CN112961899A - 一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3d皮肤模型抗炎功效筛选方法 - Google Patents

一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3d皮肤模型抗炎功效筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，结合细胞模型和3D皮肤模型检测结果，对目标原料的抗炎活性进行筛选，包含两种维度的三种模型，使得化妆品原料作用对象涵盖了皮肤表皮层立体细胞结构到真皮层免疫细胞，构建化妆品原料的抗炎功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势；为皮肤护理产品抗炎活性原料的前期验证及筛选提供快捷可靠的评价方法，为抗炎原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发和功效验证的进一步研究提供有效依据。

Description

一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选 方法
技术领域
本发明涉及一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，属于化妆品原料性能测试技术领域。
背景技术
抗炎舒敏类功效性护肤品的开发中，其活性原料的抗炎功效评估是配方设计前期的重要步骤之一。传统活性原料抗炎功效评价手段主要依赖小鼠的耳肿胀实验，通常实验周期长，成本高，对于高通量原料筛选非常不方便。随着3R原则的循环经济理念推出，3R原则已经成为生物医药科学研究及相关法规管理普遍遵守的准则，欧洲化妆品法规也颁布了关于动物实验在化妆产品中的禁令，这些法规的变化促进了体外替代验证方法的开发及应用。构建体外替代功效验证方法有助于更为经济高效地实现抗炎舒敏类化妆品原料的开发和筛选。
炎症的发生通常伴随多种炎症因子的上调，巨噬细胞主要分布于人体真皮层中，是皮肤免疫应答过程的关键位点之一，内毒素诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞模型被广泛用于研究炎症反应，巨噬细胞在外部受到细菌毒素如脂多糖(LPS)等刺激时，可促使炎症介质如TNF-α、IL-6、PGE2、NO等的分泌。3D皮肤模型拥有与人正常皮肤相似的生理和结构，并且市售3D皮肤为统一化生产，结构特征较为稳定，利用3D皮肤模型进行抗炎活性物的检测，可以从化学诱导及物理诱导方法促使炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2等的分泌，构建炎症模型，模拟真实皮肤的炎症受损状态，同时评估化妆品原料的抗炎舒敏功效。人体皮肤炎症的发生在皮肤表皮层及真皮层均能产生免疫应答，现有体外抗炎功效评估方法多为免疫细胞维度评估，而多数3D皮肤模型主要由角质细胞及成纤维细胞组成，通常缺乏免疫细胞，目前两种评估维度结合，综合评估化妆品原料抗炎功效的体外方法还未见相关专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，包含两种维度的三种模型，使得化妆品原料作用对象涵盖了皮肤表皮层立体细胞结构到真皮层免疫细胞，构建化妆品原料的抗炎功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势。
实现上述目的的技术方案是：一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，结合细胞模型和3D皮肤模型检测结果，对目标原料的抗炎活性进行筛选，包括以下步骤：
S1，评估原料样品的溶解性，确定溶解方案；
S2，RAW264.7小鼠巨噬细胞培养，3D皮肤培养；
S3，细胞及3D皮肤活性检测确定原料样品最适浓度，包括以下工序：
S31，取步骤S2中对数生长巨噬细胞接种培养16h～24h，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液，培养16h～24h，加入CCK-8或者MTT检测吸光度，计算细胞存活率；
S32，取步骤S2中生长状态稳定3D皮肤，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的缓冲液，培养24h～48h，用MTT检测3D皮肤组织存活率；
S33，步骤S31筛选得到RAW264.7巨噬细胞模型细胞存活率为90％(CV90)时对应的原料样品给药浓度；
S34，步骤S32筛选得到3D皮肤组织存活率为90％(CV90)时对应的原料样品3D皮肤模型给药浓度；
S4，取步骤S2中对数生长RAW264.7小鼠巨噬细胞接种培养16h～24h，设置空白对照组，诱导对照组及样本组，其中，空白对照组及诱导对照组加入完全培养基，样品组加入由完全培养基配置的步骤S33中CV90对应给药浓度的原料样品，培养1h～4h后，诱导对照组及样本组加入LPS，培养16h～24h，分别检测细胞上清液分泌炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2和NO的含量；
S5，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，经SLS处理5min～30min后，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入缓冲液，样品组加入步骤S34中CV90对应给药浓度的原料样品，培养24h～48h，分别检测培养液中炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量；
