CN113943705A - 一种凋亡微囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

一种凋亡微囊泡及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种凋亡微囊泡的制备方法，包括：1)体外培养小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系；2)细胞汇合度达到90‑100％时，加入星形孢菌素(staurosporine，STS)诱导细胞凋亡；3)收集培养液上清液，然后通过梯度离心法分离即得到凋亡微囊泡(apoptotic vesicle，apoVs)。本发明还提供了该凋亡微囊泡及其在制备用于促进间充质干细胞成脂分化的制剂中的应用。本发明提供的凋亡微囊泡能够促进间充质干细胞成脂向分化，可以用于软组织缺损或凹陷的修复，且无明显副作用。

Description

一种凋亡微囊泡及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物组织工程技术领域，具体涉及一种可用于促进间充质干细胞成脂分化的凋亡微囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
外伤、感染、手术或先天畸形导致的软组织缺损或凹陷在临床中十分常见。颌面部软组织缺损有先天性因素和后天性因素两大类，先天性因素最常见的是唇腭裂，后天性因素主要有外伤导致的，如交通事故、烧伤，还有感染性疾病和肿瘤占位也会导致软组织缺损。此外，乳腺良恶性病变术后乳房变形、缺如也是常见的软组织缺损类型。组织重建是颌面部及乳房的术后修复的重要部分。除上述软组织缺损之外，随着年龄的增长，人们会出现面部老态的问题，比如皱纹、面部凹陷或皮肤松弛等，都是比较常见的问题，随着人们生活水平的提高和对美的追求，如何安全有效进行面部年轻化治疗也是临床研究的热点。
自体脂肪填充、人工合成或生物性填充材料植入是软组织缺损修复和凹陷修复的常用方法。但是，自体脂肪填充可能会导致术后高吸收率、液化坏死以及供区瘢痕挛缩等情况。人工合成填充物往往会导致机体产生免疫排斥反应，而生物型填充材料降解快、易吸收，需要多次填充。因此，研发更安全、有效的脂肪再生手段极为重要。
发明内容
针对现有软组织缺损修复和凹陷修复治疗方法存在较多副作用和不足之处，本发明提供了一种安全高效促进脂肪再生的细胞外囊泡，旨在解决现有软组织缺损修复和凹陷修复治疗中因产生副作用而限制了其治疗应用的问题。
脂肪再生是指通过模拟脂肪组织发生发育的过程，从而在特定区域形成新生的脂肪组织，恢复软组织结构和功能，同时避免出现相关并发症。利用组织工程进行软组织缺损修复，可以避免填充材料植入引起的免疫排斥反应，且无需自体供区组织，就可以实现软组织再生，减少了供区创伤。
本发明提供了一种用于软组织修复的凋亡微囊泡的制备方法，包括：
1)体外培养小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系；
2)细胞汇合度达到90-100％时，加入星形孢菌素(staurosporine，STS)诱导细胞凋亡；
3)收集培养液上清液，然后通过梯度离心法分离即得到凋亡微囊泡。
在根据本发明的一个实施方案中，
步骤1)中所述小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系为RAW264.7；
优选地，体外培养的培养基为：含有10％FBS和1％青-链霉素双抗的DMEM培养基。
在根据本发明的一个实施方案中，所述STS添加量为500nM。
在根据本发明的一个实施方案中，所述梯度离心法是通过包括下述步骤的方法实现的：
a)将所述培养液上清液于4℃，以800g离心10min，取上清液，获得第一离心上清液；
b)将所述第一离心上清液于4℃、以2000g离心10min，取上清液，获得第二离心上清液；
c)将所述第二离心上清液于4℃、以16000g离心30min，取沉淀物，即得粗制凋亡微囊泡。
在根据本发明的一个实施方案中，所述梯度离心法还包括：
d)将所述粗制凋亡微囊泡以无菌PBS洗涤，然后于4℃、以16000g离心30min，获得凋亡微囊泡纯品。
本发明还提供了根据上述的制备方法制备得到的凋亡微囊泡；优选地，所述凋亡微囊泡呈双面凹的圆盘状，粒径为150-600nm，更优选地，所述凋亡微囊泡平均粒径240nm。
