚胎头部及其它可辨识胚胎组织，置于新培养皿的细胞核染液中，然后切碎、摇匀制成胚胎细胞悬浊液；
三、用细胞核染液将切除头部及其它可辨识胚胎组织后的剩余胚胎细胞冲洗至步骤二胚胎细胞悬浊液中，再用30μm孔径滤网对胚胎细胞悬浊液进行过滤；取滤液用30μm孔径滤网再过滤一次，获得检测样本；
四、将染色的已知鲑鳟鱼二倍体样本用倍性分析仪检测，并调整荧光信号值至100处设定为对照样本；将检测样本染色后用倍性分析仪检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与对照样本峰值图比较，确定检测样本的倍性大小；
其中，步骤一中固定液按以下步骤制成，100ml PBS缓冲液中加入4g多聚甲醛，然后加入2～5滴NaOH并维持温度于60℃±2℃磁力搅拌直至多聚甲醛溶解，之后冷却至室温并调整pH值为7.4。
本发明在胚胎阶段开展倍性检测和鉴定，无须等到后代进入幼鱼阶段便可以进行倍性鉴定，大幅缩短了检测周期，在受精卵时期知道倍性，可适时再做多倍体的制种。对于水产养殖企业和研究机构，在繁殖期可开展大量和多批次的鉴定，由于鱼类受精卵孵化期较长，因此在胚胎阶段即获得鉴定结果，对于繁殖期再进行多次多倍体制备是极其有利和可行的。
本发明对检测样品的前处理、染色和检测时间短，操作简便、快速，鉴定稳定性好、准确率高，染色药品用量小、操作毒性微毒、对身体无伤害，适合产业化生产的大批量检测与鉴定，更加有利于多倍体育种实践和多倍体规模化生产需要。本发明方法对于技术普及和推广更加有力，无需专业上机人员协助，独立培训20分钟即检测操作。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式对鲑鳟鱼胚胎进行倍性鉴定的方法如下：
一、将鲑鳟鱼胚胎用固定液固定；
二、将鲑鳟鱼眼点期胚胎从固定液中取出，放入PBS缓冲液中浸泡洗去表面的固定剂，随后取出用刀片将卵切开去除卵皮，再用刀片切取胚胎头部及其它可辨识胚胎组织，置于新培养皿的细胞核染液中，然后切碎、摇匀制成胚胎细胞悬浊液；
三、用细胞核染液将切除头部及其它可辨识胚胎组织后的剩余胚胎细胞冲洗至步骤二胚胎细胞悬浊液中，再用30μm孔径滤网对胚胎细胞悬浊液进行过滤；取滤液用30μm孔径滤网再过滤一次，获得检测样本；
四、将染色的已知鲑鳟鱼二倍体样本用倍性分析仪检测，并调整荧光信号值至100处设定为对照样本；将检测样本染色后用倍性分析仪检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与对照样本峰值图比较，确定检测样本的倍性大小；
其中，步骤一中固定液按以下步骤制成，100ml PBS缓冲液中加入4g多聚甲醛，然后加入2～5滴NaOH并维持温度于60℃±2℃磁力搅拌直至多聚甲醛溶解，之后冷却至室温并调整pH值为7.4；细胞核染液为CyStain DNA 1Step。
本实施方式固定液无挥发性和易燃性，可长期保存或随身携带，适合在实验基地采样后邮寄回实验室或是检测单位使用，主要针对无倍性分析仪或该仪器不在采样现场的条件下使用。
将20批次的鲑鳟鱼胚胎抚育至成鱼，并分别在幼鱼期、成鱼期再次进行倍性鉴定。本发明鲑鳟鱼胚胎期倍性鉴定结果准确率99.9％。本发明将鲑鳟鱼倍性检测时间提前到了20天以内，大大缩短了鲑鳟鱼多倍制种条件摸索及多倍体育种验证的周期，为加快鲑鳟鱼遗传进展奠定了坚实基础。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：固定液按以下步骤制成：100ml PBS缓冲液中加入4g多聚甲醛，然后加入2～5滴NaOH并维持温度于60℃±2℃磁力搅拌直至多聚甲醛溶解，之后冷却至室温并调整pH值为7.4，获得A液；然后将A液与等体积的无水乙醇混合，冷却至室温后加入体积4％的冰醋酸，即获得固定液。其它步骤及参数与实施方式一相同。
