CN117126799B - 一种三维肺上皮细胞聚集体及其作为肺炎症模型的应用 - Google Patents
一种三维肺上皮细胞聚集体及其作为肺炎症模型的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117126799B CN117126799B CN202311396987.9A CN202311396987A CN117126799B CN 117126799 B CN117126799 B CN 117126799B CN 202311396987 A CN202311396987 A CN 202311396987A CN 117126799 B CN117126799 B CN 117126799B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- dimensional
- cells
- culture
- methylcellulose
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 title claims abstract description 41
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 23
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 title claims abstract description 13
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 claims abstract description 59
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 claims abstract description 59
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 31
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims abstract description 22
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 118
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims description 28
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 20
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 17
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 14
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 14
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 14
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 14
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 7
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 claims description 5
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 claims 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 abstract description 7
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 62
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 55
- 210000002236 cellular spheroid Anatomy 0.000 description 50
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 28
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 27
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 25
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 20
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 19
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 19
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 101150027068 DEGS1 gene Proteins 0.000 description 14
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 13
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 12
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 12
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 12
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 11
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 10
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 10
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 238000010201 enrichment analysis Methods 0.000 description 9
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 230000004879 molecular function Effects 0.000 description 8
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 7
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000010199 gene set enrichment analysis Methods 0.000 description 6
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 5
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 5
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 5
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 4
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 4
- 108010041520 Pulmonary Surfactant-Associated Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000000528 Pulmonary Surfactant-Associated Proteins Human genes 0.000 description 4