S6，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，经UV处理3min～10min后，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入缓冲液，样品组加入步骤S34中CV90对应给药浓度的原料样品，培养24h～48h，分别检测培养液中炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量；
S7，汇总步骤S4～S6中炎症因子含量测定结果，计算检测原料样品组分泌量与诱导组分泌量比值，得到炎症因子相对表达量，应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD；各组间比较采用One-way ANOVA统计分析；所有的统计分析均为双尾；
p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该受试物具有一定抑制作用，评分为0.3；
p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该受试物具有显著抑制作用，评分为0.7；
p<0.001认为具有极其显著差异，用“***”表示，说明该受试物具有极其显著抑制作用，评分为1.0；
根据上述评分标准汇总所有检测指标评分，由此筛选出最佳抗炎功效原料。
上述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其中，所检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2和NO含量中至少一种构成细胞维度评价指标，所检测炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量中至少一种构成3D皮肤维度评价指标。
上述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，步骤S1中，水中溶解度≥1000μg/mL的原料样品直接溶于培养基进行后续实验；
水中溶解度＜1000μg/mL的原料样品用二甲基亚砜或乙醇溶剂溶解后进行后续实验。
上述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，使用二甲基亚砜或乙醇作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的1％，且对照样品和实验样品中溶剂的体积比例相同。
上述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，步骤S2中，RAW264.7小鼠巨噬细胞采用DMEM+10％FBS完全培养基培养，3D皮肤采购配套专用培养基进行气液两相培养，所有培养条件均为37±0.5℃，(5±1)％CO2浓度，饱和湿度。
上述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，步骤S31中，RAW264.7小鼠巨噬细胞以(0.5-2.0)x105个细胞/mL的密度接种于96孔板中，每孔培养基100uL，每种待测原料样品配置5～8个浓度梯度，每个浓度设3个以上复孔。
上述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，步骤S4中，RAW264.7小鼠巨噬细胞以(0.5-1.5)x105个细胞/mL的密度接种于24孔板中，每孔培养基1000uL，加入LPS最终浓度为100ng/mL～10μg/mL，每种原料样品设3个及以上复孔。
上述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，步骤S5中，SLS处理浓度为0.1％～1.0％，所述缓冲液为DPBS缓冲液。
上述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，步骤S6中，所述UV处理是采用太阳光模拟器进行UV辐照，UVA剂量为500mJ～2000mJ，UVB剂量为50mJ～200mJ，所述缓冲液为DPBS缓冲液。
上述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，步骤S4～S6中，炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-1α、IL-8和PGE2含量采用ELISA试剂盒检测；炎症因子NO含量采用NO检测试剂盒检测。
本发明的化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，包含两种维度的三种模型，使得化妆品原料作用对象涵盖了皮肤表皮层立体细胞结构到真皮层免疫细胞，构建化妆品原料的抗炎功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势；为皮肤护理产品抗炎活性原料的前期验证及筛选提供快捷可靠的评价方法，为抗炎原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发和功效验证的进一步研究提供有效依据。
附图说明