本实施方式固定液具有固定时间长，便于长期保存，适用于多批次样品暂放后统一测定使用。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：步骤二新培养皿中细胞核染液为300ml，其中200μl细胞核染液置于培养皿边缘处，其余100μl细胞核染液置于培养皿中央，胚胎头部或其它可辨识胚胎组织放置于中央100μl细胞核染液中，切碎后倾斜培养皿将细胞核染液合并制成胚胎细胞悬浊液。本实施方式步骤三用400μl细胞核染液冲洗剩余胚胎细胞。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。
本实施方式步骤三用细胞核染液将所有胚胎组织都收集至胚胎细胞悬浊液中。
本实施方式单个样品染色剂处理时间为1min，检测速度为2个/min，单样本试剂消耗量仅为700μl。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一、二或三的不同点是：检测样本暂时存放须避光。其它步骤及参数与实施方式一、二或三相同。

Claims (5)

1.一种对鲑鳟鱼胚胎进行倍性鉴定的方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：
一、将鲑鳟鱼胚胎用固定液固定；
二、将鲑鳟鱼眼点期胚胎从固定液中取出，放入PBS缓冲液中浸泡洗去表面的固定剂，随后取出用刀片将卵切开去除卵皮，再用刀片切取胚胎头部及其它可辨识胚胎组织，置于新培养皿的细胞核染液中，然后切碎、摇匀制成胚胎细胞悬浊液；
三、用细胞核染液将切除头部及其它可辨识胚胎组织后的剩余胚胎细胞冲洗至步骤二胚胎细胞悬浊液中，再用30μm孔径滤网对胚胎细胞悬浊液进行过滤；取滤液用30μm孔径滤网再过滤一次，获得检测样本；
四、将染色的已知鲑鳟鱼二倍体样本用倍性分析仪检测，并调整荧光信号值至100处设定为对照样本；将检测样本染色后用倍性分析仪检测，记录荧光信号值，通过机器自带的分析系统，将检测样本的峰值图均值与对照样本峰值图比较，确定检测样本的倍性大小；
其中，步骤一中固定液按以下步骤制成，100ml PBS缓冲液中加入4g多聚甲醛，然后加入2～5滴NaOH并维持温度于60℃±2℃磁力搅拌直至多聚甲醛溶解，之后冷却至室温并调整pH值为7.4。
2.根据权利要求1所述的一种对鲑鳟鱼胚胎进行倍性鉴定的方法，其特征在于固定液按以下步骤制成：100ml PBS缓冲液中加入4g多聚甲醛，然后加入2～5滴NaOH并维持温度于60℃±2℃磁力搅拌直至多聚甲醛溶解，之后冷却至室温并调整pH值为7.4，获得A液；然后将A液与等体积的无水乙醇混合，冷却至室温后加入体积4％的冰醋酸，即获得固定液。
3.根据权利要求1或2所述的一种对鲑鳟鱼胚胎进行倍性鉴定的方法，其特征在于步骤二新培养皿中细胞核染液为300ml，其中200μl细胞核染液置于培养皿边缘处，其余100μl细胞核染液置于培养皿中央，胚胎头部或其它可辨识胚胎组织放置于中央100μl细胞核染液中，切碎后倾斜培养皿将细胞核染液合并制成胚胎细胞悬浊液。
4.根据权利要求3所述的一种对鲑鳟鱼胚胎进行倍性鉴定的方法，其特征在于检测样本暂时存放须避光。
5.根据权利要求3所述的一种对鲑鳟鱼胚胎进行倍性鉴定的方法，其特征在于细胞核染液为CyStain DNA 1 Step。
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