CN114262729A - 一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，旨在提供一种采用细胞作为检测手段用于评价化妆品舒缓功效的测试方法，该方法采用细胞替代人体试验，符合实验动物“3R”原则，测试方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差。所述测试方法为，体外培养小鼠巨噬细胞株，将待测样品加入细胞中进行测试，首先测试样品的细胞毒性，再选择无细胞毒性的浓度进行一氧化氮(NO)释放抑制试验，通过统计学手段分析评价样品的舒缓功效。本测试方法还通过多次实际应用，建立了舒缓功效的判定标准。本测试方法用于评价化妆品及其原料的舒缓功效评价，属于化妆品技术领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种测试方法，具体地说，是一种化妆品及其原料舒缓功效的测试方法；属于化妆品测试技术领域。
技术背景
化妆品的舒缓功效，指使用化妆品后有助于改善皮肤刺激等状态。具有舒缓功效的化妆品，应当通过化妆品功效宣称评价试验方式，可以同时结合文献资料或研究数据分析结果，进行功效宣称评价。根据化妆品功效宣称评价项目要求，舒缓功效可采用人体功效评价试验、消费者使用测试和实验室试验三种方法中任一种方法进行评价。但是，目前，针对舒缓功效的评价方法，还未有国家标准和行业标准。
脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是一种内毒素，来源于革兰氏阴性菌，能够对机体造成刺激，引起机体的发热等炎症反应。LPS可诱导巨噬细胞RAW264.7株产生过敏反应，释放NO(一氧化氮)，NO作为炎症反应的关键因子，在内毒素致机体损伤中起重要作用，过多的NO可以促进巨噬细胞释放IL-6、TNF-α，而这些炎症因子又可以促进细胞分泌更多的NO，形成恶性循环，加重炎症反应。NO在体内或水溶液中极易氧化成NO2，在酸性条件下，NO与重氮盐磺胺发生重氮反应，并生成重氮化合物，后者进一步与萘基乙烯基二胺发生耦合反应，该反应生成的产物浓度与NO浓度具有线性关系，在540nm处有最大吸收峰。
发明内容
为此，本发明的目的是通过检测样品对NO释放的抑制作用，从而评价样品对细胞炎症反应的舒缓作用，从而评价样品的舒缓功效；该方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差
一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，依次包括下述步骤：
1)体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7株，本发明所述的小鼠巨噬细胞RAW264.7株，是一种传代细胞系，可来源于各个细胞保藏中心或其他商业模式购得；
(2)调整小鼠巨噬细胞细胞浓度至5.0×104～2.0×105cell/mL，加入细胞培养板中，培养24-48h至细胞融合度达50％以上时用于细胞毒性检测；
(3)将(2)培养好的细胞板，弃去培养液；将样品用细胞培养基稀释成不同浓度(具体浓度梯度。说明：稀释浓度根据实际情况而定，没有特殊要求，目的就是要找出无细胞毒性的浓度)，加入细胞板中，同时设不加样品的细胞对照组、不加细胞及样品的空白对照组，100μl/孔，培养44-48h后，显微镜下观察细胞状态，弃去培养液，洗细胞板1-2次，加入MTT溶液，继续培养2-6h，弃去培养液，加入150μl/孔的DMSO，震荡5-10min，于570nm处测定吸光值。根据结果采用公式细胞活力(％)＝(T-C)/(N-C)×100％计算细胞活力，其中T为样品组的OD值，N为细胞对照组的OD值，C为空白组的OD值。根据细胞活力结果并结合细胞形态，筛选出细胞活力在85％或以上、细胞形态与细胞对照组无明显差异的浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度供下一步实验；
(4)重新培养细胞，调整细胞浓度至1.0×106～3.0×106cell/mL，加入细胞培养板中，100μl/孔，培养20～24h至细胞融合度达80％以上时用于NO释放抑制测试；
(5)将(4)培养好的细胞板，弃去培养液，洗细胞板1-2次，根据(3)的结果，将样品稀释至2倍无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，50μl/孔，共加样6孔，每孔补加50μl含LPS的营养液，同时设空白对照和阳性对照，其中空白对照加100μl/孔的含2％牛血清的DMEM，阳性对照用50μl/孔的无血清培养基补加50μl/孔的LPS营养液，加样完毕，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24h，培养结束后，从细胞板中每孔取50μl培养液放入新的细胞板，加入等体积的Griess试剂，充分混合后，于暗处反应10min，在540nm处检测OD值，记录结果；
