CN115152742B - 一种细胞外囊泡保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细胞外囊泡保存方法。通过向含细胞外囊泡的PBS缓冲液中依次加入2‑甲基咪唑和乙酸锌，并室温静置后所得细胞外囊泡可在室温干燥条件下保存至少7天，该操作方法简单，且需要应用囊泡时易于解离囊泡表面保护层从而得到纯净的囊泡，在细胞外囊泡的体外保存、治疗应用方面具有重要的价值。
Description
技术领域
本发明涉及细胞外囊泡储存技术，具体涉及一种细胞外囊泡保存方法。
背景技术
细胞外囊泡是由细胞释放的具有双层膜结构的囊泡的总称，按直径大小可分为凋亡小体(1-5μm)、微囊泡(0.1-1μm)和外泌体(40-150nm)，其中，在细胞发生凋亡后提取的微囊泡(0.1-1μm)又称作凋亡微囊泡。
细胞外囊泡的内容物包括蛋白质、RNAs等多种生物大分子，且可通过膜受体-受体相互作用、膜融合、内吞、胞饮等方式将内容物传递至其他细胞，因此是细胞间交流沟通的重要方式。近年来的大量研究表明，细胞外囊泡在维持内环境稳态、免疫调节、组织修复和再生、疾病治疗中具有广泛的应用价值。
但是，细胞外囊泡在体外极不稳定，即使冻存于-80度，也难以长时间保证其形态的完整和功能的维持，且不便于运输，这极大地限制了细胞外囊泡的临床应用。
发明内容
针对现有技术的缺陷或不足，本发明提供了2-甲基咪唑和乙酸锌联合在细胞外囊泡室温干燥保存中应用。
进一步，本发明提供了一种细胞外囊泡保存方法。为此，本发明所提供内的保存方法包括：向含有细胞外囊泡的缓冲液中加入2-甲基咪唑和乙酸锌混匀后室温静置，得到可室温保存的细胞外囊泡。
进一步，室温静置后收集沉淀物，对沉淀物室温干燥保存。
进一步，向含有细胞外囊泡的缓冲液中加入含2-甲基咪唑缓冲液和含乙酸锌的缓冲液混匀后室温静置后室温干燥保存。
进一步，向保存后的沉淀物中加入含EDTA的缓冲液，混匀后收集沉淀为被保存细胞外囊泡。
本发明还提供了经上述方法处理后的细胞外囊泡。
经本发明方法处理后的细胞外囊泡稳定性极大提高，可脱离缓冲液，体外长期干燥保存(至少为7天)。进一步，需要纯净的细胞外囊泡时，只需用解离液去除ZIF-8，即可获得形态完整的细胞外囊泡。
附图说明
图1A为实施例1所得的凋亡微囊泡正常形态的扫描电镜(SEM)图，图1B为实施例1中ZIF-8包封凋亡微囊泡后的SEM图；
图2为实施例1空ZIF-8和ZIF-8包封的凋亡微囊泡(凋亡微囊泡@ZIF-8)的X射线衍射(XRD)图；
图3为实施例1ZIF-8包封凋亡微囊泡前后核酸荧光染色图，A为单纯凋亡微囊泡组，B为ZIF-8包封后的凋亡微囊泡组；
图4为实施例1单纯凋亡微囊泡室温干燥保存12h和ZIF-8包封的凋亡微囊泡室温干燥保存12h并解离ZIF-8后的TEM图，A为单纯凋亡微囊泡，B为被ZIF-8包封并于12h后解离ZIF-8的凋亡微囊泡；
图5为实施例1单纯凋亡微囊泡室温干燥保存7天和ZIF-8包封的凋亡微囊泡室温干燥7天并解离ZIF-8的SEM图，A为单纯凋亡微囊泡，B为被ZIF-8包封并于7天后解离ZIF-8的凋亡微囊泡；
图6为对比例处理后的囊泡的SEM图；
图7为实施例2ZIF-8包封凋亡小体后的SEM图；
图8为实施例2单纯凋亡小体室温干燥保存12h与ZIF-8包封的凋亡小体室温干燥保存12h并解离ZIF-8后的SEM图，A为单纯凋亡小体，B为被ZIF-8包封并于12h后解离ZIF-8的凋亡小体；
图9为实施例2单纯凋亡小体室温干燥保存72h与ZIF-8包封的凋亡小体室温干燥72h并解离ZIF-8的SEM图，A为单纯凋亡小体，B为被ZIF-8包封并于72h后解离ZIF-8的凋亡小体；
图10为实施例3各组骨髓间充质干细胞成骨诱导1周后的ALP染色结果图及定量分析结果，其中，A为空白对照组的ALP染色结果图；B为凋亡微囊泡新鲜提取组的ALP染色结果图；C为凋亡微囊泡保存1周组的ALP染色结果图；D为定量分析结果。
具体实施方式
除非有特殊说明，本文中的技术与科学术语根据相关领域普通技术人员的认识理解。还应理解，本文涉及的温度、浓度是近似值，用于说明目的。虽然与本文描述的方法和材料相似或等价的方法和材料可以用于本公开的实施，但下文描述了部分适合的方法和材料。本文提到的出版物、专利申请、专利和其他参考文献以引用方式部分纳入本文，如出现冲突，以本文为准。另外，所述材料、方法、溶液浓度和实施例仅是示例性的，而并不意欲进行限制。具体方案中，本领技术人员可以根据本发明所公开内容采用常规实验时段对方法中所涉及的物质配比、浓度、操作参数取值进行优化以实现本发明的目的。
