CN109528771B - 一种宫内膜干细胞来源的外泌体在治疗急性肺损伤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种宫内膜干细胞外泌体制剂在制备治疗急性肺损伤药物中的应用，所述宫内膜干细胞来源于女性经血。本发明中，宫内膜干细胞获取方便、来源丰富，宫内膜干细胞外泌体制剂制备简单，输注技术简便、易操作，在急性肺损伤中改善肺功能和降低炎症水平效果显著，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及急性肺损伤治疗领域，特别涉及宫内膜干细胞来源的外泌体在急性肺损伤治疗中的用途及其制备方法。
背景技术
急性肺损伤(ALI)主要由胃酸吸入、感染、创伤、脂肪栓塞、吸入有毒气体等多种原因引起，炎症反应都在其病理改变中起了主要作用。虽然，大量的研究试图阐明ALI的发病机理，但是，至今仍没发现特别有效的治疗手段。目前，ALI的治疗主要以支持治疗、药物治疗和辅助通气治疗为主，临床上仍然保持着很高的病死率，大约维持在30％～40％，因此开发有效的ALI治疗药物和手段十分迫切。
近年来，研究表明女性经血中存在丰富的多能干细胞，具有间充质干细胞的一般表型特征，且拥有多向分化潜能，同时还具有来源丰富、取材方便、体外增殖能力强等优点，是在组织损伤修复和疾病治疗等生物医学领域极具潜在应用价值的一类细胞。外泌体作为细胞分泌囊泡，含有蛋白、核酸等多种成分，在细胞功能发挥中的作用也日益受到重视。干细胞来源的外泌体功能研究对于开发细胞来源的非细胞产品具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种宫内膜干细胞来源外泌体的制备在治疗ALI药物中的用途，即利用宫内膜干细胞外泌体制成的悬液制剂能够改善肺功能、降低急性肺损伤炎症程度，为宫内膜干细胞外泌体提供了一种新用途。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种宫内膜干细胞来源外泌体在制备治疗急性肺功能和炎症损伤药物中的应用。
本发明所述宫内膜干细胞外泌体以悬液的形式作用，所述外泌体悬液按如下方法制备：将贴壁培养的宫内膜干细胞取其上清，超速离心过滤后，PBS洗涤，再用PBS悬浮，即为宫内膜干细胞外泌体悬液。所述宫内膜干细胞悬液中外泌体含量以蛋白浓度计为0.2～0.5mg/ml。所述药物用量以宫内膜干细胞外泌体浓度为1～5mg/kg体重，静脉输注，输注时间为造模后的6～24小时。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明利用脂多糖LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型，首次证明通过静脉注射宫内膜干细胞来源的外泌体制剂能够显著改善急性肺损伤中血氧饱和度和氧合指数以及肺部炎症因子浓度等肺功能损伤。
本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：
图1是各组肺功能指标检测结果图；其中ALI、PBS和MZ-exosomes分别表示ALI模型组、ALI模型PBS注射组、ALI模型宫内膜干细胞外泌体注射组。*表示宫内膜干细胞外泌体注射组与ALI模型组比较差异显著(P﹤0.05)，**表示宫内膜干细胞外泌体注射组与ALI模型组比较差异极显著(P﹤0.01)。
图2是各组血清炎症因子检测结果图；其中ALI、PBS和MZ-exosomes分别表示ALI模型组、ALI模型PBS注射组、ALI模型宫内膜干细胞外泌体注射组。**表示宫内膜干细胞外泌体注射组与ALI模型组比较差异极显著(P﹤0.01)。
具体实施方式
以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：急性肺损伤小鼠模型制备
小鼠注射250μl 1％戊巴比妥钠(PBS配制)进行麻醉，沿颈部中间剪开皮肤和肌肉层，暴露气管，用1ml注射器在气管两环中间向心方向刺入，注射2.5mg/ml的LPS(PBS配制)，剂量为10mg/kg体重，注射完成后即刻将小鼠竖立旋转，使得溶液均匀分布肺部两侧，缝合后，小鼠在无菌环境下正常饲喂。
实施例2：宫内膜干细胞外泌体制剂
(1)宫内膜干细胞分离培养
