CN104297222B - 一种斑马鱼胚胎酒精肝检测模型及其构建方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药研究领域,具体涉及一种斑马鱼胚胎酒精肝检测模型及其构建方法和用途。本发明所述方法采用肝脏特异表达荧光蛋白的转基因斑马鱼,用于构建酒精性肝病的模型,通过分析斑马鱼肝脏外形肿大、胚胎卵黄吸收减少,以及荧光读数等信息,构建一种斑马鱼胚胎酒精肝检测模型,该模型具有观察指标简单,易于观察,可定性定量化等特点,特别适合应用于防治酒精肝药物的高通量筛选。
Description
技术领域
本发明属于生物医药研究领域,具体涉及一种斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型及其构建方法和用途。
背景技术
酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)在病理组织学上分为酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和肝硬化,已成为影响人们健康的主要肝脏疾病之一。据估计,90%长期过量饮酒者可发生脂肪肝,30%-37%可进展为酒精性肝纤维化及肝硬化,并有5-15%患者即使戒酒仍可发生酒精性肝纤维化及肝硬化。在我国,酒精性肝病患者存在饮酒年限久、日饮用量大的状况。据报道,在调查的902例酒精性肝病患者中,均匀饮酒年限为22.4年,均匀日摄入乙醇量128.9克,日饮量最大为640克。这种长期大量的饮酒方式,对我国酒精性肝病患者的肝脏造成了严重的损伤;上述患者中,酒精性肝炎患者占ALD的28.8%,酒精性肝硬化患者占ALD的37.4%,预示我国面临着严重的酒精性肝病的威胁。近年来,随着人们生活水平的不断提高和饮食结构的改变,酗酒人群大幅度的增加,发病率呈明显上升趋势。因此,酒精性肝病在我国将成为一个严重的医学和社会问题,开展中医药对ALD防治的研究具有重要意义。
由于酒精性肝病病因复杂,临床上虽曾应用过多种类型的药物进行治疗,但至今仍缺乏疗效确切的药物。因此,临床前有效药物的筛选显得至关重要。
斑马鱼是一种小型的热带淡水鱼,早先主要用于发育生物学研究,近年来被广泛应用于生物学、医学和药物研发。作为一种新的药物研发用的模式动物,斑马鱼在临床前药物筛选中具有以下诸多的优点:首先,斑马。鱼具有与人类高度相似的基因组,具有与哺乳动物相似的心血管、造血、神经及代谢等系统,大量高度一致的活性代谢产物,并呈现出与人类十分相似的生理学特征,一些已知的药物在斑马鱼上也出现了相似的治疗效果,包括sodium nitroprussude,atrovastatin,Indomethacin,5-aminosalicyclic acid,Prednisolone及etidronate等;其次,通过化学处理、遗传学等不同方法,研究人员制造出了一系列的斑马鱼的人类疾病模型,可用于新药的筛选;最后,斑马鱼具有许多独特的优势,例如,易于操作,体积小,可用于孔板的操作,药物化合物溶解加入即可,繁殖能力强,每对鱼一周可产数百枚鱼卵,可提供大量的受试样本,生长发育迅速,3至4天主要器官就已形成,成鱼2至3个月即可产卵,可缩短药物筛选的周期,提高筛选效率,养殖成本低,其养殖成本约为小鼠的百分之一至千分之一,易于观察,其胚胎和幼鱼透明,可在显微镜下实现活体观察各种器官、肿瘤细胞的迁移、心跳的节律变化及血液流动等。
本发明采用肝脏特异表达荧光蛋白的转基因斑马鱼,用于构建酒精性肝病的模型,通过分析斑马鱼肝脏外形肿大、胚胎卵黄吸收减少,以及荧光读数等信息,构建一种斑马鱼酒精肝检测模型,该模型具有观察指标简单,易于观察,可定性定量化等特点,适合应用于斑马鱼防治酒精肝药物的高通量筛选。
发明内容
为此,本发明所要解决的技术问题在于提供一种简单的、可靠、高效的斑马鱼酒精肝高通量检测模型及其建立方法和用途。
为解决上述技术问题,本发明的公开了一种斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,包括如下步骤:
(1)选取肝脏特异表达绿色荧光的转基因成年斑马鱼雌雄配对,按照常规方法进行自然交配,收集肝脏特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼鱼卵,备用;
(2)将收集的鱼卵用反渗透水冲洗,随后转移至鱼水中养殖,并向所述鱼水中加入基于所述鱼水的添加量为0.2-0.4ppm的亚甲基蓝,25-30℃培养,并向所述鱼水中加入0.1-0.3mM 1-苯基-2-硫脲,继续培养至72hpf,随机收集已孵化的斑马鱼胚胎,分为对照组和模型组,备用;