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 description 3
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 3
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 3
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 210000002220 organoid Anatomy 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 2
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 2
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 2
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 2
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 2
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 206010069351 acute lung injury Diseases 0.000 description 2
- 210000002821 alveolar epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 108010057085 cytokine receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 101150046266 foxo gene Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000005732 intercellular adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 201000004193 respiratory failure Diseases 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 2
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 238000012604 3D cell culture Methods 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091016585 CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000004266 Collagen Type IV Human genes 0.000 description 1
- 108010042086 Collagen Type IV Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 208000009329 Graft vs Host Disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008055 Heparan Sulfate Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 229920002971 Heparan sulfate Polymers 0.000 description 1
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010032038 Interferon Regulatory Factor-3 Proteins 0.000 description 1
- 102100029843 Interferon regulatory factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 1
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000018656 Mitogen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010052006 Mitogen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 206010035742 Pneumonitis Diseases 0.000 description 1
- 102000004022 Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000412 Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 108010007100 Pulmonary Surfactant-Associated Protein A Proteins 0.000 description 1
- 108010007131 Pulmonary Surfactant-Associated Protein B Proteins 0.000 description 1
- 108010007125 Pulmonary Surfactant-Associated Protein C Proteins 0.000 description 1
- 108010007127 Pulmonary Surfactant-Associated Protein D Proteins 0.000 description 1
- 206010037423 Pulmonary oedema Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 101150040974 Set gene Proteins 0.000 description 1
- 108090000054 Syndecan-2 Proteins 0.000 description 1
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 1
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000028956 calcium-mediated signaling Effects 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 210000001043 capillary endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000003675 cytokine receptors Human genes 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- DZGCGKFAPXFTNM-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydron;chloride Chemical compound Cl.CCO DZGCGKFAPXFTNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011223 gene expression profiling Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 208000024908 graft versus host disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000976 ink Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 210000004692 intercellular junction Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229940066294 lung surfactant Drugs 0.000 description 1