(6)结果统计分析
NO相对含量(％)＝OD样品/ODPC×100％
NO抑制率(％)＝(ODPC-OD样品)/ODPC×100％
式中，OD样品指样品组的OD值均值，ODPC为阳性对照组的OD值均值；
(7)根据步骤(6)统计结果判定测试样品是否具有舒缓功效
进一步的，上述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，所述的小鼠巨噬细胞RAW264.7株的培养方法为：
进一步的，上述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，所述的细胞培养板为96孔细胞培养板。
进一步的，上述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，所述步骤2)至步骤4)所述的培养是将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24～48h。
进一步的，上述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，所述洗细胞板采用PBS溶液洗。
进一步的，上述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，所述判定标准为，步骤7)所述的判定方法为：当空白对照组(NC组)的NO相对含量≤50％时，试验成立；再用GraphPad Prism软件进行统计及显著性分析，计算P值，P＜0.01表示具有显著性差异；当P＜0.01且NO抑制率≥10％时，可判定为样品具有舒缓功效；否则判定为样品无舒缓功效。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案采用体外培养小鼠巨噬细胞株，将待测样品加入细胞中进行测试，首先测试样品的细胞毒性，再选择无细胞毒性的浓度进行一氧化氮(NO)释放抑制试验，通过统计学手段分析评价样品的舒缓功效。本测试方法还通过多次实际应用，建立了舒缓功效的判定标准，该方法经济快捷，测试过程可控，测试体系标准化，避免因人体个体差异引起的较大的结果偏差。本发明公开的方法属于实验室试验方法。
附图说明
图1是样品的细胞毒性曲线图
图2是NO释放结果分析图；
图3是样品的细胞毒性曲线图；
图4是NO释放结果分析；
图5是样品的细胞毒性曲线图；
图6是NO释放结果分析；
图7是样品的细胞毒性曲线图；
图8是NO释放结果分析。
具体实施方式
下面对本发明实施的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的主要测试流程，对于未特别注明的工艺参数或者条件，可参照常规技术进行。
本发明所述的小鼠巨噬细胞RAW264.7株，是一种传代细胞系，可来源于各个细胞保藏中心或其他商业模式购得，本发明所述的小鼠巨噬细胞RAW264.7株来源于中国典型培养物保藏中心。
实施例1
本发明提供的一种化妆品及其原料舒缓功效细胞测试方法，采用体外细胞作为测试手段，用于评价化妆品及其原料的舒缓功效。
其中，所述的细胞测试方法主要分为细胞传代培养、样品细胞毒性测试、样品NO释放抑制测试。
具体实施方式为：
1.细胞的培养：采用小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞株进行测试。
将冻存的小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞从液氮罐取出，用常规技术手段进行细胞的复苏和传代培养。具体复苏培养方式为：将冻存细胞在37℃左右水浴快速溶解，800～1000rpm低速离心5～10min，弃去上清液，底部细胞用含10％牛血清的DMEM培养基重悬，转移置T25细胞瓶中，放置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24～72h，当细胞融合度达80％以上时进行传代培养。传代培养方式为：弃去细胞培养基，用新鲜无血清培养基或PBS轻轻清洗1次，弃去，加入5～10ml含10％牛血清的DMEM培养基，把细胞瓶底部的细胞冲洗或借助细胞刮收集下来，取细胞悬液计数，根据细胞数调整细胞浓度至5.0×104～2.0×105cell/mL，转入新的细胞培养瓶中，放置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24～72h。
为保证细胞的活力和稳定，本方法采用复苏后2代以上的细胞进行测试，采用的细胞培养基为含10％牛血清的DMEM。
