CN113652392B - 一种基于体外巨噬细胞与3d皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法 - Google Patents

一种基于体外巨噬细胞与3d皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，将体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养，使得化妆品原料及成品模拟皮肤真实使用情况，检测皮肤表皮层立体细胞结构到真皮层免疫细胞对应炎症指标，构建了体外化妆品立体化综合评估模型，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势。

Description

一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功 效评估方法
技术领域
本发明涉及一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法。
背景技术
抗炎舒敏类功效性护肤品的开发过程中，需要对关键功效原料或是配方成品的抗炎功效进行评估。传统化妆品原料及成品抗炎功效评价手段主要采用动物实验，如小鼠的耳肿胀实验在体内进行，要么通过体外测定培养免疫细胞的免疫反应，两种测试均不能完全代表体内的皮肤炎症环境。随着3R原则的循环经济理念推出，3R原则已经成为生物医药科学研究及相关法规管理普遍遵守的准则，开发动物试验的替代品并且避免使用活体动物试验方法。虽然体外免疫细胞试验模型系统相对简单，但是对于皮肤本身的免疫应答无法完全体现。
人体皮肤炎症的发生在皮肤表皮层及真皮层均能产生免疫应答，将与人正常皮肤相似的生理和结构的3D皮肤模型与巨噬细胞共培养，将相炎症诱导物质与3D皮肤接触，能够模拟人体皮肤接触外来炎症物质的过程，共培养的巨噬细胞用于模拟炎症通过表皮到达真皮层发生的免疫应答，炎症的发生通常伴随多种炎症因子的上调，因而通过测定共培养液中对应炎症因子的表达作为量化评估指标。目前将3D皮肤与免疫细胞共培养用于综合评估化妆品原料及成品的抗炎功效的体外方法还未见相关专利和文献报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，将体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养，使得化妆品原料及成品模拟皮肤真实使用情况，检测皮肤表皮层立体细胞结构到真皮层免疫细胞对应炎症指标，构建了体外化妆品立体化综合评估模型，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势。
实现上述目的的技术方案是：一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，包括以下步骤：
步骤S1，待测样品准备步骤：待测样品采用化妆品原料或化妆品成品；
步骤S2，巨噬细胞培养步骤：Raw264.7小鼠巨噬细胞用完全培养液于37±0.5℃、5％CO2及饱和湿度的CO2培养箱内培养，培养至小鼠巨噬细胞融合度达到70％-80％进行传代，传代时除去原培养基，加入新鲜培养基轻柔吹打，收集细胞，以1:3或1:4比例进行传代；
步骤S3，3D皮肤培养步骤：将3D表皮模型放入12孔培养板内进行稳定培养，每孔2ml维持培养基，培养条件为37±0.5℃、5％CO2及饱和湿度，稳定培养12h后形成3D皮肤待使用；
步骤S4，共培养步骤：取步骤S2中对数生长的Raw264.7小鼠巨噬细胞接种于多孔培养板培养16h～24h后，更换新鲜完全培养基，将步骤S3中生长状态稳定的3D皮肤放置于所述多孔培养板中，设置空白对照组，诱导对照组及样本组，其中，空白对照组及诱导对照组的3D皮肤表面涂抹PBS，样本组的3D皮肤表面涂抹步骤S1所准备的待测样品，培养1h～4h后，诱导对照组及样本组分别加入LPS诱导炎症，培养16h～36h，收集并储存共培养液；
步骤S5，3D皮肤活性检测步骤：采用DPBS冲洗3D皮肤表面的待测样品和PBS，采用MTT检测3D皮肤组织存活率；
步骤S6，共培养液炎症因子检测步骤：选取3D皮肤组织存活率大于等于75％的样本组的共培养液进行炎症因子检测，分别检测共培养液中炎症因子小鼠TNF-α、小鼠IL-6、小鼠IL-1β、小鼠PGE2、人L-1α、人IL-8和/或人PGE2的含量；