- 239000003580 lung surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000022886 mitochondrial translation Effects 0.000 description 1
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000344 non-irritating Toxicity 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000000513 principal component analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 208000037816 tissue injury Diseases 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0688—Cells from the lungs or the respiratory tract
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/90—Polysaccharides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种三维肺上皮细胞聚集体及其作为肺炎症模型的应用。三维肺上皮细胞聚集体的制备方法，包括如下步骤：用含甲基纤维素的DMEM高糖培养基培养肺上皮细胞；其中培养基中甲基纤维素的浓度为0.25%‑0.50%，培养的天数为3‑7天，肺上皮细胞和含甲基纤维素的培养基的比例为（1×104‑5.0×104）个：200μL。实验证明，采用上述方法制备的三维肺上皮细胞聚集体可以作为无支架三维肺上皮模型和脂多糖诱导的肺炎症模型，进一步研究肺部炎症反应的致病机理以及药物筛选。本发明具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种三维肺上皮细胞聚集体及其作为肺炎症模型的应用。
背景技术
肺是人体内重要的呼吸器官，肺泡是其中的核心功能单位。因肺脏独特的生理结构特点，以肺脏为主要靶器官的呼吸系统疾病严重影响着人们的身体健康，建立适合的模拟肺部疾病的研究模型和药物筛选模型尤为重要。常规二维（two-dimension，2D）细胞模型由于缺乏组织结构以及微环境的影响，无法真实反应体内生物学过程；由于各类动物模型的应用，对肺脏生理学的理解有了很大的进步，但因为人类和动物在生理机制上的差异，以及动物模型的研发成本和周期等限制，不能有效的进行高通量药物筛选研究。因此，基于人类细胞体外培养新模型的研究显得尤为重要。二维液体细胞培养是一种相对稳定、成本相对较低的培养方法，有利于高通量筛选和各种定量、定性分析。但是液体培养细胞不能反映呼吸系统的天然空气界面，影响细胞的分化和生长过程。在体内，细胞通常被细胞外基质包围或者与来自相同或不同谱系的细胞直接物理接触。与二维模型相比，三维（three-dimension，3D）模型能够更准确的反应体内的生理结构，可以提供生物系统中结构、机械和空间条件，这些因素可以指导分化和发育过程。三维培养模型可以在一定程度上弥补二维培养不足之处，能够模拟体内组织结构，再现复杂的细胞间通讯，所以近年来体外三维细胞模型也成为一个研究的热点。
3D细胞培养技术是细胞在一定的环境中形成一个三维立体结构，一般三维培养可以分为两类：支架三维培养和无支架三维培养。支架三维培养是将细胞接种在疏松多孔的细胞支撑结构中，进而形成三维结构。支架材料一般有水凝胶支架、天然支架、固体多孔支架。理想的支架材料应具备以下特点：无细胞毒性、具有良好的生物组织相容性、具有一定的孔隙、具有生物可降解性、可塑性、能促进细胞间黏附和增殖等。基质胶（Matrigel）是天然支架中的一种，来源于Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肿瘤基底膜，主要由层粘连蛋白、Ⅳ型胶原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、巢蛋白等组成，可以提供类似体内细胞外环境的结构，通过Matrigel刚度的可调性影响干细胞的分化，广泛应用于干细胞培养及类器官培养。无支架培养通常是以细胞本身的附着聚集力为基础，使细胞聚集成三维结构，一般包括旋转生物反应器和超低吸附细胞培养等方法。然而，使用无支架聚集培养物的方法仅限于创建组织样结构，在培养过程中缺乏器官样ECM而不能形成器官样结构。
甲基纤维素（methyl cellulose，MC）是一种长链取代纤维素，常温下为白色粉末，无毒、无刺激性，在水中溶胀成半透明粘性胶体溶液，其水溶液在常温下很稳定。MC因其水溶性、良好的加工性以及生物相容性等优良性能，已广泛应用于食品工业和生物医学等许多领域。MC在细胞培养中常用于造血克隆的培养，其刚性特性有助于干细胞分化。
肺脏因其独特的生理功能，与外界空气直接接触，空气中的可吸入物质对呼吸系统的健康有着重要影响。空气中的一些污染物质、致病微生物和病毒吸入肺脏中会造成肺部疾病，造成感染引起炎症反应，毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全或呼吸衰竭，这种临床综合症称为急性肺损伤，严重的急性肺损伤称为急性呼吸窘迫综合征。炎症是机体免疫应答的重要机制之一，目前建立肺炎症模型常用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）为造模剂，LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分，主要由脂质和多糖构成，可作用于多种免疫细胞、内皮细胞、上皮细胞等组织细胞，合成和释放多种细胞因子和炎性介质，最终造成组织损伤和器官功能损伤。LPS与靶细胞结合后，激活TLR4信号通路，继而激活IRF-3和NF-κB信号通路，最终引起炎症因子的释放，形成炎症反应。
发明内容
本发明的目的为构建稳定、经济、简便的无支架三维肺上皮模型。
本发明首先保护一种三维肺上皮细胞聚集体的制备方法，可包括如下步骤：用含甲基纤维素的培养基培养肺上皮细胞。
上述制备方法中，所述培养基中甲基纤维素的浓度可为0.25%-0.50%（如0.25%-0.35%、0.35%-0.45%、0.45%-0.50%、0.25%、0.35%、0.45%或0.50%）。
上述制备方法中，所述培养基中甲基纤维素的浓度优选为0.25%。
上述制备方法中，所述培养基可为DMEM高糖培养基或RPMI1640培养基。
上述制备方法中，所述培养基还可含有血清和/或抗生素。
所述培养基中，血清的浓度可为8-12%（如8-10%、10-12%、8%、10%或12%）。血清可为胎牛血清（FBS）。
上述制备方法中，所述抗生素可为青霉素和/或链霉素。
所述培养基中，青霉素的浓度可为0.8-1.2%（如0.8-1.0%、1.0-1.2%、0.8%、1.0%或1.2%）。
所述培养基中，链霉素的浓度可为0.8-1.2%（如0.8-1.0%、1.0-1.2%、0.8%、1.0%或1.2%）。
上述制备方法中，所述培养基具体可为含0.5%甲基纤维素、10%、1%青霉素和1%链霉素的DMEM高糖培养基或含0.25%甲基纤维素、10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的DMEM高糖培养基。
上述制备方法中，所述肺上皮细胞可为人肺腺癌细胞系A549。