(3)在96hpf时,向所述鱼水中加入三卡因甲磺酸直至所述鱼水中三卡因甲磺酸的浓度为0.002-0.004%,麻醉所述胚胎斑马鱼;;
(4)将模型组的斑马鱼胚胎转移入质量浓度为1-3%的乙醇溶液中,在密封条件下于25-30℃继续孵育24-40h;另取对照组的斑马鱼胚胎转移入水中,在密封条件下于25-30℃继续孵育24-40h,得到斑马鱼酒精肝检测模型;
(5)取模型组和对照组的斑马鱼胚胎在荧光显微镜下测定肝脏、卵黄大小以及荧光表达信号强度,对比模型组和对照组的斑马鱼胚胎的肝脏面积、卵黄面积以及荧光表达信号强度,若所述模型组的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度均大于对照组的,则所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型构建成功;反之,则不成功。
所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,在所述步骤(4)中,在制备所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型过程中所使用的乙醇的质量浓度为2%。
所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,在所述步骤(4)中,所述胚胎斑马鱼在28℃培养箱中孵育32h。
所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,在所述步骤(3)中,向鱼水中加入三卡因甲磺酸直至所述鱼水中三卡因甲磺酸浓度为0.003%。
所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,在所述步骤(2)中,所采用的亚甲基蓝基于所述鱼水的添加量为0.3ppm。
所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,在所述步骤(2)中,向所述鱼水中加入0.2mM 1-苯基-2-硫脲。
所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,在所述步骤(1)中,在所述成年肝脏特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼以雌雄比为1:1配对进行交配,并以产卵开始计时,在30分钟内收集所述肝脏特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼鱼卵。
本发明提供了一种由上述的建立方法制备得到所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型。
本发明提供了一种所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型用于评价或筛选用于治疗酒精肝的药物的用途。
本发明提供了一种利用所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型筛选防治酒精肝的药物的方法,具体包括如下步骤:
1)取所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型,并向其中加入浓度1-25μM的待测化合物,于25-30℃恒温条件下培养36-60h,得到给药斑马鱼模型;
2)将所述给药斑马鱼进行分析,计算所述给药斑马鱼的肝脏和卵黄的面积,并测定其荧光表达信号强度,若所述给药斑马鱼的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度的数值相比所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的降低10-30%,则所述待测化合物具有防治酒精肝的作用。
优选的,所述利用所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型筛选防治酒精肝的药物的方法,具体包括如下步骤:
1)取所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型,并向其中加入浓度10μM的待测化合物,于28℃恒温条件下培养48h,得到给药斑马鱼;