本文所述的干燥是相对于缓冲液环境、溶剂环境、非生理环境来讲的，具体是指在采用本发明的方法处理后离心获得沉淀物后直接保存，或进一步将沉淀物经水洗、甲醇离心洗涤后直接保存。
本发明在含细胞外囊泡的缓冲液中依次加入2-甲基咪唑和乙酸锌，形成ZIF-8稳定包封的细胞外囊泡，可在室温环境下长期稳定储存，也可将ZIF-8包封的细胞外囊泡离心收集后室温保存，保存过程中抵抗干燥等非生理环境。下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
实施例1：
该实施例对提取的RAW264.7巨噬细胞系来源的凋亡微囊泡用本发明的方法进行室温保存，具体方案如下：
提取凋亡微囊泡：使用含10％无外泌体血清的高糖DMEM培养基培养RAW264.7小鼠巨噬细胞系(该细胞购自ATCC)，用500nM星孢菌素(购自：Cell Signaling Technology)刺激细胞12h后，收集细胞培养上清；800g离心15min，取上清至新的离心管；2000g离心10min，取上清至新的离心管；16000g离心30min，弃上清，沉淀即为凋亡微囊泡，其扫描电镜图如图1A所示；
之后用PBS缓冲液离心洗涤掉残留培养基后，再用1ml PBS缓冲液重悬凋亡微囊泡以维持其生物活性；向重悬后的含囊泡PBS缓冲液中分别加入2-甲基咪唑溶液和乙酸锌，为方便混匀，该实施例分别加入的是以PBS缓冲液为溶剂的2-甲基咪唑溶液和以PBS缓冲液为溶剂的乙酸锌溶液；具体配方是：向74.6μl含囊泡PBS缓冲液中依次加入21.4μl的1M 2-甲基咪唑溶液和4μl的3M二水乙酸锌溶液；混匀后室温静置2h；
接着，将静置后的反应液2100g离心15min，弃上清后，用水和甲醇分别进行离心洗涤残留物后得到可常温干燥保存的凋亡微囊泡，经电镜观察，经本发明方法处理后的凋亡微囊泡为ZIF-8包封的凋亡微囊泡，其电镜图如图1B所示；X射线衍射分析结果如图2所示，可证明包封凋亡微囊泡的物质为ZIF-8；采用hoechst核酸染色法获得图3所示结果，说明ZIF-8的包封不会破坏囊泡内的核酸。
然后将该实施例所得的ZIF-8包封的凋亡微囊泡在室温干燥保存12h、7天。
进一步，于保存凋亡微囊泡12h、7天后解离ZIF-8，解离ZIF-8方法为：分别向保存不同时间后的ZIF-8包封的凋亡微囊泡中加入10ml含0.05MEDTA的PBS溶液，解离ZIF-8，16000g离心30min后弃上清，沉淀即为凋亡微囊泡；之后使用10mlPBS缓冲液重悬囊泡，再次16000g离心30min后弃上清，沉淀即为纯净的凋亡微囊泡。
保存12h、7天后解离ZIF-8后的囊泡电镜图分别为图4、图5，单纯囊泡组的囊泡均出现不同程度的皱缩、破裂现象，而ZIF-8包封的囊泡形态仍完整。
对比例：
该对比例与实施例1不同的是，先将2-甲基咪唑溶液和二水乙酸锌溶液混合反应，之后加入到含囊泡的PBS缓冲液中，结果如图6所示，2-甲基咪唑溶液和二水乙酸锌优先发生反应，形成单独的ZIF-8，无法对囊泡进行有效的包封。
实施例2：
该实施例对提取的RAW264.7巨噬细胞系来源的凋亡小体用本发明的方法进行室温保存，具体方案如下：
提取凋亡小体：使用含10％无外泌体血清的高糖DMEM培养基培养RAW264.7小鼠巨噬细胞系(该细胞购自ATCC)，用500nM星孢菌素(购自：Cell Signaling Technology)刺激细胞12h后，收集细胞培养上清；800g离心15min，取上清至新的离心管；2000g离心10min，弃上清，沉淀即为凋亡小体；
之后用PBS缓冲液离心洗涤残留培养基后，再用1ml PBS缓冲液重悬凋亡小体以维持其生物活性；向重悬后的含囊泡PBS缓冲液中分别加入2-甲基咪唑溶液和乙酸锌，为方便混匀，该实施例分别加入的是以PBS缓冲液为溶剂的2-甲基咪唑溶液和以PBS缓冲液为溶剂的乙酸锌溶液；具体配方是：向74.6μl含囊泡PBS缓冲液中依次加入21.4μl的1M 2-甲基咪唑溶液和4μl的3M二水乙酸锌溶液；混匀后室温静置2h；