2.细胞毒性测试：调整细胞浓度至5.0×104～2.0×105cell/mL，加入96孔细胞培养板中，100μL/孔。将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24～48h，至细胞融合度达50％以上时用于细胞毒性检测。
将上述培养好的细胞板，弃去培养液。将样品用细胞培养基稀释成不同浓度，加入准备好的96孔细胞板中，100μL/孔，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养44～48h后，显微镜下观察细胞状态，弃去培养液，用PBS洗1-2次，每孔加入50μL的MTT溶液(噻唑蓝溶液)，继续培养2-6h，弃去培养液，加入150μl/孔的DMSO，震荡5-10min，于570nm处测定吸光值。根据结果采用公式细胞活力(％)＝(T-C)/(N-C)×100％计算细胞活力，其中T为样品组的OD值，N为细胞对照组的OD值，C为空白组的OD值。根据细胞活力结果并结合细胞形态，筛选出细胞活力在85％或以上、细胞形态与细胞对照组无明显差异的浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度供下一步实验。
所述的无明显细胞毒性的样品浓度筛选标准：该浓度下细胞的形态与空白对照组无明显差异，细胞毒性测试结果显示相对细胞活力不低于85％。
3.样品NO释放抑制测试：按第1项方法重新培养细胞，选择细胞融合度达80％以上的细胞，弃去细胞培养基，用新鲜无血清培养基或PBS轻轻清洗1次，弃去，加入5～10ml含10％牛血清的DMEM培养基，把细胞瓶底部的细胞冲洗或借助细胞刮收集下来，取细胞悬液计数，根据细胞数调整细胞浓度至1.0×106～3.0×106cell/mL，加入96孔细胞培养板中，100μL/孔。将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养20～24h，至细胞融合度达80％以上时用于NO释放抑制测试。
将培养好的细胞板，弃去培养液，用PBS洗1-2次。根据细胞毒性测试的结果，将样品稀释至2倍无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，50μL/孔，共加样6孔，每孔补加50μL含LPS的营养液，所述的LPS培养液，是采用含4％牛血清的DMEM培养基将LPS配制成125μg/ml的溶液。同时设空白对照和阳性对照，其中空白对照加100μL/孔的含2％牛血清的DMEM，阳性对照用50μL/孔的无血清DMEM培养基补加50μL/孔的LPS营养液。加样完毕，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24h。培养结束后，从细胞板中每孔取50μL培养液放入新的细胞板，加入等体积的Griess试剂，所述的Griess试剂，可采用商售的成品试剂，配制成3％浓度使用，也可按以下配方配制：萘乙二胺二盐酸盐0.1g，磺胺1g，用纯水配制成100m。细胞液与Griess试剂充分混合后，于暗处反应10min，在540nm处检测OD值，记录结果。
4.结果统计分析
NO相对含量(％)＝OD样品/ODPC×100％
NO抑制率(％)＝(ODPC-OD样品)/ODPC×100％
式中，OD样品指样品组的OD值均值，ODPC为阳性对照组的OD值均值。
本发明还公开了应用本测试方法判定样品舒缓功效的标准，具体实施方式为：
根据上述实施方式第4项的测试结果，当空白对照组(NC组)的NO相对含量≤50％时，试验成立。用GraphPad Prism软件进行统计及显著性分析，计算P值，P＜0.01表示具有显著性差异。当P＜0.01且NO抑制率≥10％时，可判定为样品具有舒缓功效；否则判定为样品无舒缓功效。
用细胞方法检测无舒缓功效的样品，可选择采用人体评价方法进一步判定。
采用本申请提供的技术方案进行下述化妆品及其原料检测，其方法和结果如下：
案例1一种具有舒缓功效化妆品A测试方法：
1.1、样品名称：舒缓急救面膜#1。
1.2、方法：
1.2.1、细胞测试方法：按本发明所述的方法进行样品的舒缓功效测试。首先将样品稀释成20％的初始浓度，再按
的稀释因子稀释成8个不同浓度在小鼠巨噬细胞上开展细胞毒性实验，具体浓度详见表1。根据细胞毒性结果，选择无细胞毒性的浓度进行NO释放抑制试验。
1.2.2、人体测试方法：通过31例健康中国受试者，先使用SLS溶液诱导手臂皮炎，然后使用测试样品，并在使用前、使用后1小时测试该诱导部位的经皮水分流失速率，由专业人员评估该部位的干燥、脱屑、发红分数。验证产品修护屏障和舒缓干燥、脱屑、发红功效。数据统计分析：统计分析软件为SPSS，采用Shapiro-WilkTest进行数据改善值正态分布的显著性检验，Sig.(双侧)＞0.01，则呈正态分布，进行配对t检验。Sig.(双侧)＜0.01，则呈非正态分布，进行Wilcoxon检验。