2)将所述给药斑马鱼进行分析,计算所述给药斑马鱼的肝脏和卵黄的面积,并测定其荧光表达信号强度,若所述给药斑马鱼的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度的数值相比所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的降低20%,则所述待测化合物具有防治酒精肝的作用。
本发明采用肝脏特异表达荧光蛋白的转基因斑马鱼,用于构建酒精性肝病的模型,通过分析斑马鱼肝脏外形肿大、胚胎卵黄吸收减少,以及荧光读数等信息,构建一种斑马鱼胚胎酒精肝检测模型,该模型具有观察指标简单,易于观察,可定性定量化等特点,适合应用于斑马鱼防治酒精肝药物的高通量筛选,且肝脏特异表达荧光蛋白的转基因斑马鱼在酒精处理后出现胎肝脏外形肿大,卵黄吸收减少,荧光读数增加,这些指标和酒精性肝病的病理切片、油红O染色以及生化分子生物学指标相一致。
效果例
本实施例仅以实施例3制备的所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型为研究对象,考察本发明所述的斑马鱼胚胎酒精肝模型的评价指标,即肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度的增加与现有技术中的斑马鱼胚胎酒精肝模型常规评价指标即油红染色、病理切片以及斑马鱼胚胎酒精肝模型的脂肪、胆固醇、内质网应激相关基因表达异常等结果的相关性,进一步验证肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度的增加可作为评价斑马鱼胚胎酒精肝模型是否成立的可靠指标。
以实施例3制备的所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型进行常规的油红染色、病理切片,具体步骤如下:
斑马鱼胚胎酒精肝的油红O染色
分别向对照组的所述未进行酒精处理的正常斑马鱼胚胎及模型组的所述斑马鱼胚胎中加入三卡因甲磺酸直至溶液中所述三卡因甲磺酸浓度为0.003%,麻醉所述斑马鱼胚胎后,分别用质量浓度为4%的多聚甲醛(PFA)固定,室温条件下固定2-4h,然后分别用pH为7.4的PBS缓冲液冲洗三次,每次2分钟,然后分别将所述斑马鱼胚胎储存在pH为7.4的PBS缓冲液中,4℃冰箱中保存;染色时,取出所述斑马鱼胚胎用pH为7.4的PBS缓冲液冲洗两次,然后用巴斯德吸管将所述斑马鱼胚胎转移至Corning Netwells(如果斑马鱼胚胎粘住吸管,用含0.05%吐温-20的pH7.2-7.4的磷酸盐缓冲液(PBST)反复轻微洗涤几次,需要最小化PBST的接触时间),然后再用pH为7.4的PBS快速洗五次,每次5分钟。用质量浓度为85%的丙二醇处理所述斑马鱼胚胎10min,然后再用质量浓度为100%的丙二醇处理10min,彻底滤干水分后,将所述斑马鱼胚胎放入含油红O(Oil Red O)的质量浓度为100%的丙二醇中,于室温条件下轻微晃动过夜,然后用质量浓度为100%的丙二醇洗所述斑马鱼胚胎30min,然后再用质量浓度为85%的丙二醇洗50min,最后用质量浓度为85%的丙二醇洗40min。向所述斑马鱼胚胎中加入等量的pH为7.4的PBS缓冲液,轻微摇晃5min,直至均匀,然后转移到pH为7.4的PBS中,洗15min后,再次用pH为7.4的PBS洗5min,将所述斑马鱼胚胎转移回玻璃管中(如果胚胎粘住吸管,用0.05%的PBST反复轻微洗涤几次,需要最小化PBST的接触时间),用pH为7.4的PBS快速洗5min,然后加入适量80%甘油,室温储存。分别从对照组的所述未进行酒精处理的正常斑马鱼胚胎及模型组的所述斑马鱼胚胎中随机挑选10-20条,及时用显微镜观察所述斑马鱼胚胎的肝脏脂肪染色情况(肝脏脂肪滴数≥3评判为脂肪肝),并做好记录。
斑马鱼胚胎肝脏大小及卵黄吸收的显微镜拍照及测定
将肝脏特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼胚胎直接放置于显微镜下观察肝脏及卵黄大小,并拍照记录和保存图片。然后用图像处理软件进行图像分析,计算肝脏大小及卵黄吸收情况。
斑马鱼胚胎的肝脏病理切片:
分别取对照组的所述未进行酒精处理的正常斑马鱼胚胎及模型组的所述斑马鱼胚胎置于Bouin氏溶液中固定24-48h,然后将所述斑马鱼胚胎置于流水中冲洗约2h,随后经过不同浓度的乙醇脱水(50%乙醇脱水2h以上,70%乙醇脱水2h以上,80%乙醇脱水2h,90%乙醇脱水1.5h,95%乙醇脱水1.5h,无水乙醇脱水40min),将脱水后的斑马鱼胚胎使用体积比为1:1的乙醇:二甲苯处理1h,再用二甲苯处理10min,之后用体积比为1:1的二甲苯:石蜡浸泡1h,再用石蜡浸泡40min至1h,将所述斑马鱼胚胎从石蜡中取出,置于包埋盒中,倒入石蜡,进行包埋,然后在切片机上切片,切片厚度设置为4-8um。将切好的薄片轻轻放入38℃水浴中,完全开展后,将它转移至涂有甘油蛋白的载玻片上,放入60℃的恒温箱中烘干约12h,取出所述载玻片先后经二甲苯脱蜡10min,无水乙醇脱蜡1min,95%乙醇处理脱蜡1min,90%乙醇脱蜡1min,80%乙醇脱蜡1min,70%乙醇脱蜡1min后,进行苏木精-伊红染色,具体染色步骤为:苏木精染液染色10min,随后分别用蒸馏水和盐酸乙醇分化清洗片刻,流水继续冲洗10min以上,70%乙醇冲洗1min,80%乙醇冲洗1min,95%乙醇冲洗1min,再在伊红染液中染色1min,进入脱水阶段,用95%乙醇脱水1min,100%的无水乙醇脱水1min,二甲苯脱水5min,最后将中性树胶滴于所述载玻片上,随即将盖玻片轻轻放置于载玻片上,防止产生气泡。10尾斑马鱼胚胎的切片,每尾随机挑选10个切片,然后在每个切片组织上随机选取10个100umX100um的区域进行肝脏细胞外形的显微观察,并记录相应的结果。
斑马鱼胚胎酒精肝模型的肝脏面积、卵黄面积以及荧光表达信号强度的增加与油红染色及病理切片的相关性结果
研究发现,与未进行酒精处理的斑马鱼胚胎相比(对照组),实施例3制备的斑马鱼胚胎酒精肝模型(模型组)的肝脏肿大倍数,卵黄吸收变慢倍数以及荧光读数增加倍数分别为1.52±0.22,3.82±0.46和1.48±0.27(见下表1)。而油红染色及病理切片结果显示,油红O染色阳性率(%)和病理切片不正常细胞百分比(%)分别从8.1±3.2增加到70.2±8.1和从3.2±0.8增加到60.9±5.2(见下表1)。上述结果表明,斑马鱼胚胎酒精肝模型的肝肿大、卵黄吸收变慢、荧光读数增加与油红染色及病理切片结果相一致,从而验证了斑马鱼胚胎酒精肝模型的肝肿大、卵黄吸收变慢、荧光读数增加等简易指标可用于斑马鱼胚胎酒精肝模型的检测。
表1.斑马鱼胚胎酒精肝模型的肝肿大、卵黄吸收变慢、荧光读数增加与油红染色及病理切片结果
对照组 | 模型组 | |
肝脏肿大倍数 | 1±0.0 | 1.52±0.22 |
卵黄吸收变慢倍数 | 1±0.0 | 3.82±0.46 |
荧光读数增加倍数 | 1±0.0 | 1.48±0.27 |
油红O染色阳性率(%) | 8.1±3.2 | 70.2±8.1 |
病理切片不正常细胞百分比(%) | 3.2±0.8 | 60.9±5.2 |
以实施例3制备的所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型进行生物化学与分子生物学指标的检测,具体步骤如下:
解剖对照组和模型组的斑马鱼肝脏,利用Trizol试剂提取对照组及模型组的肝脏的总RNA,提取的总RNA经含有甲醛的琼脂糖凝胶电泳检验为质量合格的总RNA,分别取1ug的对照组和模型组的肝脏的总RNA用于第一链cDNA合成,然后分别取1ul稀释10倍的上述步骤合成的cDNA用于半定量RT-PCR反应,引物及PCR循环数如下表2,所述引物见序列表,将12.5ul的整个反应体系全部用于琼脂糖电泳,拍照,用NIH Image J图像分析软件进行图像分析,计算电泳条带的信号强度。然后计算各个基因的相对表达率。
表2半定量RT-PCR引物及PCR反应循环数
斑马鱼胚胎酒精肝模型的肝脏面积、卵黄面积以及荧光表达信号强度的增加与斑马鱼胚胎酒精肝模型的脂肪、胆固醇、内质网应激相关基因表达异常的相关性结果
研究发现,酒精处理的模型组的斑马鱼胚胎,出现了肝脏肿大,卵黄吸收变慢等与肝脏功能变差密切相关的现象,以及荧光信号显著强于对照组。为了从作用机理方面进一步验证这些现象可作为斑马鱼胚胎酒精肝模型的可靠指标,我们检测了与酒精性肝病密切相关的脂肪代谢、胆固醇代谢、内质网应激相关基因的表达情况。从上述实验表明,模型组的斑马鱼胚胎的脂肪代谢相关基因ACC1,Fasn,Fads的表达量分别上调了3.9倍,7.5倍和1.3倍,与胆固醇代谢相关的基因HMGCS1、HMGCRb分别上调了2.7和3.3倍(见图4),而HMGCRa则没有出现上调现象,表明这种胆固醇代谢相关基因的上调的特异性。内质网应激是酒精性肝病的重要病理机制之一,我们也检测到了内质网应激分子标记物bip、chop和gp78分别上调了4.1、2.5和2.0倍(见图4),从而在机理方面验证了本发明实施例3的酒精性肝病模型的建立。CYP2e1基因上调了9倍,表明酒精在肝脏的代谢情况。以上,表明了本发明的斑马鱼胚胎酒精肝模型的肝肿大、卵黄吸收变慢、荧光读数增加与脂肪、胆固醇、内质网应激相关基因异常表达结果相一致,从而验证了斑马鱼胚胎酒精肝模型的肝肿大、卵黄吸收变慢、荧光读数增加等简易指标可用于斑马鱼胚胎酒精肝模型的检测。
