CN110354315B - 一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法 - Google Patents

一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法，包括：1）对蚕茧脱胶及后续处理，得到1~4%的RSF水溶液；2）将氧化石墨烯（GO）分散液、二氧化钛（TiO2）水溶胶和乙醇超声分散共混，利用水热法合成rGO@TiO2复合纳米粒子，经水洗干燥得到其粉末；3）将rGO@TiO2粉末超声分散在水中，并将其共混入1）中RSF水溶液；4）将3）中混合溶液浓缩至RSF质量百分数为4~15%；5）将乙醇水溶液加入到RSF/rGO@TiO2混合溶液中，机械搅拌后，静置形成凝胶；6）将凝胶超低温冷冻，并进行冷冻干燥，制备出RSF/rGO@TiO2三维多孔组织工程支架。本发明采用rGO@TiO2复合纳米粒子协同增强RSF材料，在提高RSF支架力学性能的同时，也能赋予支架抗菌性和骨诱导性等功能。

Description

一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程 支架的制备方法
技术领域
本发明涉及组织工程、生物医用材料领域，特别涉及一种三维多空抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法。
背景技术
据最近调查显示，我国因交通事故或骨科疾病造成骨缺陷的人群每年超过300万人，而目前临床治疗骨缺损的有效方法是将骨组织工程支架植入到缺损处，通过模拟细胞外基质和构建合适的微环境来诱导骨细胞生长、增殖和分化。
再生丝素蛋白（RSF）是一种天然高分子材料，来源广泛且价格便宜，具有良好的生物相容性、降解性以及低炎症反应等优点。相比其他同类天然高分子，RSF的生物相容性更加优异，对骨折愈合的促进作用更显著。然而，虽然RSF支架材料在骨组织工程中表现出良好的应用前景，但将其应用于临床治疗仍存在一定的缺陷，如支架力学性能不够理想、骨诱导能力不强等。
因此，为使RSF支架材料更适合于骨组织工程的需要，可选择某些物质作为增强填料，构建综合性能优异的RSF复合支架。研究表明，由无机纳米粒子与高聚物复合而成的支架材料同时具有无机纳米粒子强度高与聚合物材料韧性优良的优点，可更好地应用于修复人体承重部位的骨组织缺损，具有良好的发展前景。
石墨烯是一种优良的纳米增强粒子，具有独特的层状结构、大的比表面积、良好的力学性能和电性能。同时，石墨烯材料还具有一定的生物相容性，能够诱导干细胞分化和增殖，并起到加速胶原蛋白矿化的作用。另外，石墨烯是一种抗菌活性物质的理想载体，具有较好的抗菌性。然而，石墨烯片层之间存在范德华力，当其含量超过某临界值时，石墨烯粒子在基体中易于堆叠、团聚和分布不均，从而影响石墨烯对基体材料的增强效果。
纳米纳米二氧化钛（TiO2）作为零维金属氧化物，是一种轻质、耐腐蚀、具有良好生物相容性的粒子，可促进细胞的粘附和增殖。另外，由于TiO2具有独特的紫外光催化性，其纳米粒子也是一种优良抗菌剂。有研究表明，将纳米二氧化钛（TiO2）粒子等金属氧化物纳米粒子负载在石墨烯粒子表面，可使得石墨烯片层间距增大，能有效阻止石墨烯粒子团聚。将氧化石墨烯（GO）和TiO2复合制备成新型纳米材料是近几年来发展起来的技术。目前，可采用紫外光催化、水热处理法和化学方法将GO和TiO2合成一种石墨烯/二氧化钛（rGO@TiO2）复合纳米粒子，而采用rGO@TiO2复合粒子为填料协同增强改性生物材料，并制备多孔组织工程支架是一种新思路。
发明内容
发明目的：针对RSF复合支架作为骨组织工程支架支架力学性能不够理想、骨诱导能力不强以及抗菌性不明显等问题，本发明提供一种三维多空抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法，采用rGO@TiO2复合纳米粒子协同增强RSF支架，在提高RSF支架力学性能的同时，也能赋予支架抗菌性和骨诱导性。
技术方案：本发明提供了一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法，包括如下步骤：