“n.s.”表示无统计学差异，P＞0.05；“*”表示有显著性差异，且0.01≤P＜0.05，记“*”；0.001≤P＜0.01，记“**”；p＜0.001，记：“***”。
变化率(百分比)＝(使用后数据均值-使用前数据均值)/使用前数据均值。
1.3、结果
1.3.1、细胞毒性结果
将样品稀释成8个不同浓度在小鼠巨噬细胞上开展细胞毒性实验，从细胞毒性检测结果看出，样品在1.99％浓度下的细胞活力为94.56％，无明显细胞毒性，因此选择2％的浓度作为无细胞毒性浓度进行下一步试验。结果详见表1、图1。
表1样品的细胞毒性检测结果
1.3.2、NO释放试验结果
将样品稀释为2倍无细胞毒性的浓度，即4％浓度，在小鼠巨噬细胞上开展NO释放抑制实验。根据检测结果可知，NC组与PC组相比，P＜0.0001，结果呈极显著性差异，且NC组的NO相对含量≤50％，试验成立；样品组与PC组相比，P＜0.0001，结果呈极显著性差异，样品组的NO抑制率为34.37％，提示具有舒缓作用。检测结果见表2和图2。
表2NO释放试验检测结果
1.3.3、人体试验结果
1.3.3.1、样本完成情况
本项目32名健康中国受试者入选，1名自动退出，最终31名受试者完成试验，男性5名，女性26名，平均年龄为27.1±3.1岁。
1.3.3.2、产品安全性评价结果
根据测试人员现场询问，结果无不良反应出现。
1.3.3.3、测试结果
使用产品后0.5小时，与使用前比较，经皮水分流失速率降低41.93％；使用产品后1小时，与使用前比较，经皮水分流失速率降低37.59％；具有显著性(P＜0.05)；提示该测试样品具有修护皮肤屏障功效。专业人员评估干燥评分降低71.76％，脱屑评分降低66.67％，发红评分降低69.57％；均且与使用前相比具有显著性(P＜0.05)，提示该样品具有舒缓干燥、脱屑、发红效果。
表3专业人员评估描述性统计结果
表4经皮水分流失速率描述性统计结果
表5专业人员评估统计分析结果
表6经皮水分流失速率统计分析结果
案例2一种具有舒缓功效化妆品B测试方法：
2.1、样品名称：舒缓修护精华水1。
2.2、方法：按本发明所述的方法进行样品的舒缓功效测试。首先将样品稀释成50％的初始浓度，再按
的稀释因子稀释成8个不同浓度在小鼠巨噬细胞上开展细胞毒性实验，具体浓度详见表1。根据细胞毒性结果，选择无细胞毒性的浓度进行NO释放抑制试验。
2.3、结果
2.3.1、细胞毒性结果
将样品稀释成不同浓度在小鼠巨噬细胞上开展细胞毒性实验，从细胞毒性检测结果看出，样品在8.87％浓度下的细胞活力为106.1％，无明显细胞毒性，因此选择8％的浓度进行下一步试验。结果详见表7、图3。
表7样品的细胞毒性检测结果
2.3.2、NO释放试验结果
将样品稀释为2倍无细胞毒性的浓度，即16％浓度，在巨噬细胞上开展NO释放实验。根据检测结果可知，NC组与PC组相比，P＜0.0001，结果呈极显著性差异，且NC组的NO相对含量≤50％，试验成立；样品组与PC组相比，P＜0.0001，结果呈极显著性差异，样品组的NO抑制率为84.84％，提示具有舒缓作用。检测结果见表8和图4。
表8NO释放试验检测结果
案例3一种具有舒缓功效原料A测试方法：
3.1、样品名称：Bio Genics SA-200。
3.2、方法：按本发明所述的方法进行样品的舒缓功效测试。首先将样品稀释成40mg/mL的初始浓度，再按
的稀释因子稀释成8个不同浓度在小鼠巨噬细胞上开展细胞毒性实验，具体浓度详见表1。根据细胞毒性结果，选择无细胞毒性的浓度进行NO释放抑制试验。
3.3、结果
3.3.1、细胞毒性结果
将样品稀释成不同浓度在小鼠巨噬细胞上开展细胞毒性实验，从细胞毒性检测结果看出，样品在1.258mg/ml浓度下的细胞活力为95.31％，无明显细胞毒性，因此选择1.258mg/ml的浓度进行下一步试验。结果详见表9、图5。
表9样品的细胞毒性检测结果
3.2、NO释放试验结果
将样品稀释为所需浓度，在巨噬细胞上开展NO释放实验。根据检测结果可知，NC组与PC组相比，P＜0.0001，结果呈极显著性差异，且NC组的NO相对含量≤50％，试验成立；样品组与PC组相比，P＜0.0001，结果呈极显著性差异，样品组的NO抑制率为63.49％，提示具有舒缓作用。检测结果见表10和图6。
表10NO释放试验检测结果
案例4
1、一种具有舒缓功效原料B测试方法：
4.1、样品名称：211025TM14。
4.2、方法：按本发明所述的方法进行样品的舒缓功效测试。首先将样品稀释成20％的初始浓度，再按
的稀释因子稀释成8个不同浓度在小鼠巨噬细胞上开展细胞毒性实验，具体浓度详见表1。根据细胞毒性结果，选择无细胞毒性的浓度进行NO释放抑制试验。
4.3、结果
4.3.1、细胞毒性结果
将样品稀释成不同浓度在小鼠巨噬细胞上开展细胞毒性实验，从细胞毒性检测结果看出，样品在0.634％浓度下的细胞活力为90.22％，无明显细胞毒性，因此选择0.6％的浓度进行下一步试验。结果详见表11、图7。