上述制备方法中，培养肺上皮细胞的培养体系中，肺上皮细胞和所述含甲基纤维素的培养基的比例可为（1×104-5.0×104）个：200μL（如（1×104-2.5×104）个：200μL、（2.5×104-5.0×104）个：200μL、1×104个：200μL、2.5×104个：200μL或5.0×104个：200μL）。
上述制备方法中，培养肺上皮细胞的培养体系中，肺上皮细胞和所述含甲基纤维素的培养基的比例优选为5.0×104个：200μL。
上述制备方法中，所述培养的天数可为3-7天（如3天、4天、5天、6天或7天）。
上述制备方法中，所述培养的条件具体可为37℃、5% CO2。
上述任一所述制备方法制备的三维肺上皮细胞聚集体也属于本发明的保护范围。
本发明还保护采用上述任一所述制备方法制备的三维肺上皮细胞聚集体的应用，可为A1）或A2）或A3）：
A1）作为肺炎症模型；
A2）筛选用于预防或治疗肺部炎症的药物；
A3）作为无支架三维肺上皮模型。
上述应用中，所述肺炎症模型可为细菌脂多糖LPS诱导的肺炎症模型。
本发明的发明人经过大量实验，成功建立了A549多细胞球体（即三维肺上皮细胞聚集体或三维肺上皮多细胞球体），其为以A549细胞为基础（5×104/孔细胞浓度）、甲基纤维素作为培养基添加剂（0.25%甲基纤维素浓度）构建的无支架三维模型。对构建的A549多细胞球体进行转录组测序，以探究整体基因表达谱的变化。结果表明，A549多细胞球体中与炎症相关通路均上升，与细胞分裂、染色体复制相关通路均下降。此外，还发现A549多细胞球体在LPS刺激后炎性因子基因表达显著增强，即A549多细胞球体对LPS刺激的免疫应答更为明显。由此可见，本申请建立的A549多细胞球体可以作为脂多糖诱导的肺炎症模型，进一步研究肺部炎症反应的致病机理以及药物筛选。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为添加0.5%甲基纤维素时A549细胞形成的多细胞球体。
图2为添加0.25%甲基纤维时A549细胞形成的多细胞球体。
图3为0.5%甲基纤维素条件下A549多细胞球体的细胞存活率。
图4为0.25%甲基纤维素条件下A549多细胞球体的细胞存活率。
图5为实时定量PCR分析A549多细胞球体肺表面活性蛋白在基因水平的表达水平。
图6为添加细胞外基质形成的A549多细胞球体形态及细胞存活率。A为添加300μg/mL Matrigel形成的A549多细胞球体形态；B为添加300μg/mL细胞外基质形成的A549多细胞球体细胞存活率。
图7为添加细胞外基质形成A549多细胞球体肺表面活性蛋白在基因水平的表达水平。
图8为group1组与对照组差异基因的GO分析柱状图。
图9为group1组与对照组差异基因的GO分析柱状图。
图10为group2组与对照组差异基因的GO分析柱状图。
图11为group2组与对照组差异基因的GO分析柱状图。
图12为 group1组与group2组差异基因的GO分析柱状图。
图13为 group1组与group2组差异基因的GO分析柱状图。
图14为group1组与对照组差异基因的KEGG富集分析气泡图。
图15为group2组与对照组差异基因的KEGG富集分析气泡图。
图16为group1组与group2组差异基因的KEGG富集分析气泡图。
图17为group1组与对照组差异基因的基因集富集分析。
图18为group2组与对照组差异基因的基因集富集分析。
图19为group1组与group2组差异基因的基因集富集分析。
图20为LPS刺激三维模型后炎症因子表达量。2D A549表示二维培养的A549细胞，MC A549表示0.25%甲基纤维素条件下形成的A549多细胞球体，ECM A549表示基于ECM三维培养的A549多细胞球体。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中涉及的英文缩写，其英文名称和中文名称见表1。
下述实施例中涉及的实验试剂名称及其生产厂家见表2。
下述实施例中的二维培养的A549细胞记载于如下文献中：A J Carterson，K Höner zu Bentrup，C M Ott，M S Clarke，D L Pierson，C R Vanderburg，K L Buchanan，C ANickerson，M J Schurr. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensionalaggregates:alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosapathogenesis. Infect Immun. 2005 Feb；73(2)：1129-40. doi:10.1128/IAI.73.2.1129-1140.2005；Fatima Saleh，Aya Harb，Nadia Soudani，Hassan Zaraket. Athree-dimensional A549 cell culture model to study respiratory syncytialvirus infections. J Infect Public Health. 2020 Aug；13(8):1142-1147. doi:10.1016/j.jiph.2020.03. 011.
实施例1、三维肺上皮多细胞球体的建立
体外细胞培养模型，因其从体内固有的三维组织分离后在二维培养表面以单层细胞形式增殖，会发生分化并丧失特定功能。因此三维培养进入人们的视野，其中肺类器官是将多能干细胞或肺上皮干/组细胞在Matrigel中进行三维培养，在体外诱导分化形成模拟气管和肺泡的结构，但类器官也有许多局限性，如成本过高、半固体基质胶影响药物渗透浓度、细胞来源受限以及诱导时间较长等。因此，构建稳定、经济、简便的无支架三维肺上皮模型具有重要的应用价值。
一、实验细胞及其培养
实验细胞：人肺腺癌细胞系A549（以下简称A549细胞）；其为肺泡上皮细胞。
A549细胞在37℃、5% CO2恒温细胞培养箱中培养，使用的培养基为含有100U/mL青霉素、1mg/mL链霉素和10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养基。A549细胞均单层贴壁生长。
二、实验方法
1、A549细胞复苏、培养、传代及冻存
（1）A549细胞复苏
（1-1）在A549细胞复苏前，先将超净工作台紫外照射灭菌30分钟，在离心管中加入培养基。
（1-2）用镊子小心将装有A549细胞的冻存管从液氮罐中取出后迅速转移至42℃恒温水浴锅中，划圈晃动冻存管，使其快速融化。之后将冻存管转移至超净工作台中，用干棉球擦拭冻存管表面残留水渍，使用移液器将溶液转移至完成步骤（1-1）的离心管中，吹打混匀，1200 r/min离心5min，弃上清液。
（1-3）向完成步骤（1-2）的离心管中加入1mL 培养基，轻轻吹打混匀A549细胞，得到重悬细胞。根据冻存细胞量和冻存的时间选择接种密度，将重悬细胞接种到装有培养基的培养瓶中，十字交叉法摇匀细胞，37℃、5% CO2培养。
（2）A549细胞培养
A549细胞接种至装有培养基的培养瓶或培养皿中，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，每2-3天更换新鲜培养基，待细胞密度达到80%-90%时，进行细胞传代。
（3）A549细胞传代
当A549细胞密度达到80%-90%时，弃上层培养基，加入PBS缓冲液洗涤细胞，再弃PBS缓冲液；之后加入0.25%胰酶，37℃消化1-2min，当显微镜下观察到细胞变圆且部分细胞脱离后，加入2-3倍胰酶体积的培养基终止消化。使用移液器轻柔吹打未脱落细胞，将细胞悬液转移至离心管，1200r/min离心5min，弃上清液，加入1mL培养基混匀细胞为单细胞悬液，按照1：3的比例接种至培养瓶中，置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
（4）A549细胞冻存