步骤1）将脱胶后的蚕丝溶解于溴化锂（LiBr）水溶液中，经过离心、过滤、透析除去杂质和LiBr，得到再生丝素蛋白（RSF）水溶液，浓缩RSF水溶液至RSF质量百分数为1~4 %，记为溶液A；
步骤2）将GO分散液、TiO2水溶胶和乙醇三者进行共混，其中GO与TiO2的质量比为1:1~1:10进行共混，对混合溶液超声分散均匀后，利用水热法合成石墨烯/二氧化钛（rGO@TiO2）复合纳米粒子了，经过抽滤水洗和干燥得到其粉末；
步骤3）将步骤2）所述rGO@TiO2粉末超声分散在水中，得到rGO@TiO2溶液，再将其加入到步骤1）所述的溶液A中，按rGO@TiO2与RSF质量比为1:20~1:100进行混合均匀，继续浓缩形成RSF质量百分数为4~15 %的再生丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛（RSF/rGO@TiO2）混合溶液；
步骤4）将乙醇水溶液加入到所述步骤3）的RSF/rGO@TiO2混合溶液中，在机械搅拌后静置形成凝胶；
步骤5）将步骤4）所述凝胶放入超低温冰箱冷冻，随后将其放入冷冻干燥机中抽真空干燥，制备成三维多孔RSF/rGO@TiO2骨组织工程支架。
优选地，所述步骤1）中LiBr水溶液的摩尔浓度为9.0±0.5 mol/L。
优选地，所述步骤1）中透析温度为6~12 ℃，透析时间为72 h，换水周期为3~4 h。
优选地，所述步骤2）中GO分散液浓度为0.5~4 mg/mL，TiO2水溶胶中纳米粒子TiO2质量分数为10~30%。
优选地，所述步骤2）中乙醇的体积百分数为25%，体积为100 mL。
优选地，所述步骤2）中水热法的反应温度为120~150 ℃，反应时间为4~8 h。
优选地，所述步骤3）中rGO@TiO2混合溶液浓度为0.5~5 mg/mL。
优选地，所述步骤4）中乙醇水溶液体积分数为70~100%，机械搅拌后静置时间为2~6h。
优选地，所述步骤5）中冷冻温度为-80 ~ -20℃，冷冻时间为24~48 h。
有益效果：
1.本发明在步骤1）得到的RSF水溶液质量分数为1~4%，这样在第二步浓缩RSF水溶液至4~15%时，不会出现需要加水进行稀释的情况，减少不必要的制备步骤。
2.本发明GO与TiO2的质量比为1:1~1:10，rGO@TiO2与RSF质量比为1:20~1:100，选用rGO@TiO2复合粒子协同增强改性RSF支架，一方面通过两种粒子GO与TiO2的相互作用，促进石墨烯在基体中的分散，改善复合材料的力学性能，另一方面，两种纳米粒子各自都具有一定的骨诱导性和抗菌性，可赋予RSF材料一定的功能性，从而制备出性能良好的RSF/rGO@TiO2多孔复合材料。
3.本发明创造性地制备出一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架，采用的原料纯天然、容易获得、经济实惠。
附图说明
图1为成骨细胞接种在三维多孔抗菌的RSF/rGO@TiO2组织工程支架和纯RSF三维多孔组织工程支架上培养3天的激光共聚焦显微镜对比图（活死细胞染色），其中图a是成骨细胞接种在三维多孔抗菌的RSF/rGO@TiO2组织工程支架上培养3天的激光共聚焦显微镜图，图b是成骨细胞接种在纯RSF三维多孔组织工程支架上培养3天的激光共聚焦显微镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1：
1）用煮沸的质量百分数为0.5%~1%碳酸钠（Na2CO3）水溶液对蚕茧进行脱胶，脱胶后将其溶解于摩尔浓度为9.0±0.5 mol/L的LiBr水溶液中，经过离心、过滤、透析除去杂质和LiBr，得到RSF水溶液，并将其浓缩至RSF质量分数为2%的溶液A待用。所述透析是将离心抽滤后的RSF溶液置入纤维素透析袋中，封闭后，浸入去离子水中开始透析，透析温度为6~12℃，透析时间为72 h，换水周期为3~4 h。