综上可见,采用本发明所述的斑马鱼胚胎酒精肝模型的肝肿大、卵黄吸收变慢、荧光读数增加等简易指标与现有技术中斑马鱼胚胎酒精肝模型常规的油红染色、病理切片以及斑马鱼的脂肪、胆固醇、内质网应激相关基因异常表达的结果相一致,可见,本发明所述方法可用于构建斑马鱼胚胎酒精性肝病的模型,其中的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度的增加可作为评价斑马鱼胚胎酒精肝模型是否成立的可靠指标,且该肝肿大、卵黄吸收变慢、荧光读数增加等指标简单,易于观察和操作,具有可定性定量化的优势。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解,下面根据本发明的具体实施例并结合附图,对本发明作进一步详细的说明,其中
图1是实施例3的所述斑马鱼胚胎模型组以及对照组的形态学照片;
图2是实施例3的所述斑马鱼胚胎模型组以及对照组的肝脏及卵黄的相对面积;
图3是实施例3的所述斑马鱼胚胎模型组以及对照组的荧光读数;
图4是实施例3的所述斑马鱼胚胎模型组脂肪、胆固醇、内质网应激相关基因异常表达结果。
具体实施方式
本发明下述实施例中所述鱼水的组成为:5mM NaCl,0.17mM KCl,0.33mM CaCl2,0.33mM MgSO4,2mM HEPES。
实施例1
本实施例所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,具体包括如下步骤:
(1)胚胎收集的前一天晚上设置10对成年肝脏特异表达绿色荧光的转基因成年斑马鱼以雌雄比为1:1配对于交配盒中,并用隔板隔离,放置于无光照的鱼房中,第二天早上当斑马鱼鱼房灯亮时,取出隔板,让配对的斑马鱼在光驱动的条件下自然交配,从产卵开始计时,30分钟内收集鱼卵以降低由于雌鱼体内鱼卵本身差异所引起的后期胚胎发育差异,产卵收集完成后,配对的斑马鱼及时放回养殖系统,在2周修复期后,可再次用于产卵;
(2)将收集的斑马鱼鱼卵用反渗透水反复冲洗4-5次,移至斑马鱼鱼水中,并向所述鱼水中加入基于所述鱼水的添加量为0.2ppm的亚甲基蓝,25℃培养至19h,去除死掉的鱼卵,然后向所述鱼水中加入0.1mM 1-苯基-2-硫脲,继续培养至72hpf(受精后72小时)后,观察胚胎孵化情况,待大多数胚胎孵化后,收集已孵化的斑马鱼胚胎,并随机将已孵化的斑马鱼胚胎分为对照组和模型组,每组10-20尾,设置四个重复,并做好各组的标记工作,备用;
(3)在96hpf(受精后96小时)时,向所述鱼水中加入三卡因甲磺酸直至所述鱼水中三卡因甲磺酸的浓度为0.004%,麻醉所述斑马鱼胚胎;
(4)然后将所述模型组的斑马鱼胚胎转移入质量浓度为1%的乙醇中,并用Parafilm封口膜封住出口,以防止乙醇的挥发,于25℃培养箱中继续孵育40h;另取对照组的所述斑马鱼胚胎转移入水中,并用Parafilm封口膜封住出口,于25℃培养箱中继续孵育40h,得到斑马鱼酒精肝检测模型;
(5)取步骤(4)中获得的斑马鱼胚胎进行分析,利用型号为Olympus LX51的荧光显微镜拍照以及荧光表达信号强度的读数,利用Image J的图像处理软件计算所述模型的肝脏和卵黄的面积;若所述模型的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度均大于未进行酒精处理的斑马鱼胚胎的,则所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型成立;反之,则不成立。
统计学结果显示:所述模型的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度分别相对于未进行酒精处理的正常斑马鱼胚胎的增加1.3-1.8、3.3-4.3、1.2-1.8的倍数,所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型成立。
本实施例还提供了一种利用上述方法制备的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型筛选防治酒精肝的药物的方法,具体包括如下步骤:
1)取所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型,并向其中加入浓度__1μM的待测化合物,于30℃恒温条件下培养36h,得到给药斑马鱼模型;