取经血20ml，室温1000rpm离心3分钟，弃上清，加入10ml生理盐水充分混匀细胞沉淀。缓慢转入含15ml人淋巴细胞分离液的离心管中，室温600g离心20min。小心吸取中间白膜层(单核细胞层)至另一离心管中。加入适量生理盐水充分混匀，1000rpm离心5min，弃上清获得细胞沉淀。将所获沉淀使用含2％血清替代物(购自PALL公司)的MEM-alpha培养基(购自Invitrogen公司)悬浮，同时取少量悬液通过全自动血液分析仪进行计数，最后将有核细胞调整密度后以2*105/cm2密度接种至25cm2塑料细胞培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、含5％CO2培养箱中培养，48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜培养液，而后每2～3天换液，待细胞长至90％汇合时，消化传代，P3代细胞收集鉴定，即为宫内膜干细胞。
(2)宫内膜干细胞外泌体的制备
取步骤(1)分离的宫内膜干细胞，长至90％左右汇合时，收集培养上清，4℃，2000g离心10min，取上清。0.22μm滤器过滤后，使用100kDa MW超滤管浓缩至10ml。4℃，10万g离心1h，弃上清，加入0.5ml PBS重悬。重复该步骤。0.22μm滤膜过滤后，PBS调整浓度至0.20～0.25mg/ml(总蛋白浓度计)即为宫内膜干细胞外泌体制剂。
实施例3：宫内膜干细胞外泌体制剂输注改善肺功能、降低肺损伤炎症程度
(1)利用实施例1所述方法建立的小鼠急性肺损伤(ALI)模型，实验为3组：组1为ALI模型对照组、组2为ALI模型PBS注射组、组3为ALI模型宫内膜干细胞外泌体制剂注射组。组3于建模后6-24h，按1mg/kg体重剂量通过尾静脉输注实施例2制备的宫内膜干细胞外泌体制剂。组2注射与组3等体积的PBS。注射后72h取样进行血气分析检测和炎症因子检测，分析宫内膜干细胞外泌体对ALI的作用效果。
(2)血气分析检测：小鼠经注射250μl 1％戊巴比妥钠(PBS配制)麻醉后，用1ml注射器(1mg/ml肝素钠抗凝)从腹主动脉抽取500μl左右动脉血，通过血气分析仪进行检测，分析血氧饱和度和氧合指数。
(3)炎症因子白介素1β和肿瘤坏死因子α的检测：取小鼠血清，采用ELISA方法检测其中IL-1β和TNFα的含量。
(4)结果表明，宫内膜干细胞外泌体制剂注射能够显著改善血氧饱和度和氧合指数(如图1所示)，并能有效降低血清炎症因子水平(如图2所示)。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种宫内膜干细胞外泌体制剂在制备治疗急性肺损伤药物中的应用；所述宫内膜干细胞外泌体制剂按如下方法制备：使分离的宫内膜干细胞长至90%汇合时，收集宫内膜干细胞培养上清液，在4℃、2000g的条件下离心10min，取上清液；再通过0.22μm滤器过滤后，使用100kDaMW超滤管浓缩至10mL；在4℃、10万g条件下离心1h，弃上清液，加入0.5mL的PBS重悬；重复该步骤1次；0.22μm滤膜过滤后，PBS调整总蛋白浓度为0.20~0.25mg/mL，得到宫内膜干细胞外泌体制剂；
所述宫内膜干细胞外泌体制剂中外泌体浓度以蛋白浓度计为0.2-0.5mg/ml；
所述宫内膜干细胞外泌体制剂在急性肺损伤模型中使用剂量为1~5mg/kg体重，输注方式为静脉输注，输注时间为急性肺损伤发生后的6~24小时。
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| 外泌体在急性肺损伤中的作用研究进展;孙名倬等;《中华烧伤杂志》;20180731;第34卷(第7期);第481-485页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN109528771A (zh) | 2019-03-29 |
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Legal Events
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Denomination of invention: Application of an extracellular vesicle derived from endometrial stem cells in the treatment of acute lung injury drugs Effective date of registration: 20231115 Granted publication date: 20211217 Pledgee: Hangzhou branch of Bank of Nanjing Co.,Ltd. Pledgor: HANGZHOU S-EVANS BIOSCIENCES, Ltd. Registration number: Y2023980065713 |