CN108619114A

CN108619114A - 一种负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108619114A
Application number: CN201810409507.0A
Authority: CN
Inventors: 刘必成; 汤涛涛; 吕林莉
Original assignee: Southeast University
Current assignee: Southeast University
Priority date: 2018-05-02
Filing date: 2018-05-02
Publication date: 2018-10-09
Anticipated expiration: 2038-05-02
Also published as: US20230190654A1; CN108619114B; WO2019210638A1

Abstract

本发明公开了一种负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡及其制备方法和应用。该负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡由来源于鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞的微囊泡包载地塞米松形成。本发明负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡能够更加有效的被损伤细胞摄取，通过抑制促炎信号通路的活化和炎症细胞的浸润达到改善肾脏炎症的目的。同时本发明的制备方法简单、方便、高效，制备的微囊泡来源于RAW 264.7细胞，数量充足、来源广泛，可以进行规模化生产。本发明制备的负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡可以应用在制备治疗肾脏病的药物或者制剂中，同时还可以应用于制备抗炎或免疫抑制药物或者制剂中。

Description

一种负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及基于微囊泡的给药系统，具体涉及一种负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡制备方法和其在肾脏疾病抗炎治疗中的应用。

背景技术

糖皮质激素如地塞米松因具有显著的抗炎和抑制免疫的作用，故在治疗炎症和免疫性疾病中得到了广泛的应用，在肾脏病主要用于治疗急进性肾小球肾炎、肾病综合征、IgA肾病等。然而，长期大量使用糖皮质激素会导致严重的不良反应和糖皮质激素抵抗，严重阻碍了临床使用。因此，探索降低糖皮质激素不良反应，提高糖皮质激素敏感性的方法成为研究的热点。

微囊泡是多种活细胞分泌的直径约为100～1000nm的细胞外囊泡，其内包含丰富的蛋白、脂质、核酸以及来自于亲代细胞的膜受体，在多种生理和病理过程中发挥着至关重要的作用。近年来发现，细胞外囊泡作为天然稳定的纳米级膜囊泡，能够穿透生物屏障，保护其内容物不被降解，并被受体细胞高效摄取，因而可以作为基因、药物的载体，参与疾病的治疗。与其他常用的治疗载体如病毒、脂质体等相比，细胞外囊泡还具有低免疫原性、无细胞毒性等特点。

目前，专利文献CN102596177A，公开日2012.07.18，公开了来源于有核哺乳动物细胞的微囊泡，所述微囊泡比所述有核细胞小，可用于将治疗物质或诊断物质递送至特定组织或特定细胞，更具体地，该发明涉及来源于单核细胞、巨噬细胞、树枝状细胞、干细胞等等的微囊泡，所述微囊泡可用于递送治疗和/或诊断与癌症、血管疾病、炎症等相关的组织的特定治疗物质或诊断物质。但现有技术中还未见用巨噬细胞微囊泡作为地塞米松载体，实现肾脏病抗炎治疗的报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种负载地塞米松(DEX)的巨噬细胞源微囊泡，这种微囊泡能够更加有效的被损伤细胞摄取，通过抑制促炎信号通路的活化和炎症细胞的浸润达到改善肾脏炎症的目的。

本发明还提供所述负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡的制备方法和应用。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡，由来源于鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞的微囊泡包载泡地塞米松形成。本发明的负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡命名为微囊泡来源于鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞，地塞米松(DEX)包载于该囊泡内部。

本发明所述的负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡的制备方法，包括以下步骤：

(1)培养鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞；

(2)用地塞米松处理RAW 264.7细胞；

(3)收集步骤(2)中地塞米松处理细胞后的培养基上清，用差速离心的方法收集微囊泡即得到负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡。

其中，步骤(1)所述培养鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞具体过程为：将RAW 264.7细胞培养于含10％胎牛血清的RIPM 1640培养基中，置于37℃、饱和湿度、5％CO₂培养箱中培养，当细胞融合达到70％-80％时进行步骤(2)的处理。