步骤S7，结果分析步骤：汇总步骤S6中各炎症因子含量测定结果，计算检测样本组的炎症因子泌量与诱导对照组的炎症因子分泌量比值，得到炎症因子相对表达量，应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD；各组间比较采用One-way ANOVA统计分析；所有的统计分析均为双尾；
p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，该待测样品具有一定抑制作用，评分为0.5；
p<0.01认为具有极其显著差异，用“**”表示，该待测样品具有显著抑制作用，评分为1.0；
根据上述评分标准汇总所有炎症因子的评分，由此评估待测样品的抗炎功效并进行筛选。
上述的一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，水中溶解度≥1000μg/mL的化妆品原料直接溶于PBS制成待测样品；水中溶解度＜1000μg/mL的化妆品原料用二甲基亚砜或乙醇溶剂溶解后制成待测样品；喷雾、水剂、乳液、膏霜类化妆品成品直接涂抹于3D皮肤表面；洗去类、卸妆类化妆品成品不适用于该抗炎功效评估方法。
上述的一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，使用二甲基亚砜或乙醇作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的1％，且对照样品和待测样品中溶剂的体积比例相同。
上述的一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，步骤S2中，RAW264.7小鼠巨噬细胞采用DMEM+10％FBS完全培养基培养；
步骤S3中，3D表皮模型采购配套专用培养基进行气液两相培养。
上述的一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，步骤S4中，RAW264.7小鼠巨噬细胞以(0.5-2.0)x106个细胞/mL的密度接种于6孔培养板中，每孔培养基1-2mL，于37±0.5℃，(5±1)％CO2浓度、饱和湿度条件孵育16-24h，更换新鲜完全培养基，将稳定过夜的3D皮肤放置于接种了RAW264.7小鼠巨噬细胞的6孔培养板中，样本组的3D皮肤表面涂抹待测样品20-100μL，加入LPS最终浓度为10μg/mL-30μg/mL，每种待测样品设3个或以上复孔。
上述的一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，步骤S6中，采用ELISA试剂盒检测炎症因子小鼠TNF-α、小鼠IL-6、小鼠IL-1β、小鼠PGE2、人L-1α、人IL-8和/或人PGE2的含量。
上述的一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，步骤S6中，检测共培养液中炎症因子小鼠TNF-α、小鼠IL-6、小鼠IL-1β、小鼠PGE2含量中的至少一种以及检测共培养液中炎症因子人IL-1α、人IL-8、人PGE2含量中的至少一种。
本发明的基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，将体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养，使得化妆品原料及成品模拟皮肤真实使用情况，检测皮肤表皮层立体细胞结构到真皮层免疫细胞对应炎症指标，构建了体外化妆品立体化综合评估模型，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势。
附图说明
图1为本发明的化妆品抗炎功效评估方法的流程图；
图2为3D皮肤细胞存活率MTT检测结果；
图3为小鼠TNF-α相对分泌量；
图4为小鼠IL-6相对分泌量；
图5为人IL-1α相对分泌量；
图6为人IL-8相对分泌量。
具体实施方式
为了使本技术领域的技术人员能更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对其具体实施方式进行详细地说明：
实施例中所用试剂和材料如无特殊说明均可从市场常规购得。
一、试验材料
1.实验材料及仪器
1.1细胞及3D皮肤
RAW264.7小鼠巨噬细胞来源于ATCC、中国科学院细胞库或中国典型培养物保藏中心细胞库等世界培养物保藏联合会登记成员单位。3D表皮模型来源于市售功能稳定的人重组3D表皮模型。