2）将0.5~4 mg/mL的GO分散液、10~30%的TiO2水溶胶和体积百分数为25%，体积为100 mL的乙醇共混，控制GO与TiO2的质量比为1:5，并将其放在超声分散机中超声分散均匀后，利用水热法合成rGO@TiO2复合纳米粒子，水热法的反应温度为120~150 ℃，反应时间为4~8 h，rGO@TiO2复合纳米粒子经过抽滤水洗和干燥得到rGO@TiO2粉末。
3）将rGO@TiO2粉末加入到溶液A中，控制rGO@TiO2与RSF的质量比为1:100，并混合均匀，将RSF/rGO@TiO2混合溶液浓缩至RSF质量百分数为4 %待用。
4）将3）中的RSF质量百分数为4 %的RSF/rGO@TiO2混合溶液加入体积分数为70~100%乙醇水溶液，机械搅拌后静置2~6 h形成凝胶。
5）将4）得到的凝胶放入冷冻温度为-80 ~ -20℃的超低温冰箱冷冻，冷冻24~48h，随后将其放入冷冻干燥机冻干，制备出一种三维多孔RSF/rGO@TiO2骨组织工程支架。
本发明中GO与TiO2的质量比为1:5，rGO@TiO2与RSF的质量比为1:100，RSF/rGO@TiO2混合溶液浓缩至RSF质量百分数为4%，其制备出的骨组织工程支架孔隙率为95%，压缩强度为2.0 MPa。
实施例2：
实施例2与实施例1的不同之处为实施例2控制rGO@TiO2与RSF的质量比为1:50，而实施例1控制rGO@TiO2与RSF的质量比为1:100，其他操作与实施例1相同，如下：
1）用煮沸的质量百分数为0.5%~1%碳酸钠（Na2CO3）水溶液对蚕茧进行脱胶，脱胶后将其溶解于摩尔浓度为9.0±0.5 mol/L的LiBr水溶液中，经过离心、过滤、透析除去杂质和LiBr，得到RSF水溶液，并将其浓缩至RSF质量分数为2%的溶液A待用。所述透析是将离心抽滤后的RSF溶液置入纤维素透析袋中，封闭后，浸入去离子水中开始透析，透析温度为6~12℃，透析时间为72 h，换水周期为3~4 h。
2）将0.5~4 mg/mL的GO分散液、10~30%的TiO2水溶胶和体积百分数为25%，体积为100 mL的乙醇共混，控制GO与TiO2的质量比为1:5，并将其放在超声分散机中超声分散均匀后，利用水热法合成rGO@TiO2复合纳米粒子，水热法的反应温度为120~150 ℃，反应时间为4~8 h，rGO@TiO2复合纳米粒子经过抽滤水洗和干燥得到rGO@TiO2粉末，。
3）将rGO@TiO2粉末加入到溶液A中，控制rGO@TiO2与RSF的质量比为1:50，并混合均匀，将RSF/rGO@TiO2混合溶液浓缩至RSF质量百分数为4 %待用。
4）将3）中的RSF质量百分数为4 %的RSF/rGO@TiO2混合溶液加入体积分数为70~100%乙醇水溶液，机械搅拌后静置2~6 h形成凝胶。
5）将4）得到的凝胶放入冷冻温度为-80 ~ -20℃的超低温冰箱冷冻，冷冻24~48h，随后将其放入冷冻干燥机冻干，制备出一种三维多孔RSF/rGO@TiO2骨组织工程支架。
本发明中GO与TiO2的质量比为1:5，rGO@TiO2与RSF的质量比为1:50，RSF/rGO@TiO2混合溶液浓缩至RSF质量百分数为4 %，其制备出的骨组织工程支架孔隙率为91%，压缩强度为2.5 MPa。
实施例3：
实施例3与实施例2的不同之处为实施例3控制rGO@TiO2与RSF的质量比为1:20，而实施例2控制rGO@TiO2与RSF的质量比为1:50，其他操作与实施例2相同，如下：
1）用煮沸的质量百分数为0.5%~1%碳酸钠（Na2CO3）水溶液对蚕茧进行脱胶，脱胶后将其溶解于摩尔浓度为9.0±0.5 mol/L的LiBr水溶液中，经过离心、过滤、透析除去杂质和LiBr，得到RSF水溶液，并将其浓缩至RSF质量分数为2%的溶液A待用。所述透析是将离心抽滤后的RSF溶液置入纤维素透析袋中，封闭后，浸入去离子水中开始透析，透析温度为6~12℃，透析时间为72 h，换水周期为3~4 h。
2）将0.5~4 mg/mL的GO分散液、10~30%的TiO2水溶胶和体积百分数为25%，体积为100 mL的乙醇共混，控制GO与TiO2的质量比为1:5，并将其放在超声分散机中超声分散均匀后，利用水热法合成rGO@TiO2复合纳米粒子，水热法的反应温度为120~150 ℃，反应时间为4~8 h，rGO@TiO2复合纳米粒子经过抽滤水洗和干燥得到rGO@TiO2粉末。