接着，将静置后的反应液2000g离心10min，弃上清后，用水和甲醇分别进行离心洗涤残留物后得到可常温保存的凋亡小体，经电镜观察，经本发明方法处理后的凋亡小体为ZIF-8包封的小体，其电镜图如图7所示。
ZIF-8包封的凋亡小体在室温干燥保存12h、72h。
进一步，于保存凋亡小体12h、72h后解离ZIF-8，解离ZIF-8方法为：分别向保存不同时间后的ZIF-8包封的凋亡小体中加入10ml含0.05M EDTA的PBS溶液，解离ZIF-8，2000g离心10min后弃上清，沉淀即为凋亡小体；之后使用10mlPBS缓冲液重悬囊泡，再次2000g离心10min后弃上清，沉淀即为纯净的凋亡小体。
保存12h、72h后解离ZIF-8后的囊泡电镜图分别为图8、图9，单纯囊泡组的囊泡均出现不同程度的破裂现象，而ZIF-8包封的囊泡形态仍完整。
实施例3：
该实施例为提取人骨髓间充质干细胞来源的凋亡微囊泡，用本发明的方法处理后干燥保存1周，之后解离并应用于干细胞成骨诱导实验，具体方案如下：
制备凋亡微囊泡：采用文献“BMSC-Derived ApoEVs Promote Craniofacial BoneRepair via ROS/JNK Signaling.J Dent Res.2022Jun；101(6):714-723.”中公开的方法制备凋亡微囊泡，具体使用含10％无外泌体血清的α-MEM培养基培养人骨髓间充质干细胞(该细胞购自ATCC)，用500nM星孢菌素(购自：Cell Signaling Technology)刺激细胞12h后，收集细胞培养上清；800g离心15min，取上清至新的离心管；2000g离心10min，取上清至新的离心管；16000g离心30min，弃上清，沉淀即为凋亡微囊泡；
之后用PBS缓冲液洗涤凋亡微囊泡表面残留培养基，接着用10ml PBS缓冲液重悬凋亡微囊泡，向7.46ml含凋亡微囊泡的PBS缓冲液中依次加入2.14ml、3M含2-甲基咪唑的PBS缓冲液溶液和0.4ml、1M含二水乙酸锌的PBS缓冲液溶液，室温静置2h；
接着，将静置后的反应液2100g离心15min，弃上清后，用水和甲醇分别进行离心洗涤残留物后得到ZIF-8包封的凋亡微囊泡，对其室温干燥保存1周；
之后，向保存1周后的ZIF-8包封的凋亡微囊泡中加入10ml含0.05MEDTA的PBS溶液，解离ZIF-8，16000g离心30min后弃上清，沉淀即为凋亡微囊泡；之后使用10ml PBS缓冲液重悬囊泡，再次16000g离心30min后弃上清，沉淀即为室温干燥保存1周后的纯净的凋亡微囊泡；
另设对照组，方法为按该实施例上述方案中的离心参数提取新鲜的人骨髓间充质干细胞来源的凋亡微囊泡；
进一步，在24孔板中接种人骨髓间充质干细胞(购自ATCC)，待细胞密度约为80％左右时更换成骨诱导液(培养液中含2mMβ-甘油磷酸钠,50μg/mL抗坏血酸和10nM地塞米松)，同时向部分复孔中分别加入新鲜提取的凋亡微囊泡和保存1周后的凋亡微囊泡，成骨诱导1周后进行ALP染色并定量，结果如图10所示，相较于未加囊泡组，新鲜提取的凋亡微囊泡组和保存1周后的凋亡微囊泡组ALP染色更深，且后两者之间无明显差异，说明采用本发明方法保存囊泡1周后，囊泡的促成骨效果仍可保持。
以上是对本发明的示例性描述，但是本发明的保护范围并不局限于此，任何简单变形、修改或者其他等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种细胞外囊泡保存方法，其特征在于，方法包括：向含有细胞外囊泡的缓冲液中加入2-甲基咪唑和乙酸锌混匀后室温静置，得到可室温保存的细胞外囊泡；室温静置后收集沉淀物，对沉淀物室温干燥保存。
2.如权利要求1所述的细胞外囊泡保存方法，其特征在于，向含有细胞外囊泡的缓冲液中加入含2-甲基咪唑缓冲液和含乙酸锌的缓冲液混匀后室温静置后室温干燥保存。
3.如权利要求1所述的细胞外囊泡保存方法，其特征在于，向保存后的沉淀物中加入含EDTA的缓冲液，混匀后收集沉淀为被保存细胞外囊泡。
4.一种细胞外囊泡，其特征在于，所述细胞外囊泡经权利要求1-3任一权利要求所述方法处理。
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