本实施例中，小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，SkinEthic皮肤模型购自上海斯安肤诺生物科技有限公司。
1.2主要试剂
(1)细胞培养相关试剂：DMEM培养基、胎牛血清、PBS(1x)均购自美国Gibco公司；
(2)3D皮肤培养相关试剂：SkinEthic维持培养基、SkinEthic检测培养基均购自上海斯安肤诺生物科技有限公司，DPBS购自美国Gibco公司；
(3)化学试剂：地塞米松磷酸钠、十二烷基硫酸钠(SLS)、噻唑蓝(MTT)、脂多糖(LPS)均购自美国Sigma公司；DMSO、盐酸、异丙醇均购自国药集团化学试剂有限公司；
(4)ELISA检测：小鼠TNF-αELISA试剂盒、小鼠IL-6ELISA试剂盒、人IL-1αELISA试剂盒、人IL-8ELISA试剂盒均购自杭州联科生物技术有限公司；
1.3溶液配置
(1)RAW264.7细胞DMEM完全培养基：取450mLDMEM培养基，加入50mL胎牛血清(FBS)，充分混匀后4℃保存，使用前放入37℃水浴锅中预热；
(2)噻唑蓝(MTT)溶液：称取MTT粉末100mg，加PBS20mL，涡旋振荡溶解，经0.22μm滤膜过滤除菌，-20℃避光保存，使用时4℃解冻；
(3)细胞MTT检测液：MTT溶液在DMEM中稀释至0.5mg/mL；
(4)3D皮肤MTT检测液：MTT溶液在SkinEthic检测培养基中稀释至0.3mg/mL；
(5)3D皮肤酸化异丙醇萃取液：盐酸溶于异丙醇，终浓度为0.04mol/mL。
1.4仪器
酶标仪(Thermo，美国)，CO2培养箱(Thermo，美国)，倒置显微镜(奥林巴斯，日本)，生物安全柜(Thermo，美国)，高速低温离心机(Thermo，美国)
2.待测样品
待测样品(受试物)名称及作用浓度如表1所示：
表1
二、试验过程
请参阅图1，本发明的最佳实施例，一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，包括以下步骤：
步骤S1，待测样品准备步骤：待测样品采如表1所示；水中溶解度≥1000μg/mL的化妆品原料直接溶于PBS制成待测样品；水中溶解度＜1000μg/mL的化妆品原料用二甲基亚砜或乙醇溶剂溶解后制成待测样品；喷雾、水剂、乳液、膏霜类化妆品成品直接涂抹于3D皮肤表面；洗去类、卸妆类化妆品成品不适用于该抗炎功效评估方法。使用二甲基亚砜或乙醇作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的1％，且对照样品和待测样品中溶剂的体积比例相同。
步骤S2，巨噬细胞培养步骤：Raw264.7小鼠巨噬细胞用DMEM+10％FBS完全培养基培养，于37±0.5℃、5％CO2及饱和湿度的CO2培养箱内培养，培养至小鼠巨噬细胞融合度达到70％-80％进行传代，传代时除去原培养基，加入新鲜培养基轻柔吹打，收集细胞，以1:3或1:4比例进行传代；
步骤S3，3D皮肤培养步骤：将3D表皮模型经过运输后，放入12孔培养板内进行稳定培养，每孔2ml维持培养基，培养条件为37±0.5℃、5％CO2及饱和湿度，稳定培养12h后形成3D皮肤待使用；采购配套专用培养基进行气液两相培养；
步骤S4，共培养步骤：取步骤S2中对数生长的Raw264.7小鼠巨噬细胞以(0.5-2.0)x106个细胞/mL的密度接种于6孔培养板中，每孔培养基1-2mL，于37±0.5℃，(5±1)％CO2浓度、饱和湿度条件孵育16-24h，更换新鲜完全培养基，将稳定过夜的3D皮肤放置于接种了RAW264.7小鼠巨噬细胞的6孔培养板中，设置空白对照组，诱导对照组及样本组，每组设置3个复孔，其中，空白对照组及诱导对照组的3D皮肤表面涂抹PBS，样本组的3D皮肤表面涂抹步骤S1所准备的待测样品20-100μL，培养1h～4h后，诱导对照组及样本组分别加入LPS诱导炎症，加入LPS最终浓度为10μg/mL-30μg/mL，混合均匀后于37±0.5℃，(5±1)％CO2浓度、饱和湿度条件孵育24h，收集共培养液于适当条件储存；
步骤S5，3D皮肤活性检测步骤：采用DPBS冲洗3D皮肤表面的待测样品和PBS，采用MTT检测3D皮肤组织存活率；具体包括以下工序：
(1)3D皮肤MTT检测
用DPBS缓冲液彻底冲洗以去除，3D皮肤表面的待测样品和PBS，用棉签将每个3D皮肤表面残留液体轻轻吸干，进行后续MTT检测。