2)将所述给药斑马鱼进行分析,计算所述给药斑马鱼的肝脏和卵黄的面积,并对其荧光表达信号强度进行读数,若所述给药斑马鱼的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度的数值相比所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的降低10%,则所述待测化合物具有防治酒精肝的作用。
实施例2
本实施例所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,具体包括如下步骤:
(1)胚胎收集的前一天晚上设置10对肝脏特异表达绿色荧光的转基因成年斑马鱼以雌雄比为1:1配对于交配盒中,并用隔板隔离,放置于无光照的鱼房中,第二天早上当斑马鱼鱼房灯亮时,取出隔板,让配对的斑马鱼在光驱动的条件下自然交配,从产卵开始计时,30分钟内收集鱼卵以降低由于雌鱼体内鱼卵本身差异所引起的后期胚胎发育差异,产卵收集完成后,配对的斑马鱼及时放回养殖系统,在2周修复期后,可再次用于产卵;
(2)将收集的斑马鱼鱼卵用反渗透水反复冲洗4-5次,移至斑马鱼鱼水中,并向所述鱼水中加入基于所述鱼水的添加量为0.4ppm的亚甲基蓝,30℃培养至19h,去除死掉的鱼卵,然后向所述鱼水中加入0.3mM的1-苯基-2-硫脲,继续培养至72hpf(受精后72小时)后,观察胚胎孵化情况,待大多数胚胎孵化后,收集已孵化的斑马鱼胚胎,并随机将已孵化的斑马鱼胚胎分组,分为对照组和模型组,每组10-20尾,设置四个重复,并做好各组的标记工作,备用;
(3)在96hpf(受精后96小时)时,向所述鱼水中加入三卡因甲磺酸直至所述鱼水中三卡因甲磺酸的浓度为0.002%,麻醉所述斑马鱼胚胎;
(4)然后将所述模型组的斑马鱼胚胎转移入质量浓度为3%的乙醇中,并用Parafilm封口膜封住出口,以防止乙醇的挥发,于30℃培养箱中继续孵育24h;另取对照组的所述斑马鱼胚胎转移入水中,并用Parafilm封口膜封住出口,于28℃培养箱中继续孵育24h,得到斑马鱼酒精肝检测模型;
(5)取步骤(4)中获得的斑马鱼胚胎进行分析,利用型号为Olympus LX51的荧光显微镜拍照以及荧光表达信号强度的读数,利用Image J的图像处理软件计算所述模型的肝脏和卵黄的面积;若所述模型的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度均大于未进行酒精处理的斑马鱼胚胎的,则所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型成立;反之,则不成立。
统计学结果显示:所述模型的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度分别相对于未进行酒精处理的正常斑马鱼胚胎的增加1.3-1.8、3.3-4.3、1.2-1.8的倍数,所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型成立。
本实施例还提供了一种利用上述方法制备的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型筛选防治酒精肝药物的方法,具体包括如下步骤:
1)取所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型,并向其中加入浓度25μM的待测化合物,于25℃恒温条件下培养36h,得到给药斑马鱼模型;
2)将所述给药斑马鱼进行分析,计算所述给药斑马鱼的肝脏和卵黄的面积,并对其荧光表达信号强度进行读数,若所述给药斑马鱼的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度的数值相比所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的降低30%,则所述待测化合物具有防治酒精肝的作用。
实施例3
本实施例所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,具体包括如下步骤:
(1)胚胎收集的前一天晚上设置10对成年肝脏特异表达绿色荧光的转基因成年斑马鱼以雌雄比为1:1配对于交配盒中,并用隔板隔离,放置于无光照的鱼房中,第二天早上当斑马鱼鱼房灯亮时,取出隔板,让配对的斑马鱼在光驱动的条件下自然交配,从产卵开始计时,30分钟内收集鱼卵以降低由于雌鱼体内鱼卵本身差异所引起的后期胚胎发育差异,产卵收集完成后,配对的斑马鱼及时放回养殖系统,在2周修复期后,可再次用于产卵;