3）将rGO@TiO2粉末加入到溶液A中，控制rGO@TiO2与RSF的质量比为1:20，并混合均匀，将RSF/rGO@TiO2混合溶液浓缩至RSF质量百分数为4 %待用。
4）将3）中的RSF质量百分数为4 %的RSF/rGO@TiO2混合溶液加入体积分数为70~100%乙醇水溶液，机械搅拌后静置2~6 h形成凝胶。
5）将4）得到的凝胶放入冷冻温度为-80 ~ -20℃的超低温冰箱冷冻，冷冻24~48h，随后将其放入冷冻干燥机冻干，制备出一种三维多孔RSF/rGO@TiO2骨组织工程支架。
本发明中GO与TiO2的质量比为1:5，rGO@TiO2与RSF的质量比为1:20，RSF/rGO@TiO2混合溶液浓缩至RSF质量百分数为4%，其制备出的骨组织工程支架孔隙率为85%，压缩强度为4.2 MPa。
实施例4：
实施例4与实施例3的不同之处为实施例4控制RSF/rGO@TiO2混合溶液浓缩至RSF质量百分数为8 %，而实施例3控制RSF/rGO@TiO2混合溶液浓缩至RSF质量百分数为4%，其他操作与实施例3相同，如下：
1）用煮沸的质量百分数为0.5%~1%碳酸钠（Na2CO3）水溶液对蚕茧进行脱胶，脱胶后将其溶解于摩尔浓度为9.0±0.5 mol/L的LiBr水溶液中，经过离心、过滤、透析除去杂质和LiBr，得到RSF水溶液，并将其浓缩至RSF质量分数为2%的溶液A待用。所述透析是将离心抽滤后的RSF溶液置入纤维素透析袋中，封闭后，浸入去离子水中开始透析，透析温度为6~12℃，透析时间为72 h，换水周期为3~4 h。
2）将0.5~4 mg/mL的GO分散液、10~30%的TiO2水溶胶和体积百分数为25%，体积为100 mL的乙醇共混，控制GO与TiO2的质量比为1:5，并将其放在超声分散机中超声分散均匀后，利用水热法合成rGO@TiO2复合纳米粒子，水热法的反应温度为120~150 ℃，反应时间为4~8 h，rGO@TiO2复合纳米粒子经过抽滤水洗和干燥得到rGO@TiO2粉末。
3）将rGO@TiO2粉末加入到溶液A中，控制rGO@TiO2与RSF的质量比为1:20，并混合均匀，将RSF/rGO@TiO2混合溶液浓缩至RSF质量百分数为8 %待用。
4）将3）中的RSF质量百分数为8 %的RSF/rGO@TiO2混合溶液加入体积分数为70~100%乙醇水溶液，机械搅拌后静置2~6 h形成凝胶。
5）将4）得到的凝胶放入冷冻温度为-80 ~ -20℃的超低温冰箱冷冻，冷冻24~48h，随后将其放入冷冻干燥机冻干，制备出一种三维多孔RSF/rGO@TiO2骨组织工程支架。
本发明中GO与TiO2的质量比为1:5，rGO@TiO2与RSF的质量比为1:20，RSF/rGO@TiO2混合溶液浓缩至RSF质量百分数为8 %，其制备出的骨组织工程支架孔隙率为82%，压缩强度为4.9 MPa。
参见下表1：针对实施例1~实施例4得到的RSF/rGO@TiO2组织工程支架对两种细菌的抑菌率的测试结果。
表1 本发明实施例1~4得到的三维多孔组织工程支架抑菌率测试结果
Figure 13359DEST_PATH_IMAGE001
。
参见下表2：针对实施例1~实施例4得到的RSF/rGO@TiO2组织工程支架的的孔隙率与压缩强度测试结果。
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
孔隙率（%） 95 91 85 82
压缩强度（MPa） 2.5 2.5 4.2 4.9
参见附图1，附图1为成骨细胞接种在（a）三维多孔抗菌的RSF/rGO@TiO2组织工程支架和（b）纯RSF三维多孔组织工程支架上培养3天的激光共聚焦显微镜图（活死细胞染色）。从图中可以看出，复合三维多孔支架上所黏附的细胞数目比纯RSF支架更多，且分布更为紧密，说明复合支架更有利于细胞增殖，即具有较好的生物相容性。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1）将脱胶后的蚕丝溶解于溴化锂水溶液中，经过离心、过滤、透析除去杂质和溴化锂，得到再生丝素蛋白水溶液，浓缩其至再生丝素蛋白的质量百分数为1~4%，记为溶液A；
步骤2）将氧化石墨烯分散液、二氧化钛水溶胶和乙醇三者进行共混，其中氧化石墨烯与二氧化钛的质量比为1:1~1:10，对混合溶液超声分散均匀后，利用水热法合成石墨烯/二氧化钛复合纳米粒子，经过抽滤水洗和干燥得到其粉末；
步骤3）将步骤2）所述石墨烯/二氧化钛粉末超声分散在水中，得到混合溶液，再将其加入到步骤1）所述的溶液A中，按石墨烯/二氧化钛复合纳米粒子与再生丝素蛋白质量比为1:20~1:100进行混合均匀，继续浓缩形成再生丝素蛋白质量百分数为4~15 %的再生丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛混合溶液；
步骤4）将乙醇水溶液加入到所述步骤3）的再生丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛混合溶液中，在机械搅拌后静置形成凝胶；
步骤5）将步骤4）所述凝胶放入超低温冰箱冷冻，随后将其放入冷冻干燥机中抽真空干燥，制备成三维多孔再生丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架。
2.根据权利要求1所述的一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中溴化锂水溶液的摩尔浓度为9.0±0.5 mol/L。
3.根据权利要求1所述的一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述步骤1）中透析温度为6~12 ℃，透析时间为72 h，换水周期为3~4 h。
4.根据权利要求1所述的一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中氧化石墨烯分散液浓度为0.5~4 mg/mL，二氧化钛水溶胶中纳米粒子二氧化钛质量百分数为10~30%。
5.根据权利要求1所述的一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中乙醇的体积百分数为25%，体积为100 mL。
6.根据权利要求1所述的一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中水热法的反应温度为120~150 ℃，反应时间为4~8 h。
7.根据权利要求1所述的一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述步骤3）中石墨烯/二氧化钛混合溶液浓度为0.5~5 mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述步骤4）中乙醇水溶液体积分数为70~100%，机械搅拌后静置时间为2~6 h。
9.根据权利要求1所述的一种三维多孔抗菌的丝素蛋白/石墨烯/二氧化钛骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，所述步骤5）中冷冻温度为-80 ~ -20℃，冷冻时间为24~48h。
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Assignee: Haining protec New Material Co.,Ltd.

Assignor: HUAIYIN INSTITUTE OF TECHNOLOGY

Contract record no.: X2023980042158

Denomination of invention: Preparation method of a three-dimensional porous antibacterial silk fibroin/graphene/titanium dioxide bone tissue engineering scaffold

Granted publication date: 20200724

License type: Common License

Record date: 20230920