图1a为受试物1～4的RAW264.7小鼠巨噬细胞存活率；
图1b为受试物5～8的RAW264.7小鼠巨噬细胞存活率；
图2为LPS诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞模型上清液NO相对分泌量；
图3a为LPS诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞模型上清液TNF-α相对分泌量；
图3b为LPS诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞模型上清液IL-6相对分泌量；
图4为受试物1～8的Episkin3D表皮组织存活率；
图5a为SLS诱导Episkin3D表皮炎症模型培养液IL-1α相对分泌量；
图5b为SLS诱导Episkin3D表皮炎症模型培养液IL-8相对分泌量；
图6为UV诱导Episkin3D表皮炎症模型培养液PGE2相对分泌量；
图7为本发明的化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法的抗炎功效筛选流程图。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：
实施例中所用试剂和材料如无特殊说明均可从市场常规购得。
一、实验材料
1.实验材料及仪器
1.1细胞及3D皮肤
RAW264.7小鼠巨噬细胞来源于ATCC、中国科学院细胞库或中国典型培养物保藏中心细胞库等世界培养物保藏联合会登记成员单位。3D皮肤来源于市售功能稳定的人重组3D表皮模型。
本实施例中，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，EpiSkin3D皮肤模型购自上海斯安肤诺生物科技有限公司。
1.2主要试剂
(1)细胞培养相关试剂：DMEM培养基、胎牛血清、PBS(1x)均购自美国Gibco公司；
(2)3D皮肤培养相关试剂：EpiSkin维持培养基、EpiSkin检测培养基均购自上海斯安肤诺生物科技有限公司，DPBS购自美国Gibco公司；
(3)化学试剂：地塞米松磷酸钠、十二烷基硫酸钠(SLS)、噻唑蓝(MTT)、脂多糖(LPS)均购自美国Sigma公司；DMSO、盐酸、异丙醇均购自国药集团化学试剂有限公司；
(4)ELISA检测：小鼠TNF-αELISA试剂盒、小鼠IL-6ELISA试剂盒、人IL-1αELISA试剂盒、人IL-8ELISA试剂盒、人PGE2ELISA试剂盒均购自杭州联科生物技术有限公司；
(5)NO检测：一氧化氮检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.3溶液配置
(1)RAW264.7细胞DMEM完全培养基：取450mLDMEM培养基，加入50mL胎牛血清(FBS)，充分混匀后4℃保存，使用前放入37℃水浴锅中预热；
(2)噻唑蓝(MTT)溶液：称取MTT粉末100mg，加PBS20mL，涡旋振荡溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃避光保存，使用时4℃解冻；
(3)细胞MTT检测液：MTT溶液在DMEM中稀释至0.5mg/mL；
(4)3D皮肤MTT检测液：MTT溶液在EpiSkin检测培养基中稀释至0.3mg/mL；
(5)3D皮肤酸化异丙醇萃取液：盐酸溶于异丙醇，终浓度为0.04mol/mL。
1.4仪器
酶标仪(Thermo，美国)，CO2培养箱(Thermo，美国)，倒置显微镜(奥林巴斯，日本)，生物安全柜(Thermo，美国)，高速低温离心机(Thermo，美国)
2.待测原料样品
原料样品(受试物)名称如表1所示：
编号 样品名称
1 活性物A
2 活性物B
3 活性物C
4 活性物D
5 活性物E
6 活性物F
7 活性物G
8 活性物H
表1
二、LPS诱导RAW264.7小鼠巨噬细胞炎症模型评估原料抗炎活性
1.细胞培养
RAW264.7细胞用完全培养液于37℃、5％CO2及饱和湿度的CO2培养箱内培养，培养至细胞融合度达到70％-80％进行传代，传代时除去原培养基，加入新鲜培养基轻柔吹打，收集细胞，以1:3或1:4比例进行传代。
2.受试物细胞毒性MTT检测及分析
2.1细胞活力MTT检测
收集细胞形态良好，处于对数生长期的RAW264.7细胞，用完全培养基配至浓度为每1mL含0.5×105个细胞，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μL，96孔板最外围一圈不接种细胞，加入150μLPBS，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养。16h后除去原培养基，加入新鲜完全培养基配置的浓度梯度受试物，每个受试物设置6个浓度，液体原料浓度(v/v)分别为10.0％、3.16％、1.00％、0.316％、0.100％、0.0316％，固体原料浓度分别为1000μg/mL、316μg/mL、100μg/mL、31.6μg/mL、10μg/mL、3.16μg/mL，每孔100μL，设置仅含有细胞的对照组，每个实验孔设置3个复孔，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养18h，去除上清液，用PBS轻柔清洗2次，所有含细胞的孔及3个空白孔加入100μL细胞MTT检测液，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下孵育4h，去除上清液，用PBS轻柔清洗2次，每孔加DMSO100μL，混匀后在酶标仪上读取波长在570nm处吸光度，以630nm为参比波长，记录测定结果。