(2)将收集的斑马鱼鱼卵用反渗透水反复冲洗4-5次,移至斑马鱼鱼水中,并向所述鱼水中加入基于所述鱼水的添加量为0.3ppm的亚甲基蓝,28℃培养至19h,去除死掉的鱼卵,然后向所述鱼水中加入0.2mM的1-苯基-2-硫脲,继续培养至72hpf(受精后72小时)后,观察胚胎孵化情况,待大多数胚胎孵化后,收集已孵化的斑马鱼胚胎,并随机将已孵化的斑马鱼胚胎分组,分为对照组和模型组,每组10-20尾,设置四个重复,并做好各组的标记工作,备用;
(3)在96hpf(受精后96小时)时,向所述鱼水中加入三卡因甲磺酸直至所述鱼水中三卡因甲磺酸的浓度为0.003%,麻醉所述斑马鱼胚胎;
(4)然后将所述模型组的斑马鱼胚胎转移入质量浓度为2%的乙醇中,并用Parafilm封口膜封住出口,以防止乙醇的挥发,于28℃培养箱中继续孵育32h;另取对照组的所述斑马鱼胚胎转移入水中,并用Parafilm封口膜封住出口,于28℃培养箱中继续孵育32h,得到斑马鱼酒精肝检测模型;
(5)取步骤(4)中获得的斑马鱼胚胎进行分析,利用型号为Olympus LX51的荧光显微镜拍照以及荧光表达信号强度的读数,利用Image J的图像处理软件计算所述模型的肝脏和卵黄的面积;若所述模型的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度均大于未进行酒精处理的斑马鱼胚胎的,则所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型成立;反之,则不成立。
统计学结果显示:如图1所示为所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型和所述未进行酒精处理的正常斑马鱼胚胎的荧光显微图片,图2为所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型和所述未进行酒精处理的正常斑马鱼胚胎的肝脏和卵黄的相对面积大小,图3为所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型和所述未进行酒精处理的正常斑马鱼胚胎的荧光表达信号强度的读数,由图1-图3可知,所述模型的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度分别相对于未进行酒精处理的斑马鱼胚胎的增加1.3-1.8、3.3-4.3、1.2-1.8的倍数,所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型成立。
本实施例还提供了一种利用上述方法制备的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型筛选防治酒精肝药物的方法,具体包括如下步骤:
1)取所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型,并向其中加入浓度10μM的待测化合物,于28℃恒温条件下培养48h,得到给药斑马鱼;
2)将所述给药斑马鱼进行分析,计算所述给药斑马鱼的肝脏和卵黄的面积,并对其荧光表达信号强度进行读数,若所述给药斑马鱼的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度的数值相比所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的降低20%,则所述待测化合物具有防治酒精肝的作用。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (11)
1.一种斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)选取肝脏特异表达绿色荧光的转基因成年斑马鱼进行雌雄配对,按照常规方法进行自然交配,收集肝脏特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼鱼卵,备用;
(2)将收集的鱼卵用反渗透水冲洗,随后转移至鱼水中养殖,并向所述鱼水中加入基于所述鱼水的添加量为0.2-0.4ppm的亚甲基蓝,25-30℃培养,并向所述鱼水中加入0.1-0.3mM 1-苯基-2-硫脲,继续培养至72hpf,随机收集已孵化的斑马鱼胚胎,分为对照组和模型组,备用;
(3)在96hpf时,向所述鱼水中加入三卡因甲磺酸直至所述鱼水中三卡因甲磺酸的浓度为0.002%-0.004%,麻醉所述胚胎斑马鱼;
(4)将模型组的斑马鱼胚胎转移入质量浓度为1%-3%的乙醇溶液中,在密封条件下于25-30℃继续孵育24-40h;另取对照组的斑马鱼胚胎转移入水中,在密封条件下于25-30℃继续孵育24-40h,得到斑马鱼酒精肝检测模型;