对处于对数生长期的A549细胞，可以冻存细胞保存。冻存液按照培养基：FBS：DMSO=6：3：1的比例（体积比）配置。使用0.25%胰酶消化细胞并进行细胞计数，冻存细胞数量为5×106—1×107个/管，将冻存液转移至冻存管中，放入细胞冻存盒中，-80℃保存24h，然后转移至液氮中长期保存。
2、细胞计数
（1）将消化离心的A549细胞用1mL培养基重悬，轻轻吹打混匀，得到细胞悬液。
（2）将10μL细胞悬液转移至EP管，再加入10μL AO/PI染液，与细胞悬液混合均匀，将混合液转移至细胞计数板，在细胞计数仪中检测细胞浓度以及存活率（绿色荧光为活细胞，红色荧光为死细胞）。
3、甲基纤维素溶液的获得
（1）2×DMEM高糖培养基的制备
向500mL水中加入13.5g DMEM高糖培养基粉末，调节pH至7.2后，再加入碳酸氢钠并使其在体系中的浓度为3.7g/L，之后用0.22µm滤器过滤，最后加入青霉素和链霉素并使其在体系中的浓度依次为100U/mL和1mg/mL，得到2×DMEM高糖培养基。
（2）将2g甲基纤维素粉末放入100mL沸水，彻底溶解后，37℃振荡培养4-5h，得到溶液；先将溶液置于4℃过夜，然后121℃高压蒸汽灭菌15min，待冷却至不烫手时，加入100mL2×DMEM高糖培养基，剧烈摇晃直至摇匀后置于-20℃；反复冻融剧烈摇晃4-5次，直至液体呈均一状，即获得甲基纤维素溶液。
4、三维肺上皮多细胞球体的培养方法
（1）培养基的获得
甲基纤维素培养基为“含1%甲基纤维素、10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的培养基”、“含0.5%甲基纤维素、10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的培养基”或“含0.25%甲基纤维素、10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的培养基”。
细胞外基质培养基为含300μg/mL Matrigel、0.024%甲基纤维素、10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的培养基。
（2）分别将A549细胞消化离心，重悬后进行细胞计数；之后按照每孔1×104个、2.5×104个、5×104个的数量加入甲基纤维素培养基或细胞外基质培养基（每孔200μL），用移液器轻轻吹打混匀细胞悬液，使用移液器将细胞悬液转移至U型96孔板中。
（3）将96孔板放入预冷的台式离心机，8℃、200g离心4min，之后置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
5、实时荧光定量PCR
收取步骤4培养第3、5或7天的三维肺上皮多细胞球体，先提取RNA，再反转录为cDNA进行qPCR检测。用于检测SP-A基因、SP-B基因、SP-C基因、SP-D基因、Laminin基因和E-cadherin基因的上游引物和下游引物见表3。
6、流式细胞术检测多细胞球体细胞存活率
（1）收集步骤4培养的第3、5或7天的三维肺上皮多细胞球体，离心后加入PBS缓冲液清洗一遍，弃上清；之后加入0.25%胰酶消化液，37℃消化3-5min，期间用移液器吹打球体使其消化为单细胞后，加入2-3倍体积的培养基终止消化，1500r/min离心5 min。
（2）弃上清，加入PBS缓冲液清洗1次，将细胞用100μL PBS缓冲液重悬于EP管中，加入0.1μL FVS510，4℃避光孵育30min，加入1mL PBS缓冲液清洗2次。
（3）用300μL PBS缓冲液重悬细胞沉淀，细胞悬液用100μm筛网过滤后，转移至平底96孔板内待检。
（4）流式检测数据结果使用软件Flowjo V10进行分析。
7、苏木素-伊红染色
（1）冰冻切片室温平衡30min后，多聚甲醛固定切片10min，蒸馏水洗涤3-5次。
（2）先滴加苏木素染核5min，然后用蒸馏水洗涤3-5次，再后置入盐酸乙醇中分化2s，看到有粉色液滴滴下，用蒸馏水洗涤3-5次。
（3）置于1%氨水中返蓝处理1min，用蒸馏水洗涤3-5次，伊红染液染细胞质2min，用蒸馏水洗涤3-5次。
（4）取出染好的玻片，室温自然风干后，在切片上滴加1-2滴中性树脂，用盖玻片从一侧盖在载玻片上，轻轻放下直至全部覆盖，室温晾干玻片。
8、统计学分析
使用GraphPad Prism 8.0.2 软件处理数据，实验数据以`x ±SD表示，各组定量数据间比较采用t检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。
三、实验结果
1、基于甲基纤维素的A549多细胞球体培养体系的建立
本申请的发明人评估了三个常用的甲基纤维素浓度来建立多细胞球体三维模型，浓度分别为0.25%、0.5%和1%；选择三种细胞数量，分别为1×104/孔、2.5×104/孔和5×104/孔。
结果如下：
（1）1%甲基纤维素浓度太大，无论哪种细胞数量，细胞均不能在底部聚集成团，弥散在培养基中，后续实验不再使用此浓度；0.5%和0.25%的甲基纤维浓度在96孔板中可以形成多细胞球体，细胞数量越多，细胞球体越大，且细胞球体体积随着培养越来越小，提示随着培养时间的推移，细胞间连接更加紧密（见图1和图2）。
（2）分别在第3、5、7天收取多细胞球体，胰酶消化为单细胞后，用检测细胞死/活的染料FVS510标记，流式细胞术检测其细胞存活率。0.5%甲基纤维素条件下细胞存活率如图3所示，第3天细胞存活率在90%以上，第5天存活率为80%-85%，第7天存活率在40%以上。0.25%甲基纤维素条件下细胞存活率如图4所示，第3天存活率90%以上，第5天存活率85%以上，第7天存活率在50%以上。因此，后续实验选用0.25%甲基纤维素浓度的培养基。
（3）收取培养的第1、3、5、7天的A549多细胞球体和二维培养的A549细胞并提取细胞总RNA，反转录为cDNA后，通过qPCR检测肺表面活性蛋白SPA、SPB、SPD在mRNA水平的表达水平。
检测结果见图5（Ctrl表示二维培养的A549细胞）。结果表明，无论细胞数量多少，与二维培养的A549细胞相比，经过甲基纤维素三维培养后的A549多细胞球体的SPA、SPB、SPD基因表达均上调，其中SPA、SPD在5×104每孔的细胞数量中上调最明显，后续实验选用5×104个每孔的细胞数量。
2、基于细胞外基质的A549多细胞球体培养体系的建立
（1）本申请的发明人在培养体系中加入300μg/mL Matrigel和0.024%甲基纤维素，每个孔中加入5×104个细胞，形成的三维结构如图6中A所示。结果显示，添加ECM多细胞球体同样可以形成三维多细胞球体结构，且透光度增加，形成了空腔囊泡状结构。
（2）分别收取培养第3、5、7天的多细胞球体，将球体消化为单细胞后，流式细胞术检测细胞存活率如图6中B所示。结果显示，第3天细胞存活率在90%以上，第5天存活率在80%以上，第7天存活率在60%以上。
（3）收取培养第3、5、7天的多细胞球体和二维培养的A549细胞提取RNA，反转录为cDNA，qPCR检测肺表面活性蛋白SPA、SPB、SPD在基因水平上的表达。
检测结果见图7（Ctrl为二维培养的A549细胞）。结果表明，SPA、SPB在后期表达明显上调，SPD表达上调后又下降。
上述结果表明，基于甲基纤维素建立了A549多细胞球体（即基于甲基纤维素三维培养的A549多细胞球体），通过流式细胞术检测细胞存活率以及qPCR检测肺表面活性蛋白在基因水平的表达情况确定了培养体系为0.25%甲基纤维素和5×104每孔的细胞数量。在三维体系中添加300μg/mL Matrigel，形成的多细胞球体（即基于ECM三维培养的A549多球体）透光度较高，形成了空腔状结构，与哺乳动物肺部相似。
实施例2、A549多细胞球体基因表达谱分析
三维培养给细胞提供了类似体内的结构微环境，影响细胞迁移、细胞间黏附、增殖和基因表达等功能。本申请的发明人通过RNA测序技术比较基于甲基纤维素三维培养的A549多细胞球体、基于ECM三维培养的A549多球体和二维培养的A549细胞之间的基因表达谱。将差异基因进一步进行GO功能富集、KEGG通路富集分析和GSEA分析，探究不同的培养体系中，对哪些信号通路影响最大。
一、实验细胞