其中，步骤(1)所述培养RAW 264.7细胞所用的胎牛血清(FBS)为去除微囊泡的胎牛血清。

其中，步骤(2)所述用地塞米松处理RAW 264.7细胞具体过程为：当步骤(1)中培养RAW 264.7细胞融合达到70％-80％时，用不含胎牛血清的RIPM 1640培养基清洗细胞，并更换为无FBS的RIPM 1640培养基，加入地塞米松，进行处理。加入地塞米松使得终浓度为30μmol/L，处理16h。

其中，所述步骤(3)具体过程为：收集步骤(2)中地塞米松处理细胞后的培养基上清，先低速离心取上清液，再高速离心弃去上清，加PBS重悬清洗，再高速离心得到的沉淀即为负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡。用无菌PBS或无菌生理盐水重悬微囊泡，-80℃保存。

本发明所述的负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡在制备治疗肾脏病的药物或者制剂中的应用。

进一步地，所述的负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡能够更好的被损伤细胞摄取，通过抑制促炎信号通路的活化和炎症细胞的浸润，从而达到治疗肾脏炎症的目的，实现在制备治疗肾脏病的药物或者制剂中的应用。

本发明所述的负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡制备抗炎或免疫抑制药物或者制剂中的应用。

本发明的平均直径在140.7±4.8nm左右，透射电镜下观察到的形态符合微囊泡的特征，高效液相色谱可以检测微囊泡中包载有DEX。

本发明通过细胞实验证明，所述可以被鼠肾小球内皮细胞(GECs)摄取，并且具有炎症依赖性，即脂多糖(LPS)干预后，GECs对微囊泡的摄取会增加，同时，LPS导致的炎症反应也得到显著改善。

进一步地，本发明首次证明，在相同的药物浓度下，负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡的抗炎作用比DEX直接给药更强，表现为更有效的抑制NF-κB信号通路和降低炎症因子的表达。

因LPS诱导的脓毒症模型肾脏具有显著的炎症反应，本发明构建了此小鼠模型，通过尾静脉注射相同药物浓度的和DEX，观察两者对肾脏炎症的改善作用，发现对炎症的抑制作用更为显著。

本发明首次通过动物实验证明，比DEX直接给药更有效地抑制肾脏炎症因子和NF-κB的表达，以及减少间质中巨噬细胞的浸润。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、本发明利用巨噬细胞来源的微囊泡包裹DEX，得到的比DEX直接给药具有更强的抗炎作用，对肾脏炎症的治疗效果更佳。因此，本发明制备的可以应用在制备治疗肾脏病的药物或者制剂中，在肾脏病的临床治疗中具有非常可观的应用前景。

2、本发明制备的具有更强的抗炎作用，因而可以减少DEX用量，从而可以明显改善糖皮质激素导致的不良反应。

3、本发明的制备方法简单、方便、高效，制备的微囊泡来源于RAW 264.7细胞，数量充足、来源广泛，可以进行规模化生产。

4、本发明因DEX具有广泛的抗炎和免疫抑制作用，所制备的负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡在其他炎性和免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、炎性肠病、哮喘等疾病中也具有很好的应用前景，本发明的巨噬细胞源微囊泡也可以应用在制备抗炎或免疫抑制药物或者制剂中。

附图说明

图1为负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡的鉴定图：(A)Western blot检测巨噬细胞标志性蛋白F4/80和CD68；(B)透射电镜观察形态，标尺为100nm；(C)粒径分布图；(D)内地塞米松浓度测定；

图2为肾小球内皮细胞摄取的分析图：(A)肾小球内皮细胞摄取后的平均荧光强度；(B)肾小球内皮细胞摄取的个数，放大倍数为1000倍；

图3为的抗炎作用示意图：(A)炎症因子的mRNA水平；

图4为与DEX抗炎作用的比较关系图：(A)炎症因子的mRNA水平；(B)NF-κB p65和p-p65的蛋白水平；

图5为与DEX对小鼠脓毒症模型的治疗作用比较关系图：(A)炎症因子的mRNA水平；(B)NF-κB p65和p-p65的蛋白水平；(C)间质巨噬细胞染色，放大倍数为200倍。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡的提取、鉴定及药物浓度测定