(5)取模型组和对照组的斑马鱼胚胎在荧光显微镜下测定肝脏及卵黄大小,对比模型组和对照组的斑马鱼胚胎的肝脏面积、卵黄面积以及荧光表达信号强度,若所述模型组的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度均大于对照组的,则所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型构建成功;反之,则不成功。
2.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,其特征在于,在所述步骤(4)中,在制备所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型过程中所使用的乙醇的质量浓度为2%。
3.根据权利要求1或2所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,其特征在于,在所述步骤(4)中,所述模型组和对照组的斑马鱼胚胎在28℃培养箱中孵育32h。
4.根据权利要求3所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,其特征在于,在所述步骤(3)中,向鱼水中加入三卡因甲磺酸直至所述鱼水中三卡因甲磺酸浓度为0.003%。
5.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,其特征在于,在所述步骤(2)中,所采用的亚甲基蓝基于所述鱼水的添加量为0.3ppm。
6.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,其特征在于,在所述步骤(2)中,向所述鱼水中加入1-苯基-2-硫脲0.2mM。
7.根据权利要求1所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的构建方法,其特征在于,在所述步骤(1)中,所述肝脏特异表达绿色荧光的转基因成年斑马鱼以雌雄比为1:1配对进行交配,并以产卵开始计时,在30分钟内收集所述肝脏特异表达绿色荧光的转基因斑马鱼鱼卵。
8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法制备得到的所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型。
9.一种权利要求8所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型用于评价或筛选防治酒精肝药物的用途。
10.一种利用权利要求8所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型筛选防治酒精肝药物的方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
1)取所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型,并向其中加入浓度1-25μM的待测化合物,于25-30℃恒温条件下培养36-60h,得到给药斑马鱼;
2)将所述给药斑马鱼进行分析,计算所述给药斑马鱼的肝脏和卵黄的面积,并对其荧光表达信号强度进行读数,若所述给药斑马鱼的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度的数值相比所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的降低10%-30%,则所述待测化合物具有防治酒精肝的作用。
11.根据权利要求10所述的筛选防治酒精肝药物的方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
1)取所述斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型,并向其中加入浓度10μM的待测化合物,于28℃恒温条件下培养48h,得到给药斑马鱼;
2)将所述给药斑马鱼进行分析,计算所述给药斑马鱼的肝脏和卵黄的面积,并对其荧光表达信号强度进行读数,若所述给药斑马鱼的肝脏的面积、卵黄的面积以及荧光表达信号强度的数值相比所述的斑马鱼胚胎酒精肝高通量检测模型的降低20%,则所述待测化合物具有防治酒精肝的作用。
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