人肺腺癌细胞系A549来自于实验室细胞库，冻存于液氮罐中，常规培养在37℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中。使用含有10% FBS的DMEM高糖培养液培养，细胞呈单层贴壁生长。
二、实验方法
1、测序样品准备
共准备三个组，具体如下：
MCA 549组：将A549细胞消化离心，重悬后进行细胞计数；之后按照每孔5×104个的数量加入含0.25%甲基纤维素、10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的培养基（每孔200μL），用移液器轻轻吹打混匀细胞悬液，使用移液器将细胞悬液转移至U型96孔板中；将96孔板放入预冷的台式离心机，8℃、200g离心4min，之后置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养3天，收取多细胞球体至50 mL离心管中，用PBS缓冲液清洗2次后，转移至EP管中，放入液氮速冻10s，转移至-80℃，送至上海欧易生物医学科技有限公司进行RNA测序和分析。
ECM A549组：将A549细胞消化离心，重悬后进行细胞计数；之后按照每孔5×104个的数量加入含300μg/mL Matrigel、0.024%甲基纤维素、10%FBS、1%青霉素和1%链霉素的培养基（每孔200μL），用移液器轻轻吹打混匀细胞悬液，使用移液器将细胞悬液转移至U型96孔板中；将96孔板放入预冷的台式离心机，8℃、200g离心4min，之后置于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养3天，收取多细胞球体至50 mL离心管中，用PBS缓冲液清洗2次后，转移至EP管中，放入液氮速冻10s，转移至-80℃，送至上海欧易生物医学科技有限公司进行RNA测序和分析。
2D A549组：将二维培养的A549细胞移至50 mL离心管中，用PBS缓冲液清洗2次后，转移至EP管中，放入液氮速冻10s，转移至-80℃，送至上海欧易生物医学科技有限公司进行RNA测序和分析。
每组进行三个生物学重复。
2、RNA提取与文库构建
（1）提取总RNA，使用Agilent 2100 Bioanalyzer 评估RNA完整性。
（2）使用VAHTS Universal V6 RNA-seq Library Prep试剂盒构建转录组文库。
3、差异表达基因分析以及功能分析
（1）使用fastp软件对所得到的raw reads进行处理，去除低质量reads后获得clean reads，用于后续数据分析。
（2）使用HISAT2软件进行参考基因组比对，进行基因表达量（FPKM）计算，通过HTSeq-count得到每个基因的reads数（counts）。
（3）使用R（v3.2.0）对counts进行主成分分析，评估样本生物学重复。
（4）使用DESeq2软件进行差异表达基因分析，符合q-value<0.05且Fold Change>2的基因被定义为差异表达基因。使用Hiplot在线软件绘制差异表达基因火山图。
（5）基于超几何算法对差异表达基因进行GO（gene ontology，基因本体）、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因与基因组百科全书）通路富集分析，筛选显著富集功能条目，使用R（v3.2.0）对显著富集功能条目绘制柱状图和气泡图。
（6）使用GSEA（gene-set enrichment analysis，基因集富集分析）软件进行基因富集分析，使用以KEGG通路基因集为分类标准，将基因按照在两类样本中的差异表达程度排序，然后检验预先设定的基因集是否在这个排序表的顶端或者底端富集。
4、诱导炎症刺激模型
向多细胞球体或二维培养的A549细胞中加入含有10μg/mL LPS的培养基，每孔200μL。孵育24h后，收取多细胞球体或二维培养的A549细胞，提取总RNA，反转录为cDNA，qPCR检测基因的相对表达水平。用于检测IL-1β基因、IL-6基因、IL-8基因、TNF-α基因和GAPDH基因的上游引物和下游引物见表4。
5、统计学分析
使用 GraphPad Prism 8.0.2 软件处理数据，实验数据以x ±SD表示，各组定量数据间比较采用t检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。
三、实验结果
1、GO功能富集分析结果
为了进一步探究三个组在生物学功能的差异，对DEGs进行GO功能富集分析。柱状图展示生物过程（Biological Process，BP）、细胞组成（Cellular Component，CC）和分子功能（Molecular Function，MF）。
三个组分别在DEGs中上调基因和下调基因中富集最显著的前10项，结果如图8、图9、图10、图11、图12和图13所示（纵坐标表示GO条目，横坐标为富集的显著性水平，数值越高表明富集越显著，2D A549组用control表示，MC A549组用group1表示，ECM A549组用group2表示）。相对于control组而言，group 1中上调DEGs主要富集在细胞因子介导的信号转导途径、炎症反应、细胞外基质、基因表达相关的生物过程，在细胞组成中与细胞外区域相关富集的基因较多，在分子功能中与DNA转录、细胞因子结合受体活性、酶活性相关富集的基因较多；在下调DEGs中，在生物过程中与细胞分裂、DNA复制、线粒体翻译相关富集的基因较多，在细胞组成中与线粒体相关富集的基因较多，在分子功能中与RNA结合、ATP结合、DNA复制源结合相关富集的基因较多。相对于control组而言，在group 2中上调的DEGs中，在生物过程中与细胞因子介导的信号转导途径、炎症反应、对缺氧的反应相关富集的基因较多，在细胞组成中与细胞外区域、高尔基体相关富集的基因较多，在分子功能中与DNA转录、信号受体结合相关富集的基因较多；在下调DEGs中，在生物过程中与细胞分裂、DNA复制相关富集的基因较多，在细胞组成中与线粒体、染色体相关富集的基因较多，在分子功能中与ATP结合、蛋白质结合、RNA结合相关富集的基因较多。相对于group2而言，group1在上调DEGs中，在生物过程中与信号转导途径、炎症反应、磷酸化的反应相关富集的基因较多，在细胞组成中与细胞外区域相关富集的基因较多，在分子功能中与跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、生长因子结合相关富集的基因较多；在下调DEGs中，在生物过程中与有丝分裂分裂、DNA复制相关富集的基因较多，在细胞组成中染色体、纺锤体相关富集的基因较多，在分子功能中与微管结合、微管运动和ATP结合相关富集的基因较多。
综上所述，对于二维培养的A549细胞来说，三维多细胞球体（如基于甲基纤维素三维培养的A549多细胞球体或基于ECM三维培养的A549多球体）上调DEGs中主要在炎症反应、信号转导途径和细胞外基质相关生物过程富集，下调DEGs中主要在DNA复制和细胞分裂相关生物过程富集。
2、KEGG信号通路分析
本申请的发明人还分别对DEGs的KEGG信号通路进行富集分析，结果显示富集程度最高的前20项。
结果如图14、图15和图16所示（2D A549组用control表示，MC A549组用group1表示，ECM A549组用group2表示）。相对于control组而言，group 1组在p53、细胞衰老、TNF、FoxO、MAPK等信号通路中显著富集。相对于control组而言，group 2组在细胞周期、p53、细胞衰老、TNF、FoxO、MAPK、IL-17等信号通路显著富集。相对group2组而言，group1组在p53、MAPK、钙信号通路、P13K-Akt、Ras、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用等信号通路显著富集。综上所述，对于二维培养的A549细胞来说，三维多细胞球体（基于甲基纤维素（MC）三维培养的A549多细胞球体和基于细胞外基质（ECM）三维培养的A549多球体）DEGs主要富集在炎症相关通路和细胞分裂相关通路。
3、基因集富集分析（GSEA）
使用GSEA方法对三组样本中所有基因集以KEGG基因集为分类标准进行分析。