本发明进一步提供了上述的凋亡微囊泡在制备用于促进间充质干细胞成脂向分化的制剂中的应用；优选为用于软组织缺损或软组织凹陷修复的制剂。
本发明还提供了一种用于促进间充质干细胞成脂向分化的制剂，其包含上述的凋亡微囊泡。
在根据本发明的一个实施方案中，所述制剂还包含间充质干细胞；优选地，凋亡微囊泡的浓度为2μg/mL。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：
本发明提供的凋亡微囊泡的提取方法较为简单，且成本低、产量高，并可以进行快速检测，通过使用凋亡微囊泡增加间充质干细胞成脂向分化，从而提高间充质干细胞体内外成脂能力，达到促进脂肪再生的目的，在治疗软组织缺损和凹陷方面有着较广阔的开发应用前景。本发明提供的凋亡微囊泡在修复软组织的应用中无明显副作用，不会引起患者不适反应，因此能够有效地长期用于治疗软组织缺损和凹陷。
附图说明
图1为RAW264.7体外诱导凋亡和提取apoVs的流程示意图。
图2为apoVs的提取结果检测图；其中，A为透射电镜观测结果显示图，apoVs呈现为双面凹的圆盘状；B为纳米颗粒跟踪分析检测结果图，其显示提到的apoVs粒径分布主要集中在150-600nm左右，平均粒径240nm。
图3为RAW264.7来源的apoVs促进人脂肪间充质干细胞体外成脂向分化情况检测图；其中，A为油红O染色图，其显示在加入apoVs后，人脂肪间充质干细胞体外成脂向分化能力增加；B为油红O定量图，其检测结果同染色结果；C为RT-qPCR结果图，其显示在加入apoVs后，PPARγ及C/EBPα的表达量较对照组明显升高，证明人脂肪间充质干细胞体外成脂向分化能力增加。
图4为RAW264.7来源的apoVs促进人脂肪间充质干细胞体内成脂向分化情况对照图；其中，A为通过H&E染色的对照图，其显示在加入apoVs后，实验组较对照组可见大量空泡状脂肪组织形成；B为通过油红O染色的对照图，其显示实验组镜下可见大量红染的脂肪组织形成，实验组较对照组形成更多的脂肪组织。
图5为RAW264.7来源的apoVs通过调控MAPK/Erk信号通路促进人脂肪间充质干细胞成脂向分化的Western Blot结果图；其显示在成脂诱导后，P-Erk1/2磷酸化水平上调，加入apoVs后，P-Erk1/2磷酸化水平较对照组明显上调。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
实施例1 RAW264.7来源的apoVs的高效提取
体外培养RAW264.7，细胞汇合度达到90-100％时，加入500nM STS进行凋亡诱导，通过梯度离心法获取RAW264.7来源的apoVs，使用纳米颗粒跟踪分析检测其浓度，BCA法检测其蛋白量，获得最优化的提取条件，建立标准的提取流程。具体如下：
a)将细胞培养液上清液于4℃，以800g离心10min，以去除培养液上清液中的细胞碎片，取上清液，获得第一离心上清液；
b)将所述第一离心上清液于4℃、以2000g离心10min，以去除第一离心上清液中的凋亡小体等杂分，取上清液，获得第二离心上清液；
c)将所述第二离心上清液于4℃、以16000g离心30min，取沉淀物，即得粗制凋亡微囊泡；
d)将所述粗制凋亡微囊泡以无菌PBS洗涤，然后于4℃、以16000g离心30min，获得凋亡微囊泡纯品。
实施例2 RAW264.7来源的apoVs的特征分析
通过冷冻透射电镜和纳米颗粒跟踪分析检测RAW264.7来源的apoVs的形态、粒径、浓度。
冷冻透射电镜：
(1)吸取5μl凋亡微囊泡悬液滴到铜网上，室温静置1min；
(2)用滤纸沿铜网外侧吸去多于液体，吸取5μl 2％醋酸铀酰滴入铜网上，室温下静置30秒；
(3)用滤纸沿铜网外侧吸去多余液体，室温下静置干燥；
(4)透射电镜下拍摄图像，电压设置为120kV。
纳米粒径跟踪分析检测：
(1)用纳米颗粒跟踪分析仪记录布朗运动下外泌体的运动轨迹；
(2)通过NTA分析软件进行分析。
如图2示，A为透射电镜观测结果显示图，apoVs呈现为双面凹的圆盘状；B为纳米颗粒跟踪分析检测结果图，其显示提到的apoVs粒径分布主要集中在150-600nm左右，平均粒径240nm。
实施例3 体外实验检测RAW264.7来源的apoVs对人脂肪间充质干细胞体外成脂向分化的作用
在成脂诱导14天后，通过油红O染色检验细胞成脂分化的效果。
油红O染色：