2.2细胞存活率分析及浓度确定
校准OD＝OD570-OD630
细胞活力计算公式如下：
细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]x100％
As：实验孔(含有细胞的培养基、MTT、待受试物)
Ac：对照孔(含有细胞的培养基、MTT、不含受试物)
Ab：空白孔(不含细胞和受试物的培养基、MTT)
细胞90％活率(CV90)的计算
Figure BDA0002948185780000071
式中：
a：细胞活率超过90％的最小值；
c：细胞活率低于90％的最大值；
b和d表示a和c细胞活性对应的浓度。
根据上述公式计算受试物的细胞活力，选取CV90对应的浓度作为抗炎验证给药浓度。
3.LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型上清液TNF-α、IL-6、NO分泌量检测
收集细胞形态良好，处于对数生长期的RAW264.7细胞，用完全培养基配至浓度为每1mL含0.5×105个细胞，接种于24孔细胞培养板中，每孔1000μL，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养。18h后除去原培养基，设置空白对照组，诱导对照组及样本组，其中，空白对照组及诱导对照组加入完全培养基，样品组加入由完全培养基配置的CV90对应浓度受试物，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养4h，除细胞对照组，每孔加入LPS至终浓度为1μg/mL，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养20h，收集细胞培养基，以2000rpm、4℃离心10min，收集上清液，使用ELISA试剂盒检测上清液的TNF-α及IL-6含量，使用Griess试剂检测上清液NO含量，操作步骤参照试剂盒说明书。
选择数据软件计算标准曲线，将待测样品的OD值代入标准曲线中计算TNF-α、IL-6及NO的含量，并计算以LPS诱导组为100％的相对表达量，计算公式如下所示：
相对表达量＝样本组含量/诱导对照组含量
三、SLS及UV诱导3D皮肤炎症模型评估原料抗炎活性
1.3D皮肤培养
3D表皮模型经过运输后，放入12孔板内进行稳定培养，每孔2ml维持培养基，培养条件为37℃、5％CO2及饱和湿度，稳定培养12h后使用。
2.受试物3D皮肤毒性MTT检测
2.13D皮肤MTT检测
每种原料样品(受试物)用PBS稀释3个浓度，质量浓度分别为5％，2％和1％，每孔添加200μL于3D表皮模型上，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养36h，用DPBS缓冲液彻底冲洗以去除表皮模型表面的样品和阴性对照，用棉签将每个表皮模型表面残留液体轻轻吸干，进行后续MTT检测。
在12孔板中加入0.3mg/ml的MTT工作液，将表皮模型转移至孔内，确认没有气泡。将载有MTT溶液和表皮模型的培养板放在37℃，5％CO2，饱和湿度的CO2培养箱培养3h。使用打孔器取下表皮模型样块，用镊子轻柔的将表皮模型从胶原托上分离并翻转，将表皮与胶原托一并移入2ml离心管中，加入500μl酸化异丙醇，在涡旋振荡仪上混匀，室温避光过夜或4℃放置72h，萃取甲瓒。转移200μl酸化异丙醇萃取液，至96孔板，在570nm读取OD值，每一块表皮模型在96孔板上测试两个平行。
2.23D皮肤细胞活力分析
细胞活力计算公式如下：
细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]x100％
As：实验孔(含有3D皮肤的培养基、MTT、待受试物)；
Ac：对照孔(含有3D皮肤的培养基、MTT、不含受试物)；
Ab：空白孔(不含3D皮肤和受试物的培养基、MTT)；
3D皮肤细胞90％活率(CV90)的计算：
Figure BDA0002948185780000091
式中：
a：细胞活率超过90％的最小值
c：细胞活率低于90％的最大值
b和d表示a和c细胞活性对应的浓度
根据上述公式计算受试物的细胞活力，选取CV90对应的浓度作为抗炎验证给药浓度。
3.ELISA检测培养液炎症因子分泌量
3.1SLS诱导3D皮肤炎症模型构建及原料检测
将带有表皮模型的培养板取出放入生物安全柜内，在表皮模型上加入0.1％SLS，于37℃、5％CO2及饱和湿度条件下培养5min，用DPBS缓冲液彻底冲洗以去除表皮模型表面的刺激物。用棉签将每个表皮模型表面残留液体轻轻吸干，将表皮模型逐个移入加有维持培养基的孔板中。
将200μl待测样品和DPBS对照均匀涂抹在表皮模型表面。37℃，5％CO2，相对湿度95％的CO2培养箱培养36h。用DPBS缓冲液冲洗，用棉签将每个表皮模型表面残留液体轻轻吸干。将孔板内后培养的维持培养液收集，用ELISA试剂盒进行IL-1α、IL-8的含量的检测。操作步骤与试剂盒说明书一致。
3.2UV诱导3D皮肤炎症模型构建及原料检测
将带有表皮模型的培养板取出放入紫外太阳光模拟器中，在表皮模型上进行采用太阳光模拟器进行UV辐照，使用UV-meter进行辐照量监测，照射至UVA剂量为500mJ，UVB剂量为50mJ，将表皮模型逐个移入加有维持培养基的孔板中。