结果如图17、图18和图19所示（2D A549组用control表示，MC A549组用group1表示，ECM A549组用group2表示）。相对于control组而言，group1组中与炎症相关通路显著上调，例如TNF信号通路、IL-17信号通路和NF-kappa B信号通路；与细胞周期、DNA复制等基因通路显著下调。相对于control组而言，group 2组中与炎症相关通路显著上调，例如TNF信号通路、C型凝集素受体信号通路和移植抗宿主疾病基因通路；与细胞周期、DNA复制等基因通路显著下调。相对于group2组而言，group1组与炎症相关通路显著上调，例如TNF信号通路、IL-17信号通路和Toll样受体信号通路；与细胞周期、DNA复制等基因通路显著下调。
综上所述，两种三维培养细胞模型（即基于甲基纤维素三维培养的A549多细胞球体和基于ECM三维培养的A549多球体）中上调基因主要富集在炎症相关通路，细胞周期相关通路下调，推测在三维模型中炎症相关通路被激活，可能对炎症刺激响应更加敏感，但是细胞分裂生长受到抑制。相对于group2组而言，group1组炎症相关基因富集上调，细胞周期相关基因下调，这也与之前检测细胞存活率的结果符合，基于ECM形成的A549多细胞球体比基于甲基纤维素形成的A549多细胞球体存活率较高。同时提示三维培养模型炎症相关通路被激活，可能对炎症刺激响应更加敏感。
4、LPS诱导三维模型炎症应答
基于转录组学的分析结果，发现在三维多细胞球体（如基于甲基纤维素三维培养的A549多细胞球体、基于ECM三维培养的A549多球体）中，炎症反应相关通路被激活，因此推测对于炎症刺激反应会更加敏感，所以使用LPS分别刺激基于甲基纤维素三维培养的A549多细胞球体、基于ECM三维培养的A549多球体和二维培养的A549细胞，检测炎症因子的基因表达量。
检测结果见图20。LPS刺激24h后，四种炎性因子在甲基纤维素中形成的A549多细胞球体中的表达量均显著上调；在ECM中形成的A549多细胞球体中IL-6、IL-8的表达量下调；而在二维培养的A549细胞中，四种炎性因子表达量均无明显变化。
通过对构建的两种三维多细胞球体进行转录组测序，结果显示与二维培养的A549细胞相比，两种A549多细胞球体（基于甲基纤维素三维培养的A549多细胞球体和基于ECM三维培养的A549多球体）的差异表达基因较少，表明两者差异较小。DEGs分析显示，相对于二维培养组（即二维培养的A549细胞）来说，基于甲基纤维素三维培养的A549多细胞球体和基于ECM三维培养的A549多球体中上调DEGs均主要富集在与炎症反应相关功能上，下调DEGs均主要富集在与细胞分裂、DNA复制相关功能上，表明两种A549多细胞球体的炎症相关通路被激活，但细胞增殖、DNA复制等生物学过程受到抑制。使用LPS刺激评估多细胞球体对于炎症的应答情况，检测到基于甲基纤维素形成的三维培养多细胞球体对LPS刺激的应答更为明显。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (1)
1.三维肺上皮细胞聚集体的应用，为A1）或A2）：
A1）作为细菌脂多糖LPS诱导的肺炎症模型；
A2）筛选用于预防或治疗细菌脂多糖LPS诱导的肺炎症的药物；
所述三维肺上皮细胞聚集体的制备方法包括如下步骤：向培养基中加入人肺腺癌细胞系A549，37℃、5% CO2培养3-7天；其中，人肺腺癌细胞系A549和培养基的比例为（1×104-5.0×104）个：200μL；
所述培养基的溶质及其浓度为0.25%-0.50%甲基纤维素、8-12%胎牛血清、0.8-1.2%青霉素和0.8-1.2%链霉素，溶剂为DMEM高糖培养基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311396987.9A CN117126799B (zh) | 2023-10-26 | 2023-10-26 | 一种三维肺上皮细胞聚集体及其作为肺炎症模型的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311396987.9A CN117126799B (zh) | 2023-10-26 | 2023-10-26 | 一种三维肺上皮细胞聚集体及其作为肺炎症模型的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117126799A CN117126799A (zh) | 2023-11-28 |
| CN117126799B true CN117126799B (zh) | 2024-01-26 |
Family
ID=88858608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311396987.9A Active CN117126799B (zh) | 2023-10-26 | 2023-10-26 | 一种三维肺上皮细胞聚集体及其作为肺炎症模型的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117126799B (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2688789A1 (en) * | 2008-12-22 | 2010-06-22 | Spherotec Gmbh | Methods for the preparation of fibroblasts |
| CN104640974A (zh) * | 2012-07-24 | 2015-05-20 | 日产化学工业株式会社 | 培养基组合物以及使用所述组合物培养细胞或组织的方法 |
| CN106854639A (zh) * | 2015-12-08 | 2017-06-16 | 中国药科大学 | 一种基于三维半固体的成体干细胞培养方法 |
| CN107532143A (zh) * | 2015-04-16 | 2018-01-02 | 日产化学工业株式会社 | 培养基添加物及培养基组合物以及使用了它们的细胞或组织的培养方法 |
| CN108060132A (zh) * | 2016-11-09 | 2018-05-22 | 复旦大学 | 一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3d共培养模型 |
| CN110564671A (zh) * | 2019-09-10 | 2019-12-13 | 吴宏伟 | 一种3d组织工程细胞环的制备方法 |
| WO2021205157A1 (en) * | 2020-04-07 | 2021-10-14 | University Of Hertfordshire Higher Education Corporation | Method and apparatus for three dimensional alveolar lung model |
| CN116478925A (zh) * | 2023-03-08 | 2023-07-25 | 江苏凯基生物技术股份有限公司 | 一种体外快速制备肿瘤细胞球的方法 |
-
2023
- 2023-10-26 CN CN202311396987.9A patent/CN117126799B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2688789A1 (en) * | 2008-12-22 | 2010-06-22 | Spherotec Gmbh | Methods for the preparation of fibroblasts |
| CN104640974A (zh) * | 2012-07-24 | 2015-05-20 | 日产化学工业株式会社 | 培养基组合物以及使用所述组合物培养细胞或组织的方法 |
| CN107532143A (zh) * | 2015-04-16 | 2018-01-02 | 日产化学工业株式会社 | 培养基添加物及培养基组合物以及使用了它们的细胞或组织的培养方法 |
