CN102188753B - 一种含有柞蚕丝素的纳米骨仿生材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含有柞蚕丝素的纳米骨仿生材料，它由羟基磷灰石、柞蚕丝素和壳聚糖组成，所述羟基磷灰石、柞蚕丝素和壳聚糖的质量比为1:0.1-0.5:0.1-0.5。本发明得到的含有柞蚕丝素的多孔纳米骨仿生材料具有大量互相连通的纳米尺度的微孔，并且具有较高的孔隙率；构成骨仿生材料的成分均具有良好的生物相容性，而且在结构上也仿生骨的结构；其中的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子在纳米级，并且与壳聚糖形成较强的结合力。本发明的骨仿生材料具有很好的力学性能、良好的成形性和合理的孔隙率，可以作为植入型的可降解骨修复材料。
Description
技术领域
本发明涉及一种含有柞蚕丝素的纳米骨仿生材料及其制备方法，应用于骨修复或骨替代材料，具体涉及生物医用材料技术领域。
背景技术
由于创伤、肿瘤或先天发育不足等导致人体骨组织缺损的现象非常普遍，特别是随着我国步入老年人社会，年老易引起硬组织病变如骨质疏松。因而，临床治疗对于骨替代材料有着巨大的需求。自体骨和异体骨是当前骨损伤修复效果最好的材料，自体骨易被患者接受，但是会给患者带来新的创伤和痛苦；异体骨取材简便，但是在生物安全性上存在免疫排斥和疾病传播的隐患。所以，临床上主要采用人工制备的材料作为骨组织修复材料。
目前用于骨组织修复的主要有金属、陶瓷和聚合物几大类。但是金属材料缺乏与人体组织结合的生物活性，陶瓷类材料主要存在质脆、在体内易于断裂和发生疲劳破坏等不足，聚合物可以具有人骨相近的模量，但不具备与骨组织形成生物键的活性。因此，寻找比较理想的材料用于骨组织修复仍然是临床上的一个难点。天然骨是是一种由约30%的有机基质和70%的羟基磷灰石构成的有机/无机生物复合材料，有机基质主要包括非胶原蛋白、粘多糖等。羟基磷灰石纳米晶体有序地嵌在胶原纤维基质中，有机和无机组元间的密切协同作用以及分子水平的独特组装，赋予了天然骨的多级结构和优异的力学性能。因此，要制备生物相容性和力学相容性好、有生物活性的骨修复或骨替代材料，需要从分子水平设计进行仿生设计，模仿天然骨的结构和功能。
柞蚕丝是我国特有的野蚕丝，其丝素含量超过80%，是相当纯的天然蛋白纤维。柞蚕丝素的氨基酸组成和天然人骨中的胶原蛋白相似，富含极性氨基酸和Arg-Gly-Asp（精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸，RGD）三肽序列，柞蚕丝素无毒、无刺激作用、具有良好的生物相容性和生物降解性，特别有利于细胞的粘附和增值，能够促进类成骨细胞的矿质化，但是因为天然柞蚕丝素的溶解困难，因而其在生物医用材料的运用上受到限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种含有柞蚕丝素的纳米骨仿生材料的制备方法。制备由纳米羟基磷灰石和柞蚕丝素自组装而成的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子，利用等静压技术使它和壳聚糖复合层压复合得到多孔骨仿生材料。这种骨仿生材料不仅在成分上模拟了天然骨，而且实现了结构上对天然骨的仿生，具有足够的力学性能、良好的骨诱导性能以及良好的生物相容性和生物降解性。
本发明的技术方案是：一种含有柞蚕丝素的纳米骨仿生材料，它由羟基磷灰石、柞蚕丝素和壳聚糖组成，其质量比为1:0.1-0.5:0.1-0.5，这种纳米骨仿生材料中含有50-1200纳米的相互连通的微孔，孔隙率为40%-80%。所述的壳聚糖分子量大于5000，脱乙酰度大于或等于90%，所述的柞蚕丝素蛋白分子的特性粘度[η]大于或等于0.50。
制备这种含有柞蚕丝素的纳米骨仿生材料的方法，其特征在于采用如下步骤：
（1）柞蚕茧在煮沸条件下放进重量百分浓度为0.1-5%的Na2CO3溶液中脱胶3次，浴比1:35，用热水冲洗3次，然后再40-100℃下烘干、剪碎。
（2）将步骤（1）中所得的柞蚕丝纤维在40-100℃条件下放入3-20mol/L的LiSCN溶液中高速搅拌溶解30-240分钟，浴比1:35。过滤得到柞蚕丝素溶解液。
（3）将步骤（2）中所得的柞蚕丝素溶解液装入透析袋，先置于清水中透析2天，再置于蒸馏水中透析1天，每2-4小时换一次水，透析后得到重量百分浓度为0.5-2%的柞蚕丝素溶液。