1、的制备

体外培养鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞(购自中国科学院细胞库)，将RAW264.7细胞培养于含体积分数10％胎牛血清(美国Gibco)的RIPM 1640(美国Gibco)培养基中，其中所用胎牛血清经离心去除微囊泡。待培养瓶中RAW 264.7细胞融合达到70％-80％时，用RIPM 1640培养基清洗细胞两次，并更换为无FBS的RIPM 1640培养基，加入DEX(美国Sigma)，使得终浓度为30μmol/L，处理16h。处理16h后，无菌收集培养基上清液于50ml无菌离心管中，于4℃、2000×g离心20分钟，以去除死细胞和大的碎片；小心将上清液转移到新的无菌离心管中，于4℃、10000×g离心2分钟，以去除死细胞和小的碎片；小心将上清液转移到新的50ml无菌离心管中，于4℃、16500×g离心30分钟，小心弃去上清，再加无菌PBS(pH7.4)重悬清洗一次，于4℃、16500×g离心30分钟得到的沉淀即为巨噬细胞源微囊泡用无菌PBS或无菌生理盐水重悬微囊泡，-80℃保存。

2、的鉴定

通过用Western blot法检测所制备微囊泡表面的标志性蛋白，结果如图1A所示，制备的微囊泡表达巨噬细胞标志物F4/80和CD68，证明其来源于巨噬细胞。

用透射电镜观察的形态：用移液枪将充分吹打均匀，吸取10μL滴到200目的载样铜网上，室温静止1h，用滤纸小心吸掉多余液体，干燥后于透射电镜成像拍照。结果如图1B所示，可见直径约为150nm左右的圆形双层膜结构，证明所制备的符合微囊泡的特征。

微囊泡粒径检测：微囊泡送上海逍鹏生物科技有限公司检测粒径分布，所用仪器是德国PMX纳米颗粒跟踪分析仪Zetaview。结果如图1C所示，微囊泡的平均直径为140.7±4.8nm。

3、的药物浓度的测定

采用HPLC方法检测所述微囊泡中DEX的浓度：首先用德国PMX纳米颗粒跟踪分析仪确定的浓度，然后取适量(检测范围即可)的微囊泡重悬液(微囊泡总数约为5×10⁹个)进行检测。结果如图1D所示，中DEX的平均浓度约为6.2μg/1×10¹⁰MPs。

本实施例结果说明，本发明制备的负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡可以表达巨噬细胞标志蛋白F4/80和CD68，平均直径为140.7±4.8nm，透射电镜下观察到的形态符合微囊泡的特征，微囊泡包载DEX的平均浓度约为6.2μg/1×10¹⁰MPs。

实施例2

负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡对LPS诱导的肾小球内皮细胞炎症的治疗作用

1、肾小球内皮细胞摄取的检测

体外提取小鼠原代肾小球内皮细胞(GECs)，铺于六孔板或共聚焦小皿中，待细胞融合达到80％时，六孔板中加入2×10⁷个PKH26(美国Sigma)标记的共聚焦小皿中加入5×10⁶个PKH26标记的观察不同时间点LPS(终浓度10μg/ml)(美国Sigma)对GECs摄取的影响，为了观察GEC吞噬的量采用流式细胞术检测六孔板中GECs的平均荧光强度，结果如图2A所示，LPS干预组(终浓度10μg/ml)GECs的平均荧光强度更高(对照组是不加LPS)。采用激光共聚焦显微镜观察GEC摄取的平均个数，结果如图2B所示，LPS干预组GECs摄取的更多。

