CN104278077B - 一种高通量快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高通量快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂的方法。本发明包括待筛选免疫增强剂的处理、罗氏沼虾血淋巴细胞的采集与培养以及罗氏沼虾非特异性免疫指标的检测与分析三大步骤。本发明能够在体外快速、高通量的进行罗氏沼虾免疫增强剂的筛选。

Description

一种高通量快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂的方法

技术领域

本发明涉及一种罗氏沼虾免疫增强剂的体外筛选方法，特别涉及一种高通量快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂的方法。

背景技术

罗氏沼虾（Macrobrachiumrosenbergii）又名马来西亚大虾、淡水长臂大虾，在分类上属于节肢动物门(Arthropada)，甲壳纲(Crustacea)，十足目(Decapoda)，长臂虾科(Palaemonidae)，沼虾属(Macrobrachium)，是一种大型淡水经济虾类。原产于印度洋、太平洋区域的热带和亚热带地区。1976年罗氏沼虾从日本引入中国，经过三十多年的养殖，特别是在20世纪90年代以来，随着人工育苗技术的改进和养殖技术的发展，养殖面积与产量迅速提升，到2009年，我国罗氏沼虾年育苗量达250亿尾以上，养殖面积约3万公顷，养殖产量超过13.5万吨，已成为世界上罗氏沼虾养殖产量最多的国家，是我国淡水甲壳类养殖中仅次于河蟹、淡水青虾的主要养殖品种。但罗氏沼虾作为国外引进品种，经三十多年的人工养殖后，种质衰退现象严重，主要表现为生长缓慢、性成熟时间提早、抗逆性能下降。其中，抗病力下降是一个突出的表现，再加上养殖环境恶化等多种因素，导致罗氏沼虾的育苗和养殖过程中疾病频发，严重影响罗氏沼虾养殖效益与产业发展。

免疫增强剂是指单独使用或者与抗原联用均能增强机体免疫应答的一类物质，主要增强水产动物的非特异性免疫功能，现已证明，具有免疫增强作用的物质不下几十种，常用的有植物、真菌、细菌等来源的提取物。而目前在虾蟹病害防治过程中，主要是大量使用抗菌素及一些化学药物，虽对有关疾病有一定疗效，一定程度上缓解了部分疾病的发生，但是抗生素频繁和大量使用，存在着耐药性、毒副作用大、虾蟹自身免疫力下降以及药物残留对人类健康造成诸多问题。由此，疫苗和免疫增强剂成为水产动物病害防治的首选，这其中疫苗对多种疾病尤其病毒性疾病有显著的预防作用，但特异性能力强，生产上操作可行性差，因而，对提高甲壳类动物非特异性免疫能力有着独特功效的免疫增强剂，已成为水产养殖中的研究热点，同时也符合水产行业健康生态养殖这一新动向。但是，通过养殖筛选免疫增强剂周期长、成本高、风险大，并且虾蟹应急反应强，造成各项指标的不稳定性，这些均影响免疫增强剂的筛选。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高通量快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂的方法，能在体外快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂，且能高通量、大范围的筛选罗氏沼虾免疫增强剂。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种高通量快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂的方法，包括如下步骤：

一、待筛选免疫增强剂的处理

将待筛选免疫增强剂与灭菌的PBS缓冲液混合，配制成浓度为0.5-1.0mg/mL的待筛选免疫增强剂溶液，然后用滤膜过滤除菌，4℃保存待用；

二、罗氏沼虾血淋巴细胞的采集与培养

（1）选取健康的罗氏沼虾成虾，对罗氏沼虾成虾体表消毒；

（2）在紫外消毒过的超净工作台或生物安全柜中，利用一次性注射器通过虾围心腔采集血淋巴，将采集的血淋巴快速注入已高压灭菌的抗凝剂中混合均匀，得到血淋巴与抗凝剂的混合液；