配制染液，称取油红O干粉0.5g，溶于100ml 100％异丙醇，充分溶解后即为油红O储存液，4℃避光保存。染色前，取油红O储存液，按照储存液：蒸馏水＝3：2的比例稀释，滤纸过滤后即为油红O工作液，用于染色。
吸净培养基，PBS冲洗3遍，10％中性福尔马林固定1小时。弃去福尔马林，PBS冲洗3遍，60％异丙醇润洗。晾干后加入工作液。染出脂滴后，终止染色，镜下拍照。
油红O定量：
100％异丙醇溶解10分钟，于500nm波长下测吸光度，进行油红O染色定量分析。
如图3中A所示的油红O染色结果：
与普通增殖培养(PM)相比，成脂诱导培养(AM)环境下培养14天后可见大量红染的脂滴生成。
在AM培养的同时加入RAW264.7来源的apoVs，培养14天后进行油红O染色。结果如图3中B所示，与对照组(AM)相比，RAW264.7来源的apoVs可以促进细胞内脂滴的生成。对应的油红O定量分析结果与染色结果一致(*P<0.05)。
将细胞接种于6孔板，分别进行普通增殖培养(PM)、成脂诱导培养(AM)以及成脂诱导培养条件下RAW264.7来源的apoVs(AM+apoVs：2μg/mL)。培养14天时提取RNA，使用RT-qPCR检测成脂相关基因PPARγ和C/EBPα的表达情况。
(1)细胞总RNA提取
按实验分组将细胞接种于6孔板，不同条件诱导后提RNA。具体步骤如下：
1)吸净培养基，PBS冲洗。
2)加入Trizol试剂(1ml/孔)，移入1.5ml的离心管中。
3)加入200μl三氯甲烷，震荡30秒，冰上放置3分钟。
4)4℃，12000g，离心15分钟。
5)静置，吸取上层水相转移到另一离心管。
6)加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，冰上静置10分钟。
7)4℃，12000g，离心10分钟。
8)弃上清，加入1ml预冷无水乙醇和DEPC水配制的75％乙醇，洗涤沉淀。
9)4℃，7500g，离心5分钟。
10)弃上清，吸净液体，室温下干燥沉淀，加入适量的DEPC水，提取的总RNA于-80℃分装保存或进行下一步实验。
(2)逆转录合成cDNA
1)逆转录反应体系为20μl，总RNA使用量约为1000ng。
2)取提取的总RNA 1000ng，按照试剂盒说明书在冰上配制逆转录反应液。
3)逆转录反应条件：37℃，15分钟(逆转录反应)；85℃，5秒(逆转录酶的失活反应)；4℃保持(可以于-20℃分装保存或进行下一步实验)。
(3)实时定量PCR反应
1)每个样品每个基因检测三个副孔，八联管每孔内配置20μl反应体系，使用试剂及用量如下，其中引物序列如表1所示：
Figure BDA0003331867940000061
Figure BDA0003331867940000071
2)PCR反应条件为：95℃热启动10分钟，95℃变性30秒；60℃退火延伸1分钟，共40个循环；
3)以GAPDH为内参，使用ΔΔCt法分析数据，实验数据以三次独立实验的平均值±标准差表示。
表1 qRT-PCR引物序列
Figure BDA0003331867940000072
结果如图3中C所示：与空白对照组(PM)相比，成脂诱导培养后成脂相关基因PPARγ和C/EBPα的表达水平均显著上升。与对照组(AM)相比，在成脂诱导培养条件下加入RAW264.7来源的apoVs后，可以促进成脂相关基因的表达(***P<0.001)。
实施例4 体内实验检测RAW264.7来源的apoVs对人脂肪间充质干细胞体内成脂向分化的作用
将人脂肪间充质干细胞分别在以下三种培养条件下培养7天：
1)增殖培养基(PM)：含有10％FBS和1％青-链霉素双抗的DMEM培养基。
2)成脂诱导(AM)：含有10％FBS、1％青-链霉素双抗、100nM地塞米松、10μM牛胰岛素、500μM IBMX、200μM吲哚美辛的DMEM培养基。
3)成脂诱导培养基中加入RAW264.7来源的apoVs(AM+apoVs)。
培养7天后收集细胞，与胶原蛋白膜共同孵育使细胞在胶原蛋白膜上均匀分布，将复合物植入裸鼠皮下，6周后处死取出植入的复合物。
取得的复合物固定后，经石蜡包埋、切片，对切片进行HE染色，镜下可见胶原蛋白膜支架材料之间有成空泡状的脂肪组织形成。如图4中A所示，在H&E染色切片中可以看到，AM组镜下可见空泡状脂肪组织形成。与AM组相比，AM+apoVs组可见大量空泡状脂肪组织。