2、的抗炎作用

将GECs铺于六孔板中，待细胞融合达到80％时，将不同剂量分别加入各孔中，剂量分别为1×10⁹、5×10⁹和1×10¹⁰个加入LPS(终浓度15μg/ml)刺激12h后收细胞。用RT-PCR检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的mRNA水平。结果如图3所示，随着剂量的增高，各炎症因子的表达逐渐降低。

3、与DEX抗炎作用的比较

将GECs铺于六孔板中，待细胞融合达到80％时，分别加入具有相同药物浓度(终浓度5μmol/L)的DEX和LPS(终浓度15μg/ml)刺激12h后收细胞。用RT-PCR检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的mRNA水平。用Western blot检测NF-κB p65和p-p65的蛋白水平。结果如图4所示，与DEX组相比，能更好的降低炎症因子和NF-κBp65、p-p65的表达。

本实施例结果说明，所制备更易被炎症损伤的GECs摄取，其抗炎作用存在剂量依赖性，并且相比于DEX直接给药，说明本发明制备的微囊泡具有更好的抗炎作用。

实施例3

负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡对LPS诱导的小鼠脓毒症模型的治疗作用

实验所用C57BL/6小鼠，8-10周龄，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。实验分组：对照组：于0h和24h腹腔注射生理盐水，于12h和36h尾静脉注射生理盐水；模型组：于0h和24h腹腔注射LPS(10μg/g)，于12h和36h尾静脉注射生理盐水；DEX治疗组：于0h和24h腹腔注射LPS(10μg/g)，于12h和36h尾静脉注射DEX(DEX浓度0.5mg/kg)；治疗组：于0h和24h腹腔注射LPS(10μg/g)，于12h和36h尾静脉注射(DEX浓度为0.5mg/kg)。所有小鼠在48h处死。

用RT-PCR检测肾组织中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β和MCP-1的mRNA水平，结果如图5A所示，与DEX组相比，能更好的降低炎症因子的表达。

用Western blot检测NF-κB p65和p-p65的蛋白水平，结果如图5B所示，与DEX组相比，能更好的降低NF-κB p65和p-p65的蛋白表达。

用免疫组化检测间质中巨噬细胞(F4/80⁺细胞)浸润情况，结果如图5C所示，与DEX组相比，组间质中巨噬细胞数量更少。

本实施例结果说明，对小鼠脓毒症模型肾脏炎症的治疗作用显著优于DEX直接给药，主要表现为比DEX更有效地抑制促炎信号通路，降低炎症因子表达，减少间质中巨噬细胞浸润。

统计学分析

统计数据以平均值±标准误的形式给出，SPSS 13.0统计软件处理数据，组件比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验，p＜0.05为具有显著差异。实验结果均重复3次以上。

Claims

1.一种负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡，其特征在于，由来源于鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞的微囊泡包载地塞米松形成。

2.一种权利要求1所述的负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)培养鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞；

(2)用地塞米松处理RAW 264.7细胞；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述培养鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞具体过程为：将RAW 264.7细胞培养于含胎牛血清的RIPM 1640培养基中培养。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养RAW 264.7细胞所用的胎牛血清优选为去除微囊泡的胎牛血清。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述用地塞米松处理RAW264.7细胞具体过程为：当步骤(1)中培养RAW 264.7细胞融合达到70％-80％时，用不含胎牛血清的RIPM 1640培养基清洗细胞，并更换为无胎牛血清的RIPM 1640培养基，加入地塞米松，进行处理。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)具体过程为：收集步骤(2)中地塞米松处理细胞后的培养基上清，先低速离心取上清液，再高速离心弃去上清，加PBS重悬清洗，再高速离心得到的沉淀即为负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡。

7.一种权利要求1所述的负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡在制备治疗肾脏病的药物或者制剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡能够更好的被损伤细胞摄取，抑制促炎信号通路的活化和炎症细胞的浸润。

9.一种权利要求1所述的负载地塞米松的巨噬细胞源微囊泡制备抗炎或免疫抑制药物或者制剂中的应用。