（3）向血淋巴与抗凝剂的混合液中加入青链霉素，混匀后转入24孔或48孔细胞培养板中，每孔1-2ml，静置30-60min后用倒置显微镜观察细胞贴壁情况；

（4）待细胞贴壁，去除上清液后，先向细胞培养板各孔中加入1-2ml的L-15或1640细胞培养液，然后加入不同种类的待筛选免疫增强剂溶液（不加入待筛选免疫增强剂溶液的作为对照组），每种待筛选免疫增强剂溶液分别加入50μL/孔、100μL/孔、150μL/孔三种体积作平行（这样能形成待筛选免疫增强剂终浓度为1:2:3的浓度梯度），轻轻震荡细胞培养板，混合均匀；

（5）将细胞培养板密封后，置于恒温生化培养箱，28±1℃培养；

三、罗氏沼虾非特异性免疫指标的检测与分析

（6）在培养的不同时段采集细胞（培养的不同时段具体为培养3、6、12、24、48小时）：先去除细胞培养液，再用PBS缓冲液进行漂洗，然后收集细胞于300-500μLPBS缓冲液中，获得细胞悬液；

（7）细胞悬液在冰浴条件下利用超声波细胞破碎仪破碎细胞；

（8）采用BCA法蛋白定量试剂盒测定各组样品的总蛋白量（用于PO、POD、SOD、AKP、ACP和LZM值的计算）；

（9）然后分别测定各组样品的PO、POD、SOD、AKP、ACP和LZM值，计算后结合对照组进行比较分析，筛选样品PO、POD、SOD、AKP、ACP和LZM值中一种或几种值显著高于对照组的样品，得到罗氏沼虾免疫增强剂（这样能筛选出能显著提高酶活力的免疫增强剂）。

选择这些非特异性指标：酚氧化酶（PO）、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LZM)作为筛选标准，筛选的针对性强，精确性好。

作为优选，滤膜的孔径为0.45μm。

作为优选，步骤（2）中所述抗凝剂由柠檬酸钠、柠檬酸、葡萄糖与水混合制成，柠檬酸钠浓度为50mmol/L，柠檬酸浓度为25mmol/L，葡萄糖浓度为81.6mmol/L。抗凝效果好。

作为优选，步骤（2）中血淋巴与抗凝剂的体积比为1：2。

作为优选，步骤（3）中青链霉素的用量为100-200万单位/毫升。

作为优选，步骤（7）中超声波细胞破碎仪的工作参数为：功率200-250W，超声15-20s，间隔5s，共超声5-10min。超声破碎效果好。

本发明的有益效果是：

1、本发明采用体外筛选方法，不需要大量的养殖池，降低了养殖条件，大大节约了养殖成本。

2、本发明的筛选方法，可以一次性对数十上百种免疫增强剂进行筛选，可操作性强。

3、本发明的筛选方法减少了因应激因素导致的罗氏沼虾非特异性指标发生的变化，影响免疫增强剂效果的判定。

4、本发明的筛选方法能够对多个非特异性免疫指标进行测定分析，有利于对免疫效果进行综合判定。

5、本发明的筛选方法整个操作步骤简单，一般技术员都可以按步骤指导进行操作。

附图说明

图1为体外培养的罗氏沼虾血淋巴细胞图。

图2为待筛选免疫增强剂对罗氏沼虾血淋巴细胞免疫指标溶菌酶（LZM）的影响图，其中对照组不添加任何免疫增强剂。

图3为待筛选免疫增强剂对罗氏沼虾血淋巴细胞免疫指标酸性磷酸酶（ACP）的影响图，其中对照组不添加任何免疫增强剂。

图4为待筛选免疫增强剂对罗氏沼虾血淋巴细胞免疫指标超氧化物酶（SOD）的影响图，其中对照组不添加任何免疫增强剂。

图5为待筛选免疫增强剂对罗氏沼虾血淋巴细胞免疫指标酚氧化物酶（PO）的影响图，其中对照组不添加任何免疫增强剂。

具体实施方式

下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

材料：罗氏沼虾虾样购自浙江省淡水水产研究所下属的长兴罗氏沼虾SPF良种基地；L-二羟苯丙氨酸（L-DOPA）购自sigma公司；BCA法蛋白定量试剂盒、过氧化物酶(POD)检测试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、碱性磷酸酶(AKP)检测试剂盒、酸性磷酸酶(ACP)检测试剂盒和溶菌酶(LZM)检测试剂盒等均购自南京建成生物工程研究所。