在12孔板中加入0.3mg/ml的MTT工作液，将表皮模型转移至孔内，确认没有气泡。将载有MTT溶液和表皮模型的培养板放在37℃，5％CO2，饱和湿度的CO2培养箱培养3h。使用打孔器取下表皮模型样块，用镊子轻柔的将表皮模型从胶原托上分离并翻转，将表皮与胶原托一并移入2ml离心管中，加入500μl酸化异丙醇，在涡旋振荡仪上混匀，室温避光过夜或4℃放置72h，萃取甲瓒。转移200μl酸化异丙醇萃取液，至96孔板，在570nm读取OD值，每一块表皮模型在96孔板上测试两个平行。
(2)3D皮肤细胞活力分析
细胞活力计算公式如下：
细胞存活率＝[(As-Ab)/(Ac-Ab)]x100％
其中：As：实验孔，样本组对应的OD值，含有3D皮肤的培养基、MTT、待受试物)；
Ac：对照孔，诱导对照组对应的OD值，含有3D皮肤的培养基、MTT、不含受试物；
Ab：空白孔，空白对照组对应的OD值，不含3D皮肤和受试物的培养基、MTT；
根据上述公式计算受试物作用于3D皮肤的平均细胞活力，其中活力高于80％的样本组对应已收集的共培养液继续用于后续炎症因子含量检测。
请参阅图2，各待测样品的3D皮肤细胞存活率MTT检测结果，其中8号及9号成品细胞活力低于80％，说明存在皮肤刺激性，上清液不进行后续检测，其余样品均无刺激性，所收集共培养液进行后续检测。
步骤S6，共培养液炎症因子检测步骤：选取3D皮肤组织存活率大于等于75％的样本组的共培养液进行炎症因子检测，采用ELISA试剂盒检测所收集共培养液中炎症因子小鼠TNF-α、小鼠IL-6、人L-1α及人IL-8的含量，操作步骤参照试剂盒说明书。
步骤S7，结果分析步骤：汇总步骤S6中各炎症因子含量测定结果，计算检测样本组的炎症因子泌量与诱导对照组的炎症因子分泌量比值，得到炎症因子相对表达量，选择数据软件计算标准曲线，将待测样品的OD值代入标准曲线中计算目标炎症因子的含量。以诱导对照组为100％计算相对表达量，计算公式如下所示：
相对表达量＝样本组含量/诱导对照组含量
应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD；各组间比较采用One-way ANOVA统计分析；所有的统计分析均为双尾；
p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，该待测样品具有一定抑制作用，评分为0.5；
p<0.01认为具有极其显著差异，用“**”表示，该待测样品具有显著抑制作用，评分为1.0；
根据上述评分标准汇总所有炎症因子的评分，由此评估待测样品的抗炎功效并进行筛选。
所检测炎症因子小鼠TNF-α、小鼠IL-6、小鼠IL-1β、小鼠PGE2含量中的至少一种以及所检测炎症因子人IL-1α、人IL-8、人PGE2含量中的至少一种构成抗炎功效评价指标。
请参阅图3至图6，炎症因子小鼠TNF-α相对表达量如图3所示，炎症因子小鼠IL-6相对表达量如图4所示，炎症因子人IL-1α相对表达量如图5所示，炎症因子人IL-8相对表达量如图6所示，##P<0.01为LPS诱导对照组与空白对照组对比，*P<0.05,**P<0.01为样品组与LPS诱导对照组对比。
三、结果分析
所有待测样品按照本发明的化妆品抗炎功效评估方法所示流程进行评估，本实施例中检测的9个待测样品中，8号及9号待测样品因存在皮肤刺激性，不进行炎症因子后续验证；1-7号待测样品的实验显著性差异结果汇总如表2所示：
表2
评估及打分标准如表3所示：
P ns * **
评估结果 无抑制作用 具有一定抑制作用 具有显著抑制作用
分值 0 0.5 1.0
表3
1-7号待测样品的抗炎功效评估结果如表4所示：
编号 样品名称 小鼠TNF-α 小鼠IL-6 人IL-1α 人IL-8 汇总
1 活性物A 0 0.5 0 0.5 1
2 活性物B 0 1.0 0 1.0 2
3 活性物C 0.5 1.0 0.5 0.5 2.5
4 活性物D 1.0 0.5 0 0 1.5
5 喷雾一号 0.5 0.5 0 0.5 1.5
6 精华一号 0 0 0 1.0 1
7 乳液一号 0.5 0.5 0.5 0 1.5
表4
根据表4的汇总得分结果进行排序，1号至7号待测样品均具有抗炎功效，其中1-4号为化妆品原料，抗炎功效强度排序为3>2>4>1，5-7号为化妆品成品，抗炎功效强度排序为5＝7>6。
本发明的基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，通过将3D表皮模型与巨噬细胞共培养，模拟皮肤处于炎症条件下的生理状态，作为动物抗炎试验的替代方法提出，构建体外替代功效验证方法有助于更为经济高效地实现抗炎舒敏类化妆品的开发和筛选。