将200μl待测样品和DPBS对照均匀涂抹在表皮模型表面。37℃，5％CO2，饱和湿度的CO2培养箱培养36h。用DPBS缓冲液彻底冲洗以去除表皮模型表面的样品阴性对照。用棉签将每个表皮模型表面残留液体轻轻吸干。将孔板内后培养的维持培养液收集，用ELISA试剂盒进行PGE2的含量的检测。操作步骤与试剂盒说明书一致。
3.3 ELISA数据处理
选择数据软件计算标准曲线，将待测样品的OD值代入标准曲线中计算IL-1α、IL-8及PGE2的含量。以诱导对照组为100％计算相对表达量，计算公式如下所示：
相对表达量＝样本组含量/诱导对照组含量
四、结果分析
应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD。各组间比较采用One-way ANOVA统计分析。所有的统计分析均为双尾。p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，p<0.001认为具有极其显著差异，用“***”表示。
4.1 LPS诱导RAW264.7细胞抗炎模型检测结果
4.1.1受试物细胞毒性检测
受试物(原料样品)1～8的细胞存活率MTT检测结果如图1a和图1b所示，根据所得结果按照公式计算CV90，待测样品在RAW264.7细胞CV90对应浓度如
表2所示，后续给药按照该浓度进行孵育。
编号 CV90
1 1.01％
2 0.94％
3 2.28％
4 3.17％
5 2.63％
6 60.6μg/mL
7 13.5μg/mL
8 0.28％
表2
4.1.2细胞上清液TNF-α、IL-6及NO分泌量
收集RAW264.7细胞上清液，按照ELISA试剂盒及NO检测试剂盒说明书步骤操作，检测并计算上清液中炎症因子TNF-α、IL-6及NO分泌量，并计算LPS诱导组为对照的相对分泌量。NO相对分泌量如图2所示，TNF-α及IL-6相对分泌量如图3a和图3b所示，###P<0.001为LPS诱导对照组与空白对照组对比，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001为样品组与LPS诱导对照组对比。
4.23D皮肤炎症模型检测结果
4.2.1受试物3D表皮毒性检测
细胞存活率MTT检测结果如图4所示，根据所得结果按照公式计算CV90，待测样品在Episkin3D皮肤模型CV90对应浓度结果如表3所示，后续给药按照该浓度进行孵育。
编号 CV90
1 3.98％
2 5.00％
3 5.00％
4 3.03％
5 5.00％
6 1.64％
7 1.74％
8 2.80％
表3
4.2.2SLS诱导3D皮肤抗炎模型培养液IL-1α及IL-8分泌量
收集Episkin3D表皮培养液，按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，检测并计算培养液中炎症因子IL-1α及IL-8分泌量，并计算PBS组为对照的相对表达量，IL-1α及IL-8相对分泌量如图5a和图5b所示，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001为样品组与SLS诱导对照组对比。
4.2.3UV诱导3D皮肤抗炎模型培养液PGE2分泌量
收集Episkin3D表皮培养液，按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，检测并计算培养液中炎症因子PGE2分泌量，并计算PBS组为对照的相对表达量，PGE2相对分泌量如图6所示，*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001为样品组与UV诱导对照组对比。
4.3综合评估结果及分析
所有受试物按照图7所示流程进行评估，本实施例中检测的8个受试物在细胞水平及3D皮肤水平的实验显著性差异结果汇总如表4所示，依据表5标准进行评估及打分，受试物抗炎功效评估结果如表6所示，根据汇总得分结果进行排序，本批受试物均具有抗炎功效，抗炎功效强度排序为1>4＝5>8>2>3>7>6，筛选得到最佳抗炎功效原料为活性物A。
Figure BDA0002948185780000121
表4
Figure BDA0002948185780000122
Figure BDA0002948185780000131
表5
Figure BDA0002948185780000132
表6
本发明的化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，结合细胞模型和3D皮肤模型检测结果，对目标原料的抗炎活性进行筛选，包括以下步骤：
S1，评估原料样品的溶解性，确定溶解方案；水中溶解度≥1000μg/mL的原料样品直接溶于培养基进行后续实验；
水中溶解度＜1000μg/mL的原料样品用二甲基亚砜或乙醇溶剂溶解后进行后续实验；使用二甲基亚砜或乙醇作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的1％，且对照样品和实验样品中溶剂的体积比例相同。
S2，RAW264.7小鼠巨噬细胞培养，3D皮肤培养；
S3，细胞及3D皮肤活性检测确定原料样品检测浓度，包括以下工序：
S31，取步骤S2中对数生长RAW264.7小鼠巨噬细胞接种培养16h～24h，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液，培养16h～24h，加入CCK-8或者MTT检测吸光度，计算细胞存活率；