实施例1：

一种高通量快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂的方法，包括如下步骤：

一、待筛选免疫增强剂的处理

待筛选免疫增强剂选择现有文献记载的一些具有提高免疫力、抗菌等效果的免疫增强剂：枸杞多糖、香菇多糖、银耳多糖、海带多糖、竹叶黄酮、黄芩苷、左旋咪唑、黄芪多糖、虫草多糖、灵芝多糖、茶树菇多糖、金针菇多糖、云芝多糖、银耳多糖、维生素C、甲壳素、壳聚糖、松花粉、酵母壁多糖、(-葡聚糖等共计20种。

将待筛选免疫增强剂与灭菌的PBS缓冲液（NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L,pH7.4）混合，配制成浓度为0.5mg/mL的待筛选免疫增强剂溶液，然后用孔径为0.45μm滤膜过滤除菌，4℃保存待用。

二、罗氏沼虾血淋巴细胞的采集与培养

（1）选取健康的、体重在20-40g的罗氏沼虾成虾，用75%酒精对罗氏沼虾成虾体表消毒。

（2）在紫外消毒过的超净工作台中，利用一次性注射器通过虾围心腔采集血淋巴，将采集的血淋巴快速注入已高压灭菌的抗凝剂中混合均匀，得到血淋巴与抗凝剂的混合液。抗凝剂由柠檬酸钠、柠檬酸、葡萄糖与水混合制成，柠檬酸钠浓度为50mmol/L，柠檬酸浓度为25mmol/L，葡萄糖浓度为81.6mmol/L；血淋巴与抗凝剂的体积比为1：2。

（3）向血淋巴与抗凝剂的混合液中加入青链霉素，青链霉素的用量为100万单位/毫升混合液，混匀后转入48孔细胞培养板中，每孔1ml，静置30min后用倒置显微镜观察细胞贴壁情况。

（4）待细胞贴壁，去除上清液后，先向细胞培养板各孔中加入1ml的L-15细胞培养液（市售），然后加入不同种类的待筛选免疫增强剂溶液（不添加待筛选免疫增强剂溶液的作为对照组），每种待筛选免疫增强剂溶液分别加入50μL/孔、100μL/孔、150μL/孔三种体积作平行，使得细胞培养板中每种待筛选免疫增强剂终浓度比为1：2：3，轻轻震荡细胞培养板，混合均匀。

（5）将细胞培养板密封后，置于恒温生化培养箱，28±1℃培养。

三、罗氏沼虾非特异性免疫指标的检测与分析

（6）在培养24小时时采集细胞：先去除细胞培养液，再用PBS缓冲液（pH7.4）进行漂洗，然后收集细胞于300μLPBS缓冲液（pH7.4）中，获得细胞悬液。

（7）细胞悬液在冰浴条件下利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，超声波细胞破碎仪的工作参数为：功率200W，超声20s，间隔5s，共超声10min。

（8）采用BCA法蛋白定量试剂盒测定各组样品的总蛋白量。

（9）然后采用试剂盒分别测定各组样品的POD、SOD、AKP、ACP和LZM值，PO值以1mg蛋白质1min光密度值增加0.001为1个酶活力，具体测量步骤：在100μL细胞悬液中加入50μL反应底物L-DOPA（3mg/ml），25℃孵育5min，然后加入150μL双蒸水缓解酶反应，紧接着在波长490nm处读取吸光值，每隔5min读一次，持续20min，以PBS为对照。

计算后结合对照组进行比较分析，筛选出能显著提高酶活力的免疫增强剂。

实施例2：

一种高通量快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂的方法，包括如下步骤：

一、待筛选免疫增强剂的处理

待筛选免疫增强剂选择现有文献记载的一些免疫增强剂：枸杞多糖、香菇多糖、银耳多糖、海带多糖、竹叶黄酮、黄芩苷、左旋咪唑、黄芪多糖、虫草多糖、灵芝多糖、茶树菇多糖、金针菇多糖、云芝多糖、银耳多糖、维生素C、甲壳素、壳聚糖、松花粉、酵母壁多糖、(-葡聚糖等共计20种。

将待筛选免疫增强剂与灭菌的PBS缓冲液（NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄10mmol/L，KH₂PO₄2mmol/L,pH7.4）混合，配制成浓度为1.0mg/mL的待筛选免疫增强剂溶液，然后用孔径为0.45μm滤膜过滤除菌，4℃保存待用。

二、罗氏沼虾血淋巴细胞的采集与培养

（1）选取健康的、体重在20-40g的罗氏沼虾成虾，用75%酒精对罗氏沼虾成虾体表消毒。

（2）在紫外消毒过的生物安全柜中，利用一次性注射器通过虾围心腔采集血淋巴，将采集的血淋巴快速注入已高压灭菌的抗凝剂中混合均匀，得到血淋巴与抗凝剂的混合液。抗凝剂由柠檬酸钠、柠檬酸、葡萄糖与水混合制成，柠檬酸钠浓度为50mmol/L，柠檬酸浓度为25mmol/L，葡萄糖浓度为81.6mmol/L；血淋巴与抗凝剂的体积比为1：2。

（3）向血淋巴与抗凝剂的混合液中加入青链霉素，青链霉素的用量为200万单位/毫升混合液，混匀后转入24孔细胞培养板中，每孔2ml，静置60min后用倒置显微镜观察细胞贴壁情况。

（4）待细胞贴壁，去除上清液后，先向细胞培养板各孔中加入2ml的1640细胞培养液（市售），然后加入不同种类的待筛选免疫增强剂溶液（不添加待筛选免疫增强剂溶液的作为对照组），每种待筛选免疫增强剂溶液分别加入50μL/孔、100μL/孔、150μL/孔三种体积作平行，使得细胞培养板中每种待筛选免疫增强剂终浓度比为1：2：3，轻轻震荡细胞培养板，混合均匀。

（5）将细胞培养板密封后，置于恒温生化培养箱，28±1℃培养。

三、罗氏沼虾非特异性免疫指标的检测与分析

（6）在培养24小时时采集细胞：先去除细胞培养液，再用PBS缓冲液（pH7.4）进行漂洗，然后收集细胞于500μLPBS缓冲液（pH7.4）中，获得细胞悬液。

（7）细胞悬液在冰浴条件下利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，超声波细胞破碎仪的工作参数为：功率250W，超声15s，间隔5s，共超声5min。

（8）采用BCA法蛋白定量试剂盒测定各组样品的总蛋白量。

（9）然后采用试剂盒分别测定各组样品的POD、SOD、AKP、ACP和LZM值，PO值以1mg蛋白质1min光密度值增加0.001为1个酶活力，具体测量步骤：在100μL细胞悬液中加入50μL反应底物L-DOPA（3mg/ml），25℃孵育5min，然后加入150μL双蒸水缓解酶反应，紧接着在波长490nm处读取吸光值，每隔5min读一次，持续20min，以PBS为对照。

计算后结合对照组进行比较分析,筛选出能显著提高酶活力的免疫增强剂。

利用本发明的筛选方法，在体外筛选罗氏沼虾免疫增强剂，实验结果表明，罗氏沼虾血淋巴细胞悬液在静置30～60min后基本贴壁，如附图1所示。通过对培养24h后的细胞进行溶菌酶（LZM）活力测定，筛选出LZM值显著高于对照组的免疫增强剂15种，如附图2所示。

通过对培养24h后的细胞进行酸性磷酸酶（ACP）活力测定，筛选出ACP值显著高于对照组的免疫增强剂10种，如附图3所示。

通过对培养24h后的细胞进行超氧化物酶（SOD）活力测定，筛选出SOD值显著高于对照组的免疫增强剂14种，如附图4所示。

通过对培养24h后的细胞进行酚氧化酶（PO）活力测定，筛选出PO值显著高于对照组的免疫增强剂13种，如附图5所示。

对碱性磷酸酶（AKP）及过氧化物酶(POD)活力测定，未得到有效结果。综合LZM、ACP、SOD、PO的检测结果，可筛选到具有较好提高罗氏沼虾非特异性免疫指标的免疫增强剂：黄芩苷、左旋咪唑、茶树菇多糖、枸杞多糖、灵芝多糖等。

根据以上实验结果，在饲料中添加了浓度分别为0.05%、0.1%、0.2%的上述筛选得到的5种免疫增强剂（黄芩苷、左旋咪唑、茶树菇多糖、枸杞多糖、灵芝多糖）进行养殖试验验证。经过7周饲养后，检测免疫增强剂对虾LZM、ACP、AKP、SOD、PO等的影响，并利用致病性罗氏沼虾嗜水气单胞菌进行攻毒实验，分析服用免疫增强剂的罗氏沼虾的抗病能力。结果显示黄芩苷、左旋咪唑、茶树菇多糖、枸杞多糖、灵芝多糖等均能提供罗氏沼虾的机体免疫力。

可见本发明能够在体外快速、高通量的进行免疫增强剂的筛选。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (6)

1.一种高通量快速筛选罗氏沼虾免疫增强剂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

一、待筛选免疫增强剂的处理

将待筛选免疫增强剂与灭菌的PBS缓冲液混合，配制成浓度为0.5-1.0mg/mL的待筛选免疫增强剂溶液，然后用滤膜过滤除菌，4℃保存待用；

二、罗氏沼虾血淋巴细胞的采集与培养

（1）选取健康的罗氏沼虾成虾，对罗氏沼虾成虾体表消毒；

（2）在紫外消毒过的超净工作台或生物安全柜中，利用一次性注射器通过虾围心腔采集血淋巴，将采集的血淋巴快速注入已高压灭菌的抗凝剂中混合均匀，得到血淋巴与抗凝剂的混合液；

（3）向血淋巴与抗凝剂的混合液中加入青链霉素，混匀后转入24孔或48孔细胞培养板中，每孔1-2ml，静置30-60min后用倒置显微镜观察细胞贴壁情况；

（4）待细胞贴壁，去除上清液后，先向细胞培养板各孔中加入1-2ml的L-15或1640细胞培养液，然后加入不同种类的待筛选免疫增强剂溶液，每种待筛选免疫增强剂溶液分别加入50μL/孔、100μL/孔、150μL/孔三种体积作平行，轻轻震荡细胞培养板，混合均匀；

（5）将细胞培养板密封后，置于恒温生化培养箱，28±1℃培养；

三、罗氏沼虾非特异性免疫指标的检测与分析

（6）在培养的不同时段采集细胞：先去除细胞培养液，再用PBS缓冲液进行漂洗，然后收集细胞于300-500μLPBS缓冲液中，获得细胞悬液；

（7）细胞悬液在冰浴条件下利用超声波细胞破碎仪破碎细胞；

（8）采用BCA法蛋白定量试剂盒测定各组样品的总蛋白量；

（9）然后分别测定各组样品的PO、POD、SOD、AKP、ACP和LZM值，计算后结合对照组进行比较分析，筛选样品PO、POD、SOD、AKP、ACP和LZM值中一种或几种值显著高于对照组的样品，得到罗氏沼虾免疫增强剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：滤膜的孔径为0.45μm。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述抗凝剂由柠檬酸钠、柠檬酸、葡萄糖与水混合制成，柠檬酸钠浓度为50mmol/L，柠檬酸浓度为25mmol/L，葡萄糖浓度为81.6mmol/L。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中血淋巴与抗凝剂的体积比为1：2。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中青链霉素的用量为100-200万单位/毫升。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（7）中超声波细胞破碎仪的工作参数为：功率200-250W，超声15-20s，间隔5s，共超声5-10min。