表11样品的细胞毒性检测结果
4.3.2、NO释放试验结果
将样品稀释为所需浓度，在巨噬细胞上开展NO释放实验。根据检测结果可知，NC组与PC组相比，P＜0.0001，结果呈极显著性差异，且NC组的NO相对含量≤50％，试验成立；样品组与PC组相比，P＜0.0001，结果呈极显著性差异，样品组的NO抑制率为14.60％，提示具有舒缓作用。检测结果见表12和图8。
表12NO释放试验检测结果
Claims (6)
1.一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，其特征在于，依次包括下述步骤：
1)体外培养小鼠巨噬细胞RAW264.7株，；
(2)调整小鼠巨噬细胞细胞浓度至5.0×104～2.0×105cell/mL，加入细胞培养板中，培养24-48h至细胞融合度达50％以上时用于细胞毒性检测；
(3)将(2)培养好的细胞板，弃去培养液；将样品用细胞培养基稀释50％浓度，再按
的稀释因子稀释成8个不同浓度，加入细胞板中，同时设不加样品的细胞对照组、不加细胞及样品的空白对照组，100μl/孔，培养44-48h后，显微镜下观察细胞状态，弃去培养液，洗细胞板1-2次，加入MTT溶液，继续培养2-6h，弃去培养液，加入150μl/孔的DMSO，震荡5-10min，于570nm处测定吸光值；根据吸光值测定结果，采用公式细胞活力(％)＝(T-C)/(N-C)×100％计算细胞活力；根据细胞活力结果，筛选出细胞活力在85％或以上的样品浓度，作为无明显细胞毒性的样品浓度供下一步实验；
其中T为样品组的OD值，N为细胞对照组的OD值，C为空白组的OD值；
(4)重新培养细胞，调整细胞浓度至1.0×106～3.0×106cell/mL，加入细胞培养板中，100μl/孔，培养20～24h至细胞融合度达80％以上时用于NO释放抑制测试；
(5)将(4)培养好的细胞板，弃去培养液，洗细胞板1-2次，根据(3)细胞毒性检测的结果，将样品稀释至2倍无明显细胞毒性的浓度，加入细胞板中，50μl/孔，共加样6孔，每孔补加50μl含LPS的营养液，同时设空白对照和阳性对照，其中空白对照加100μl/孔的含2％牛血清的DMEM，阳性对照用50μl/孔的无血清培养基补加50μl/孔的LPS营养液，加样完毕，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24h，培养结束后，从细胞板中每孔取50μl培养液放入新的细胞板，加入等体积的Griess试剂，充分混合后，于暗处反应10min，在540nm处检测OD值，记录结果；
(6)结果统计分析
NO相对含量(％)＝OD样品/ODPC×100％
NO抑制率(％)＝(ODPC-OD样品)/ODPC×100％
式中，OD样品指样品组的OD值均值，ODPC为阳性对照组的OD值均值；
(7)根据步骤(6)统计结果判定测试样品是否具有舒缓功效。
2.根据权利要求所述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，其特征在于，所述的小鼠巨噬细胞RAW264.7株的培养方法为：采用含10％牛血清的DMEM培养基进行细胞培养，用培养基冲洗或细胞刮的方式收集细胞，取细胞悬液计数，根据细胞数调整细胞浓度至5.0×104～2.0×105cell/mL，转入新的细胞培养瓶中，放置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24～72h。
3.根据权利要求1所述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，其特征在于，所述的细胞培养板为96孔细胞培养板。
4.根据权利要求1所述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，其特征在于，所述步骤2)至步骤4)所述的培养是将细胞板盖好，封边，置温度37℃、CO2浓度5.0％条件下培养24～48h。
5.根据权利要求1所述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，其特征在于，所述洗细胞板采用PBS溶液洗。
6.根据权利要求1所述的一种化妆品及其原料的舒缓功效测试方法，其特征在于，所述判定标准为，步骤7)所述的判定方法为：当空白对照组(NC组)的NO相对含量≤50％时，试验成立；再用GraphPad Prism软件进行统计及显著性分析，计算P值，P＜0.01表示具有显著性差异；当P＜0.01且NO抑制率≥10％时，可判定为样品具有舒缓功效；否则判定为样品无舒缓功效。
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