S32，取步骤S2中生长状态稳定3D皮肤，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的缓冲液，培养24h～48h，用MTT检测3D皮肤组织存活率；
S33，步骤S31筛选得到RAW264.7巨噬细胞模型细胞存活率为90％(CV90)时对应的原料样品给药浓度；
S34，步骤S32筛选得到3D皮肤组织存活率为90％(CV90)时对应的原料样品3D皮肤模型给药浓度；
S4，取步骤S2中对数生长巨噬细胞接种培养16h～24h，设置空白对照组，诱导对照组及样本组，其中，空白对照组及诱导对照组加入完全培养基，样品组加入由完全培养基配置的步骤S33中CV90对应给药浓度的原料样品，培养1h～4h后，诱导对照组及样本组加入LPS，培养16h～24h，分别检测细胞上清液分泌炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2和NO的含量；
S5，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，经SLS处理5min～30min后，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入缓冲液，样品组加入步骤S34中CV90对应给药浓度的原料样品，培养24h～48h，分别检测培养液中炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量；
S6，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，经UV处理3min～10min后，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入缓冲液，样品组加入步骤S34中CV90对应给药浓度的原料样品，培养24h～48h，分别检测培养液中炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量；
S7，汇总步骤S4～S6中炎症因子含量测定结果，计算检测原料样品组分泌量与诱导组分泌量比值，得到炎症因子相对表达量，应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD；各组间比较采用One-way ANOVA统计分析；所有的统计分析均为双尾；
p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该受试物具有一定抑制作用，评分为0.3；
p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该受试物具有显著抑制作用，评分为0.7；
p<0.001认为具有极其显著差异，用“***”表示，说明该受试物具有极其显著抑制作用，评分为1.0；
根据上述评分标准汇总所有检测指标评分，由此筛选出最佳抗炎功效原料。
本发明的化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2和NO含量中至少一种构成细胞维度评价指标，炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量中至少一种构成3D皮肤维度评价指标。
综上所述，本发明的化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，结合细胞模型和3D皮肤模型检测结果，对目标原料的抗炎活性进行筛选，细胞维度评价指标包括炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2和NO含量中至少一种，3D皮肤维度评价指标包括炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量中至少一种；包含两种维度的三种模型，使得化妆品原料作用对象涵盖了皮肤表皮层立体细胞结构到真皮层免疫细胞，构建化妆品原料的抗炎功效评价方法，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势；为皮肤护理产品抗炎活性原料的前期验证及筛选提供快捷可靠的评价方法，为抗炎原料的复配方案提供参考依据，也为护肤品行业动物替代实验、皮肤护理产品开发和功效验证的进一步研究提供有效依据。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。

Claims (10)

1.一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，结合细胞模型和3D皮肤模型检测结果，对目标原料的抗炎活性进行筛选，包括以下步骤：
S1，评估原料样品的溶解性，确定溶解方案；
S2，RAW264.7小鼠巨噬细胞培养，3D皮肤培养；
S3，细胞及3D皮肤活性检测确定原料样品检测浓度，包括以下工序：
S31，取步骤S2中对数生长RAW264.7小鼠巨噬细胞接种培养16h～24h，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的培养基溶液，培养16h～24h，加入CCK-8或者MTT检测吸光度，计算细胞存活率；
S32，取步骤S2中生长状态稳定3D皮肤，加入实验样品，所述实验样品包含若干个不同浓度梯度原料样品，对照样品为不添加任何样品的缓冲液，培养24h～48h，用MTT检测3D皮肤组织存活率；
S33，步骤S31筛选得到RAW264.7巨噬细胞模型细胞存活率为90％(CV90)时对应的原料样品给药浓度；