| CN106854639A (zh) * | 2015-12-08 | 2017-06-16 | 中国药科大学 | 一种基于三维半固体的成体干细胞培养方法 |
| CN108060132A (zh) * | 2016-11-09 | 2018-05-22 | 复旦大学 | 一种基于肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞的3d共培养模型 |
| CN110564671A (zh) * | 2019-09-10 | 2019-12-13 | 吴宏伟 | 一种3d组织工程细胞环的制备方法 |
| WO2021205157A1 (en) * | 2020-04-07 | 2021-10-14 | University Of Hertfordshire Higher Education Corporation | Method and apparatus for three dimensional alveolar lung model |
| CN116478925A (zh) * | 2023-03-08 | 2023-07-25 | 江苏凯基生物技术股份有限公司 | 一种体外快速制备肿瘤细胞球的方法 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| A three-dimensional A549 cell culture model to study respiratory syncytial virus infections;Fatima Saleh等;Journal of Infection and Public Health;第13卷(第8期);第1143页左栏第5-6段 * |
| Fatima Saleh等.A three-dimensional A549 cell culture model to study respiratory syncytial virus infections.Journal of Infection and Public Health.2020,第13卷(第8期),第1143页左栏第5-6段. * |
| Rapid and Stable Formation Method of Human Astrocyte Spheroid in a High Viscous Methylcellulose Medium and Its Functional Advantages;Fumiya Tao等;Bioengineering;第10卷(第3期);标题、摘要、结论 * |
| 小细胞肺癌细胞系H446肿瘤细胞球培养方法的优化;王正岩等;天津医药;第39卷(第01期);全文 * |
| 张星等.FAK的活化促进悬浮肺肿瘤细胞的积聚、凋亡抑制与增殖.中山大学学报(医学科学版).2004,第25卷(第03期),全文. * |
| 肿瘤3D细胞模型在体外药敏实验中的应用;刘艳红等;实验室研究与探索;第38卷(第03期);第150页右栏第4段 * |
| 腺病毒55型在A549细胞中的增殖动力学特征;张绮玲等;生物技术通讯;第27卷(第01期);全文 * |
| 高转移肺癌细胞株的建立及其肿瘤干细胞生物学特性;遇珑等;肿瘤防治研究;第44卷(第02期);全文 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117126799A (zh) | 2023-11-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112121063B (zh) | 外泌体在制备治疗肺纤维化的药物中的应用 | |
| CN101591638A (zh) | 大菱鲆肾细胞系的构建方法 | |
| CN117126799B (zh) | 一种三维肺上皮细胞聚集体及其作为肺炎症模型的应用 | |
| Song et al. | N-acetylcysteine promotes the proliferation of porcine adipose-derived stem cells during in vitro long-term expansion for cultured meat production | |
| WO2013155114A1 (en) | Scaffold and method for proliferation and enrichment of cancer stem cells | |
| CN113908127A (zh) | 一种用于治疗由幽门螺杆菌引起的疾病的囊泡 | |
| Park et al. | Hyaluronic acid microparticles for effective spheroid culture and transplantation in liver tissue | |
| CN106267413A (zh) | 艾滋病血浆净化器 | |
| Wang et al. | Vimentin-Rab7a pathway mediates the migration of MSCs and lead to therapeutic effects on ARDS | |
| CN110452880B (zh) | 急性肺损伤细胞模型的制备方法及其应用 | |
| CN106039448B (zh) | Aids细胞吸附治疗仪 | |
| CN114317442A (zh) | 一种建立乳腺类器官或/和乳腺癌类器官的培养基及方法和应用 | |
| CN113599412A (zh) | 党参黄芪组合物在制备预防和治疗晚期肿瘤相关症状的药物中的用途 | |
| CN113652398A (zh) | 增强间充质干细胞外泌体黏膜修复功效的方法及复合物 | |
| Hirai et al. | Increased glucocorticoid receptor concentration in macrophage differentiation of myeloid leukemia cells with 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate | |
| CN115814088B (zh) | 甲基转移酶样蛋白4的制药用途 | |
| Leiberova et al. | Development of a method for cultivation of mast cells to create an experimental model | |
| Li et al. | Therapeutic effect of human umbilical cord mesenchymal stem cells and their conditioned medium on LPS-induced endometritis in mice | |
| Liu et al. | Radiotherapy Resistance of 3D Bioprinted Glioma via ITGA2/P‐AKT Signaling Pathway | |
| CN109528771B (zh) | 一种宫内膜干细胞来源的外泌体在治疗急性肺损伤药物中的应用 | |
| CN108324946B (zh) | miRNA708、和/或301簇的微小RNA在改善心脏功能方面的应用 | |
| CN106267415A (zh) | 艾滋病净化治疗仪 | |
| CN108048394B (zh) | 一种两步法建立间充质干细胞软骨分化后骨关节炎样细胞模型的方法 | |
| Ji et al. | Mammary Epithelial Cell-Derived Exosomal miR-221-3p Regulates Macrophage Polarization by Targeting Igf 2 bp 2 during Mastitis | |
| CN117467558A (zh) | 一种具有缓解流感和提高免疫力的植物乳杆菌lz026及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |