CN105169475A

CN105169475A - 一种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料的制备方法

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Publication number: CN105169475A
Application number: CN201510545799.7A
Authority: CN
Inventors: 何建新; 谭卫琳; 韩啟明; 杨勇; 连艳平; 王利丹; 崔世忠; 丁彬
Original assignee: Zhongyuan University of Technology
Current assignee: Zhongyuan University of Technology
Priority date: 2015-08-31
Filing date: 2015-08-31
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明涉及一种含有石墨烯/羟基磷灰石/丝素的骨仿生材料及其制备方法。它由共沉淀得到的羟基磷灰石经静电吸附组装到羧基化改性的石墨烯表面，再与不同质量浓度的丝素溶液共混按照质量浓度由高到低依次逐层冷冻干燥制备而成。本发明制得的石墨烯/羟基磷灰石/丝素骨仿生材料在成分和结构上仿生天然骨，具有良好的生物相容性和生物可降解性，优良的力学性能以及梯度分布的孔隙率，可以作为骨组织的修复或替代材料，具有广阔的应用前景。

Description

一种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料的制备方法

技术领域

本发明涉及一种含有石墨烯/羟基磷灰石/丝素纳米骨仿生材料及其制备方法，应用于骨修复或骨替代材料，具体涉及生物医用材料技术领域。

背景技术

在骨科领域，因严重交通事故、肿瘤、骨髓炎等多种原因所致的骨缺损是很普遍的现象。传统方法采用自体骨或异体骨移植进行治疗，自体骨来源有限且取骨区可能产生并发症，取骨又造成第二术区的创伤。同种异体骨的来源比自体骨多，但与受体组织之间存在免疫排斥反应，并有感染疾病的可能。所以，解决骨缺损修复材料的关键是开发出一种在骨诱导性和仿生骨结构方面能满足需要的的人工骨材料，也是骨修复替代材料的发展趋势。

目前用于骨组织修复的人工支架材料主要有三大类：无机材料（如羟基磷灰石、磷酸三钙）、有机高分子材料（聚乳酸、聚乙酸）和纳米材料。但是无机材料材质较脆、并且降解性能难以调控；有机高分子材料力学性能强度不足、亲水性差，其酸性降解产物易引起发炎，缺乏与人体组织结合的生物活性；而纳米类材料的安全性能仍待研究。因此，寻找比较理想的材料用于骨组织修复仍然是临床上的一个难点。

天然骨由无机成分和有机成分以65:35的比例存在。有机成分主要是骨胶蛋白，使骨具有一定的韧性，无机成分为羟基磷灰石结晶使骨具有一定硬度，两者的结合使骨具有很大的韧性和坚固性。羟基磷灰石纳米晶体有序地嵌在胶原纤维基质中，有机和无机组件的密切协同作用以及分子水平的独特组装，赋予了天然骨的多级结构和优异的力学性能。因此，要制备生物相容性好且力学性能优异的骨修复或骨替代材料，需要从分子水平进行仿生设计，模仿天然骨的结构和功能。

石墨烯是碳原子以sp²杂化轨道组成六角型蜂巢晶格的平面薄膜，其具有优良的导电性，超大的强度和韧性，使其在生物医药领域有广阔的应用前景。特别是氧化石墨结构中含有大量的—OH、—COOH、环氧基等，其碳原子分别以sp²和sp³两种模式连接未被氧化的芳香区和氧原子形成脂肪六元环区，这种结构赋予石墨烯极高的强度和柔韧性。通过羧基化改性使大量的—OH，进一步转化为—COOH，改善了其分散性、亲水性及与聚合物的兼容性等，且其具有较大的比表面积、较低毒性，可广泛应用于生物医学领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料的制备方法。通过石墨烯的羧基化改性和静电自组装仿生矿化得到石墨烯/羟基磷灰石复合粒子，利用冷冻干燥技术使它和不同浓度的丝素共混得到密度和孔隙率呈梯度分布的多孔骨仿生材料。这种骨仿生材料不仅在成分上模拟了天然骨，而且在结构上对天然骨仿生，具有良好的生物相容性、生物降解性和骨诱导性能，及足够的力学性能。

本发明目的技术方案是，一种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料的制备方法，它由羟基磷灰石粒子通过静电吸附组装在羧基化改性的石墨烯表面并和丝素溶液复合组成，石墨烯、羟基磷灰、丝素的质量比为1:1-10:0.5-5。

它由羧基化氧化石墨烯、羟基磷灰石和桑蚕丝素组成，质量比为1:1-10:0.5-5，密度梯度从外到内分别为75.3%-82.3%，57.4%-67.2%，11.6%-30.6%，它具有相互连通的纳米微孔结构，密度和孔隙率呈梯度分布，孔隙率从外到内依次为17.7%-24.7%，32.8%-42.6%，69.4-88.4%。所述的石墨烯为氧化石墨烯经羧基化改性制备而成，所述的丝素蛋白为桑蚕丝素和柞蚕丝素，其蛋白分子的特性粘度[η]大于或等于0.50。所述的羟基磷灰石呈针状分布，其粒子长度在50-300nm，粒子宽度在10-50nm。

含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的纳米骨仿生材料的制备方法，采用如下步骤：

（1）将石墨烯超声分散到0.1-2mol/L氢氧化钠的乙醇（85%）溶液中，浴比为1:500，在20-80℃下碱化10-120min，再加入0.125-2.5mol/L的氯乙酸钠溶液，在30-75℃下超声搅拌15-100min，并用0.1-0.5mol/L的盐酸调溶液pH值至中性并在蒸馏水中透析三天，得到羧基化的石墨烯水溶液；

（2）按照钙磷摩尔比为1.67，将0.01-0.1mol/L的Ca(OH)₂与稀释的H₃PO₄溶液用滴定管同时滴入步骤（1）制得的溶液中并在超声中搅拌1-6h，逐滴加入氨水控制反应pH值为8.0～10.0，控制反应温度为20-80℃，得到石墨烯/羟基磷灰石比例为1：1-10的复合粒子悬浊液；

（3）将步骤（2）所得的石墨烯/羟基磷灰石纳米复合粒子悬浊液室温静置24-72小时后除去上层清液，离心分离出沉淀物，蒸馏水洗涤三次后，冷冻干燥制得石墨烯/羟基磷灰石复合粒子；

（4）将步骤（3）中所得到石墨烯/羟基磷灰石复合粒子超声分散到浓度分别为5%-15%，35%-45%，55%-65%的丝素溶液中，得到不同质量浓度的石墨烯/羟基磷灰石/丝素共混溶液，这些共混溶液中石墨烯/羟基磷灰石复合粒子与丝素的质量比为65:35；

（5）将步骤（4）中制得的质量浓度最高的石墨烯/羟基磷灰石/丝素共混溶液倒入自制的模具中，在液氮条件骤冷后，于-50--99℃冷冻干燥，再将其它共混溶液按照质量浓度由高到低的顺序逐层冷冻干燥，制得密度和孔隙率呈梯度分布的含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的纳米骨仿生材料。

与现有的骨替代材料及其制备方法相比，本发明具有以下优点：

（1）本发明制备的一种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料，其中石墨烯/羟基磷灰石复合粒子，它是由羟基磷灰石通过静电吸附组装到羧基化改性的氧化石墨烯的表面制备而成的；由于静电作用，棒状的羟基磷灰石分布于蜂巢状的石墨烯片层之间，将片层的石墨烯连接在一起，石墨烯和羟基磷灰石交替排列形成钢筋-混凝土结构。因而，可提高羟基磷灰石的抗压力学强度和韧性；

（2）本发明中制备的一种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料具有梯度分布的孔隙结构，从而在宏观上对天然骨进行仿生。本发明制备的复合支架材料可以容易的获得所需的形状和大小；可以形成一定结构和含量的孔隙，充分满足骨移植过程中组织工程支架的需要；

（3）本发明中制备的一种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料具有无毒性、无刺激性、生物相容性好、细胞亲和性好、生物可降解性好以及优良的力学性能。

本发明主要基于氧化石墨烯的蜂巢晶格结构及其表面大量的活性基团，通过静电自组装仿生矿化得到石墨烯/羟基磷灰石复合粒子，并结合丝素来制备密度和孔隙率梯度分布的多孔骨仿生材料。

附图说明

图1为石墨烯/羟基磷灰石复合粒子结构放大倍数为10万倍的SEM照片；

图2为石墨烯/羟基磷灰石复合粒子结构放大倍数为2万倍的SEM照片。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进一步描述。

一种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料的制备方法，它由羟基磷灰石粒子通过静电吸附组装在羧基化改性的石墨烯表面并和丝素溶液复合组成，石墨烯、羟基磷灰、丝素的质量比为1:1-10:0.5-5。它由羧基化氧化石墨烯、羟基磷灰石和桑蚕丝素组成，质量比为1:1-10:0.5-5，密度梯度从外到内分别为75.3%-82.3%，57.4%-67.2%，11.6%-30.6%，它具有相互连通的纳米微孔结构，密度和孔隙率呈梯度分布，孔隙率从外到内依次为17.7%-24.7%，32.8%-42.6%，69.4-88.4%。所述的石墨烯为氧化石墨烯经羧基化改性制备而成，所述的丝素蛋白为桑蚕丝素和柞蚕丝素，其蛋白分子的特性粘度[η]大于或等于0.50。所述的羟基磷灰石呈针状分布，其粒子长度在50-300nm，粒子宽度在10-50nm。

实施例1

一种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的纳米骨仿生材料的制备方法，采用如下步骤：

（1）将氧化石墨烯超声分散到0.5mol/L氢氧化钠的乙醇（85%）溶液中，浴比为1:500，在30℃下碱化60min。再加入0.725mol/L的氯乙酸钠溶液，在60℃下超声搅拌50min，并用0.1mol/L的盐酸调溶液pH值至中性并在蒸馏水中透析三天，得到羧基化的石墨烯水溶液；

（2）按照钙磷摩尔比为1.67，将0.05mol/L的Ca(OH)₂与稀释的H₃PO₄溶液用滴定管同时滴入步骤（1）制得的溶液中并在超声中搅拌4h，逐滴加入氨水控制反应pH值为8.0～9.0，控制反应温度为60℃，得到石墨烯/羟基磷灰石比例为1：2的复合粒子悬浊液；

（3）将步骤（2）所得的石墨烯/羟基磷灰石复合粒子悬浊液室温静置48小时后除去上层清液，离心分离出沉淀物，蒸馏水洗涤三次后，冷冻干燥制得石墨烯/羟基磷灰石复合粒子；

（4）将步骤（3）中所得到氧化石墨烯/羟基磷灰石复合粒子超声分散到浓度分别为5%-15%，35%-45%，55%-65%的丝素溶液，得到不同质量浓度的石墨烯/羟基磷灰石/丝素共混溶液，这些共混溶液中石墨烯/羟基磷灰石纳米复合粒子与丝素的质量比为65:35；

（5）将步骤（4）中制得的质量浓度最高的石墨烯/羟基磷灰石/丝素共混溶液倒入自制的模具中，在液氮条件骤冷后，于-54℃冷冻干燥，再将其它共混溶液按照质量浓度由高到低的顺序逐层冷冻干燥，制得密度和孔隙率呈梯度分布的多孔骨仿生材料，这种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料由羧基化改性的石墨烯、羟基磷灰石和丝素组成，其质量比为1:2:2，其密度梯度从外到内分别为80.5%，60.8%，16.9%，其孔隙率梯度从外到内分别为19.5%，39.2%，83.1%。

表1显示了含有石墨烯/羟基磷灰石/丝素的多孔纳米骨仿生材料的力学性能和孔隙率，其石墨烯/羟基磷灰石复合粒子的结构的SEM照片如图1和图2（图中放大倍数为10万倍，图2放大倍数为2万倍）所示，由图1可以看出，本发明制备的含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料其羟基磷灰石的长度为50-300nm，宽度为10-50nm，从图2可以看出羟基磷灰石覆盖在片层石墨烯的表面。

实施例2

（1）将氧化石墨烯超声分散到1mol/L氢氧化钠的乙醇（85%）溶液中，浴比为1:500，在50℃下碱化20min。再加入1.25mol/L的氯乙酸钠溶液，在50℃下超声搅拌100min，并用0.3mol/L的盐酸调溶液pH值至中性并在蒸馏水中透析三天，得到羧基化的石墨烯水溶液；

（2）按照钙磷摩尔比为1.67，将0.1mol/L的Ca(OH)₂与稀释的H₃PO₄溶液用滴定管同时滴入步骤（1）制得的溶液中并在超声中搅拌2h，逐滴加入氨水控制反应pH值为8.0～10.0，控制反应温度为75℃，得到石墨烯/羟基磷灰石比例为1：4的复合粒子悬浊液；

（3）将步骤（2）所得的石墨烯/羟基磷灰石复合粒子悬浊液室温静置32小时后除去上层清液，离心分离出沉淀物，蒸馏水洗涤三次后，冷冻干燥制得石墨烯/羟基磷灰石复合粒子；

（4）将步骤（3）中所得到石墨烯/羟基磷灰石复合粒子超声分散到浓度分别为5%-15%，35%-45%，55%-65%的丝素溶液中，得到不同浓度的石墨烯/羟基磷灰石/丝素共混溶液，这些共混溶液中石墨烯/羟基磷灰石纳米复合粒子与丝素的质量比为65:35；

（5）将步骤（4）中制得的质量浓度最高的石墨烯/羟基磷灰石/丝素共混溶液倒入自制的模具中，在液氮条件骤冷后，于-60℃冷冻干燥，再将其它共混溶液按照质量浓度由高到低的顺序逐层冷冻干燥，制得密度和孔隙率呈梯度分布的多孔骨仿生材料。这种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料由羧基化改性的石墨烯、羟基磷灰石和丝素组成，其质量比为1:4:3，其密度梯度从外到内分别为79.8%，61.4%，20.6%，其孔隙率梯度从外到内分别为20.2%，38.6%，79.4%。

实施例3

（1）将氧化石墨烯超声分散到0.08mol/L氢氧化钠的乙醇（85%）溶液中，浴比为1:500，在40℃下碱化30min。再加入0.1mol/L的氯乙酸钠溶液，在55℃下超声搅拌60min，并用0.2mol/L的盐酸调溶液pH值至中性并在蒸馏水中透析三天，得到羧基化的石墨烯水溶液；

（2）按照钙磷摩尔比为1.67，将0.03mol/L的Ca(OH)₂与稀释的H₃PO₄溶液用滴定管同时滴入步骤（1）制得的溶液中并在超声中搅拌3h，逐滴加入氨水控制反应pH值为8.0～10.0，控制反应温度为80℃，得到石墨烯/羟基磷灰石比例为1：8的复合粒子悬浊液；

（4）将步骤（3）中所得到石墨烯/羟基磷灰石复合粒子超声分散到浓度分别为5%-15%，35%-45%，55%-65%的丝素溶液，得到不同质量浓度的石墨烯/羟基磷灰石/丝素共混溶液，这些共混溶液中石墨烯/羟基磷灰石纳米复合粒子与丝素的质量比为65:35；

（5）将步骤（4）中制得的质量浓度最高的石墨烯/羟基磷灰石/丝素共混溶液倒入自制的模具中，在液氮条件骤冷后，于-99℃冷冻干燥，再将其它共混溶液按照质量浓度由高到低的顺序逐层冷冻干燥，制得密度和孔隙率呈梯度分布的多孔骨仿生材料。这种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料由羧基化氧化石墨烯、羟基磷灰石和丝素组成，其质量比为1:8:6，其密度梯度从外到内分别为78.1%，59.8%，23.4%，其孔隙率梯度从外到内分别为21.9%，40.2%，77.6%。

制备的含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料的力学性能和孔隙率如表1所示。

表1含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的多孔纳米骨仿生材料的力学性能

样品	压缩强度（MPa）	压缩屈服强度（MPa）	压缩模量（GPa）	弯曲强度（MPa）	孔隙率（%）
						实施例1	82.9	53.5	2.03	158.2	19.5% 39.2% 83.1%
实施例2	51.8	41.8	1.83	105.7	20.2% 38.6% 79.4%
						实施例3	62.2	43.6	1.25	94.5	21.9% 40.2% 77.6

因此，本发明得到的含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的多孔纳米骨仿生材料具有大量互相连通的纳米尺度的微孔，并且具有梯度分布的密度和孔隙率；本发明得到的含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的多孔纳米骨仿生材料的成分均具有良好的生物相容性，而且在结构上也对天然骨进行仿生；其中的羧基化改性的石墨烯增强了羟基磷灰石的抗压强度和韧性。根据本发明的方法制备的骨仿生材料具有很好的力学性能、良好的成形性和合理的孔隙率，可以作为植入型的可降解骨修复材料。

Claims

1.一种含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料，其特征在于：它由羟基磷灰石粒子通过静电吸附组装在羧基化改性的石墨烯表面并和丝素溶液复合组成，石墨烯、羟基磷灰石和丝素的质量比为1:1-10:0.5-5。

2.根据权利要求1所述的含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料，其特征在于：它由羧基化氧化石墨烯、羟基磷灰石和桑蚕丝素组成，质量比为1:1-10:0.5-5，密度梯度从外到内分别为75.3%-82.3%，57.4%-67.2%，11.6%-30.6%。

3.根据权利要求1所述的含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料，其特征在于：它具有相互连通的纳米微孔结构，密度和孔隙率呈梯度分布，孔隙率从外到内依次为17.7%-24.7%，32.8%-42.6%，69.4-88.4%。

4.根据权利要求1所述的含有石墨烯、羟基磷灰石和丝素的骨仿生材料，其特征在于所：述的石墨烯是为氧化石墨烯经羧基化改性制备而成的，所述的丝素蛋白为桑蚕丝素和柞蚕丝素，其蛋白分子的特性粘度大于或等于0.50。

5.如权利要求1所述的含有石墨烯/羟基磷灰石/丝素骨仿生材料的制备方法，其特征在于：按以下步骤进行：

（1）将氧化石墨烯超声分散到0.1-2mol/L氢氧化钠的乙醇（85%）溶液中，浴比为1:500，在20-80℃下碱化10-120min；再加入0.125-2.5mol/L的氯乙酸钠溶液，在30-75℃下超声搅拌15-100min，并用0.1-0.5mol/L的盐酸调溶液pH值至中性并在蒸馏水中透析三天，得到羧基化改性的氧化石墨烯水溶液；

（2）按照钙磷摩尔比为1.67，将0.01-0.1mol/L的Ca(OH)₂与稀释的H₃PO₄溶液用滴定管同时滴入步骤（1）制得的溶液中并在超声中搅拌1-6h,逐滴加入氨水控制反应pH值为8.0～10.0，控制反应温度为20-80℃，得到石墨烯/羟基磷灰石比例为1：1-10的复合粒子悬浊液；

（3）将步骤（2）所得的石墨烯/羟基磷灰石纳米复合粒子悬浊液室温静置48小时后除去上层清液，离心分离出沉淀物，蒸馏水洗涤三次后，冷冻干燥制得石墨烯/羟基磷灰石复合粒子；

（4）将步骤（3）中所得到氧化石墨烯/羟基磷灰石复合粒子超声分散到浓度分别为5%-15%，35%-45%，55%-65%的丝素溶液，得到不同浓度的石墨烯/羟基磷灰石/丝素共混溶液，其中石墨烯/羟基磷灰石纳米复合粒子与丝素的质量比为65:35；

（5）将步骤（4）中制得的质量浓度最高的石墨烯/羟基磷灰石/丝素共混溶液倒入自制的模具中，在液氮条件骤冷后，于-50-80℃冷冻干燥，再将其它共混溶液按照质量浓度由高到低的顺序逐层冷冻干燥，制得密度和孔隙率呈梯度分布的多孔骨仿生材料。

6.根据如权利要求5所述的含有石墨烯/羟基磷灰石/丝素骨仿生材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中乙醇溶液的体积浓度是85%。