S34，步骤S32筛选得到3D皮肤组织存活率为90％(CV90)时对应的原料样品3D皮肤模型给药浓度；
S4，取步骤S2中对数生长巨噬细胞接种培养16h～24h，设置空白对照组，诱导对照组及样本组，其中，空白对照组及诱导对照组加入完全培养基，样品组加入由完全培养基配置的步骤S33中CV90对应给药浓度的原料样品，培养1h～4h后，诱导对照组及样本组加入LPS，培养16h～24h，分别检测细胞上清液分泌炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2和NO的含量；
S5，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，经SLS处理5min～30min后，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入缓冲液，样品组加入步骤S34中CV90对应给药浓度的原料样品，培养24h～48h，分别检测培养液中炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量；
S6，取步骤S2中生长状态稳定的3D皮肤，经UV处理3min～10min后，设置诱导对照组及样品组，诱导对照组加入缓冲液，样品组加入步骤S34中CV90对应给药浓度的原料样品，培养24h～48h，分别检测培养液中炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量；
S7，汇总步骤S4～S6中炎症因子含量测定结果，计算检测原料样品组分泌量与诱导组分泌量比值，得到炎症因子相对表达量，应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD；各组间比较采用One-way ANOVA统计分析；所有的统计分析均为双尾；
p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，说明该受试物具有一定抑制作用，评分为0.3；
p<0.01认为具有非常显著差异，用“**”表示，说明该受试物具有显著抑制作用，评分为0.7；
p<0.001认为具有极其显著差异，用“***”表示，说明该受试物具有极其显著抑制作用，评分为1.0；
根据上述评分标准汇总所有检测指标评分，由此筛选出最佳抗炎功效原料。
2.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，所检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、PGE2和NO含量中至少一种构成细胞维度评价指标，所检测炎症因子IL-1α、IL-8和PGE2含量中至少一种构成3D皮肤维度评价指标。
3.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，步骤S1中，水中溶解度≥1000μg/mL的原料样品直接溶于培养基进行后续实验；
水中溶解度＜1000μg/mL的原料样品用二甲基亚砜或乙醇溶剂溶解后进行后续实验。
4.根据权利要求3所述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，使用二甲基亚砜或乙醇作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的1％，且对照样品和实验样品中溶剂的体积比例相同。
5.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，步骤S2中，RAW264.7小鼠巨噬细胞采用DMEM+10％FBS完全培养基培养，3D皮肤采购配套专用培养基进行气液两相培养，所有培养条件均为37±0.5℃，(5±1)％CO2浓度，饱和湿度。
6.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，步骤S31中，RAW264.7小鼠巨噬细胞以(0.5-2.0)x105个细胞/mL的密度接种于96孔板中，每孔培养基100uL，每种待测原料样品配置5～8个浓度梯度，每个浓度设3个及以上复孔。
7.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，步骤S4中，RAW264.7小鼠巨噬细胞以(0.5-2.0)x105个细胞/mL的密度接种于24孔板中，每孔培养基1000uL，加入LPS最终浓度为100ng/mL～10μg/mL，每种原料样品设3个及以上复孔。
8.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，步骤S5中，SLS处理浓度为0.1％～1.0％，所述缓冲液为DPBS缓冲液。
9.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，步骤S6中，所述UV处理是采用太阳光模拟器进行UV辐照，UVA剂量为500mJ～2000mJ，UVB剂量为50mJ～200mJ，所述缓冲液为DPBS缓冲液。
10.根据权利要求1所述的一种化妆品原料体外巨噬细胞联合3D皮肤模型抗炎功效筛选方法，其特征在于，步骤S4～S6中，炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-1α、IL-8和PGE2含量采用ELISA试剂盒检测；炎症因子NO含量采用NO检测试剂盒检测。
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