对不同样本的组织进行油红O染色，如图4中B所示，在油红O染色中，脂肪组织中的脂滴被染成深色。在油红O染色切片中可见，AM组镜下可见深色的脂肪组织形成。与AM组相比，AM+apoVs组可见大量深色的脂肪组织形成。
实施例5 RAW264.7来源的apoVs通过调控MAPK/Erk信号通路促进人脂肪间充质干细胞成脂向分化
将细胞接种于60mm培养皿，进行成脂诱导培养并培养7天。
结果如图5所示，在成脂诱导(AM)培养条件下，诱导的同时加入apoVs会显著增加成脂标记蛋白PPARγ的表达量，也显著增加了MAPK/Erk通路中关键蛋白p-Erk1/2的表达。以上结果证明，RAW264.7来源的apoVs通过调控MAPK/Erk信号通路促进人脂肪间充质干细胞成脂向分化。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 北京大学口腔医学院
<120> 一种凋亡微囊泡及其制备方法和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggaccaata cgaccaaatc cg 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agccacatcg ctcagacacc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaggagccta aggtaaggag 20
<210> 4
<211> 20
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<210> 5
<211> 20
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<400> 5
cgcaagagcc gagataaagc 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacggctcag ctgttcca 18

Claims (9)

1.一种凋亡微囊泡的制备方法，其特征在于，包括：
1)体外培养小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系；
2)细胞汇合度达到90-100％时，加入星形孢菌素诱导细胞凋亡；
3)收集培养液上清液，然后通过梯度离心法分离即得到凋亡微囊泡。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤1)中所述小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系为RAW264.7；
优选地，体外培养的培养基为：含有10％FBS和1％青-链霉素双抗的DMEM培养基。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述STS添加量为500nM。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述梯度离心法是通过包括下述步骤的方法实现的：
a)将所述培养液上清液于4℃，以800g离心10min，取上清液，获得第一离心上清液；
b)将所述第一离心上清液于4℃、以2000g离心10min，取上清液，获得第二离心上清液；
c)将所述第二离心上清液于4℃、以16000g离心30min，取沉淀物，即得粗制凋亡微囊泡。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括：
d)将所述粗制凋亡微囊泡以无菌PBS洗涤，然后于4℃、以16000g离心30min，获得凋亡微囊泡纯品。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法制备得到的凋亡微囊泡；优选地，所述凋亡微囊泡呈双面凹的圆盘状，粒径为150-600nm，更优选地，所述凋亡微囊泡平均粒径240nm。
7.如权利要求6所述的凋亡微囊泡在制备用于促进间充质干细胞成脂向分化的制剂中的应用；优选为用于软组织缺损或软组织凹陷修复的制剂。
8.一种用于促进间充质干细胞成脂向分化的制剂，其特征在于，包含如权利要求6所述的凋亡微囊泡。
9.如权利要求8所述制剂，其特征在于，还包含间充质干细胞；优选地，凋亡微囊泡的浓度为2μg/mL。
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