综上所述，本发明的基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，将体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养，使得化妆品原料及成品模拟皮肤真实使用情况，检测皮肤表皮层立体细胞结构到真皮层免疫细胞对应炎症指标，构建了体外化妆品立体化综合评估模型，属于系统型评估方法，具有快速、高效的优势。
本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。

Claims (2)

1.一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1，待测样品准备步骤：待测样品采用化妆品原料或化妆品成品；水中溶解度≥1000μg/mL的化妆品原料直接溶于PBS制成待测样品；水中溶解度＜1000μg/mL的化妆品原料用二甲基亚砜或乙醇溶剂溶解后制成待测样品；喷雾、水剂、乳液、膏霜类化妆品成品直接涂抹于3D皮肤表面；洗去类、卸妆类化妆品成品不适用于该抗炎功效评估方法；使用二甲基亚砜或乙醇作为溶剂时，溶剂的体积百分比浓度不得超过总体积的1％，且对照样品和待测样品中溶剂的体积比例相同；
步骤S2，巨噬细胞培养步骤：Raw264.7小鼠巨噬细胞用完全培养液于37±0.5℃、5％CO2及饱和湿度的CO2培养箱内培养，培养至小鼠巨噬细胞融合度达到70％-80％进行传代，传代时除去原培养基，加入新鲜培养基轻柔吹打，收集细胞，以1:3或1:4比例进行传代；RAW264.7小鼠巨噬细胞采用DMEM+10％FBS完全培养基培养；
步骤S3，3D皮肤培养步骤：将3D表皮模型放入12孔培养板内进行稳定培养，每孔2ml维持培养基，培养条件为37±0.5℃、5％CO2及饱和湿度，稳定培养12h后形成3D皮肤待使用；3D表皮模型为SkinEthic皮肤模型；3D表皮模型采购配套专用培养基进行气液两相培养；
步骤S4，共培养步骤：取步骤S2中对数生长的Raw264.7小鼠巨噬细胞接种于多孔培养板培养16h～24h后，更换新鲜完全培养基，将步骤S3中生长状态稳定的3D皮肤放置于所述多孔培养板中，设置空白对照组，诱导对照组及样本组，其中，空白对照组及诱导对照组的3D皮肤表面涂抹PBS，样本组的3D皮肤表面涂抹步骤S1所准备的待测样品，培养1h～4h后，诱导对照组及样本组分别加入LPS诱导炎症，培养16h～36h，收集并储存共培养液；
步骤S5，3D皮肤活性检测步骤：采用DPBS冲洗3D皮肤表面的待测样品和PBS，采用MTT检测3D皮肤组织存活率；
步骤S6，共培养液炎症因子检测步骤：选取3D皮肤组织存活率大于等于75％的样本组的共培养液进行炎症因子检测，采用ELISA试剂盒分别检测共培养液中炎症因子小鼠TNF-α、小鼠IL-6、小鼠IL-1β、小鼠PGE2、人L-1α、人IL-8和/或人PGE2的含量；步骤S6中，检测共培养液中炎症因子小鼠TNF-α、小鼠IL-6、小鼠IL-1β、小鼠PGE2含量中的至少一种以及检测共培养液中炎症因子人IL-1α、人IL-8、人PGE2含量中的至少一种；
步骤S7，结果分析步骤：汇总步骤S6中各炎症因子含量测定结果，计算检测样本组的炎症因子泌量与诱导对照组的炎症因子分泌量比值，得到炎症因子相对表达量，应用GraphPad Prism作图，结果表示为Mean±SD；各组间比较采用One-way ANOVA统计分析；所有的统计分析均为双尾；
p<0.05认为具有显著差异，用“*”表示，该待测样品具有一定抑制作用，评分为0.5；
p<0.01认为具有极其显著差异，用“**”表示，该待测样品具有显著抑制作用，评分为1.0；
根据上述评分标准汇总所有炎症因子的评分，由此评估待测样品的抗炎功效并进行筛选。
2.根据权利要求1所述的一种基于体外巨噬细胞与3D皮肤模型共培养的化妆品抗炎功效评估方法，其特征在于，步骤S4中，RAW264.7小鼠巨噬细胞以(0.5-2.0)x106个细胞/mL的密度接种于6孔培养板中，每孔培养基1-2mL，于37±0.5℃，(5±1)％CO2浓度、饱和湿度条件孵育16-24h，更换新鲜完全培养基，将稳定过夜的3D皮肤放置于接种了RAW264.7小鼠巨噬细胞的6孔培养板中，样本组的3D皮肤表面涂抹待测样品20-100μL，加入LPS最终浓度为10μg/mL-30μg/mL，每种待测样品设3个或以上复孔。
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