（4）将CaO溶于蒸馏水中得到0.01-0.07g/mL的Ca(OH)2悬浊液。将Ca(OH)2悬浊液和85 wt% H3PO 4溶液按1. 67的钙磷摩尔比在强力搅拌下同时滴入步骤（3）所得的柞蚕丝素溶液中，每克柞蚕丝素滴加0.02-0.10mol的钙离子，控制反应温度为30-90℃，利用氨水控制溶液的pH值为7.0-11.0。滴加结束后， 继续搅拌30-250分钟得到羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液。
（5）将步骤（4）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液室温静置40-50小时后除去上层清液，离心分离出沉淀物，蒸馏水洗涤三次后，放入冷冻干燥机冷冻干燥，随后研磨制得羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子。
（6）壳聚糖溶于1.0-6.0wt%的乙酸溶液中得到1-15 wt%的壳聚糖浓溶液。将步骤（5）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子和玉米朊粉末（作为致孔剂）按照质量比1:1-5充分混合后，加入壳聚糖浓溶液充分调和均匀。
（7）步骤（6）中调和均匀的产物在1-10MPa的低压力下预成型，冷冻干燥后接着在100-400MPa压力下等静压成型。将成型后的材料置于乙醇中超声振荡6-12h去除玉米朊。60-120℃烘干得到含有柞蚕丝素的多孔纳米骨仿生材料，其中羟基磷灰石、柞蚕丝素和壳聚糖的质量比为1:0.1-0.5:0.1-0.5。
本发明的有益效果是：本发明中羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子的长度为120nm～160nm、直径为30nm～40nm，由羟基磷灰石和柞蚕丝素蛋白分子自组装而成，柞蚕丝素蛋白层和羟基磷灰石层交替排列形成重复的片层结构。因而，含有柞蚕丝素的多孔纳米骨仿生材料在成分和结构上仿生天然骨，具有很好的生物相容性和生物活性；本发明中的另一种成分壳聚糖是一种天然的可生物降解多糖，具有无毒性、无刺激性、生物相容性好、细胞亲和性好、生物可降解性好等优良性能，利用其作为纳米粒子的粘合剂，壳聚糖和纳米粒子之间存在很强的作用力，使本发明的纳米骨仿生材料具有较好的强度；利用具有优良的成形性的壳聚糖进行粘合，结合等静压技术，采用不同形状的金属模具，可以容易的获得所需的形状和大小；另外，控制致孔剂的大小和含量，可以形成一定结构和含量的孔隙，充分满足骨移植过程中组织工程支架的需要。
本发明得到的含有柞蚕丝素的多孔纳米骨仿生材料具有大量互相连通的纳米尺度的微孔，并且具有较高的孔隙率；构成骨仿生材料的成分均具有良好的生物相容性，而且在结构上也仿生骨的结构；其中的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子在纳米级，并且与壳聚糖形成较强的结合力。本发明的骨仿生材料具有很好的力学性能、良好的成形性和合理的孔隙率，可以作为植入型的可降解骨修复材料。
附图说明
图1为含有柞蚕丝素的纳米骨仿生材料横截面结构的SEM照片。
具体实施方式
实施例1
（1）柞蚕茧在煮沸条件下放进重量百分浓度为1%的Na2CO3溶液中脱胶3次，浴比1:35，用热水冲洗3次，然后在60℃下烘干、剪碎；
（2）将步骤（1）中所得的柞蚕丝纤维在70℃下放入10 mol/L的LiSCN溶液中高速搅拌溶解100分钟，浴比1:35。过滤得到柞蚕丝素溶解液；
（3）将步骤（2）中所得的柞蚕丝素溶解液装入透析袋，先置于清水中透析2天，再置于蒸馏水中透析1天，每3小时换一次水，透析后得到重量百分浓度为1%的柞蚕丝素溶液；
（4）将CaO溶于蒸馏水中得到0.05g/mL的Ca(OH)2悬浊液。将1.48L的Ca(OH)2悬浊液和192.54g的85 wt% H3PO4溶液按1.67的钙磷摩尔比在强力搅拌下同时滴入2.86kg的步骤（3）所得的柞蚕丝素溶液中，控制反应温度为70℃，利用氨水控制溶液的pH值为9.0。滴加结束后，继续搅拌150分钟，得到羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液；
（5）将步骤（4）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液室温静置48小时后除去上层清液，离心分离出沉淀物，蒸馏水洗涤三次后，放入冷冻干燥机冷冻干燥，随后研磨制得120g羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子，其中羟基磷灰石组分100.4g，包埋到纳米复合粒子的实际柞蚕丝素组分为19.6g；
（6）壳聚糖溶于2.0 wt%的乙酸溶液中得到4%的壳聚糖浓溶液。将步骤（5）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子和玉米朊粉末（作为致孔剂）按照质量比1:1充分混合后，加入490g壳聚糖浓溶液充分调和均匀；
（7）步骤（6）中调和均匀的产物在3MPa的低压力下预成型，冷冻干燥后接着在250MPa压力下等静压成型。将成型后的材料置于乙醇中超声振荡8h去除玉米朊。80℃烘干得到含有柞蚕丝素的多孔纳米骨仿生材料，其中羟基磷灰石、柞蚕丝素和壳聚糖的质量比为1:0.195:0.195。制备的骨仿生材料的力学性能、密度和孔隙率如表1所示，横截面结构的SEM照片如图1（图中放大倍数为1万倍）所示，由图1可以看出，本发明制备的骨仿生材料内部分布着尺度在50-1200纳米的互相连通的微孔。
实施例2
（1）柞蚕茧在煮沸条件下放进重量百分浓度为0.5%的Na2CO3溶液中脱胶3次，浴比1:35，用热水冲洗3次，然后在70℃下烘干、剪碎；
（2）将步骤（1）中所得的柞蚕丝纤维在85℃下放入3 mol/L的LiSCN溶液中高速搅拌溶解240分钟，浴比1:35。过滤得到柞蚕丝素溶解液；
（3）将步骤（2）中所得的柞蚕丝素溶解液装入透析袋，先置于清水中透析2天，再置于蒸馏水中透析1天，每2小时换一次水，透析后得到重量百分浓度为0.5%的柞蚕丝素溶液；
（4）将CaO溶于蒸馏水中得到0.06g/mL的Ca(OH)2悬浊液。将2.467L的Ca(OH)2悬浊液和385.1g的85 wt% H3PO 4溶液按1.67的钙磷摩尔比在强力搅拌下同时滴入10kg步骤（3）所得的柞蚕丝素溶液中，控制反应温度为80℃，利用氨水控制溶液的pH值为8.0。滴加结束后，继续搅拌60分钟，得到羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液；
（5）将步骤（4）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液室温静置40小时后除去上层清液，离心分离出沉淀物，蒸馏水洗涤三次后，放入冷冻干燥机冷冻干燥，随后研磨制得246g羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子，其中羟基磷灰石组分200.8g，包埋到纳米复合粒子的实际柞蚕丝素组分为45.2g；
（6）壳聚糖溶于4.0 wt%的乙酸溶液中得到8%的壳聚糖浓溶液。将步骤（5）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子和玉米朊粉末（作为致孔剂）按照质量比1:2充分混合后，加入565g壳聚糖浓溶液充分调和均匀；
（7）步骤（6）中调和均匀的产物在1MPa的低压力下预成型，冷冻干燥后接着在350MPa压力下等静压成型。将成型后的材料置于乙醇中超声振荡12h去除玉米朊。80℃烘干得到含有柞蚕丝素的多孔纳米骨仿生材料，其中羟基磷灰石、柞蚕丝素和壳聚糖的质量比为1:0.225:0.225。制备的骨仿生材料的力学性能、密度和孔隙率如表1所示。
实施例3
（1）柞蚕茧在煮沸条件下放进重量百分浓度为2%的Na2CO3溶液中脱胶3次，浴比1:35，用热水冲洗3次，然后在50℃下烘干、剪碎；
（2）将步骤（1）中所得的柞蚕丝纤维在40℃下放入18 mol/L的LiSCN溶液中高速搅拌溶解35分钟，浴比1:35。过滤得到柞蚕丝素溶解液；
（3）将步骤（2）中所得的柞蚕丝素溶解液装入透析袋，先置于清水中透析2天，再置于蒸馏水中透析1天，每2.5小时换一次水，透析后得到重量百分浓度为1.5%的柞蚕丝素溶液；
（4）将CaO溶于蒸馏水中得到0.03g/mL的Ca(OH)2悬浊液。将2.467L的Ca(OH)2悬浊液和192.54g的85 wt% H3PO 4溶液按1.67的钙磷摩尔比在强力搅拌下同时滴入2.667kg步骤（3）所得的柞蚕丝素溶液中，控制反应温度为40℃，利用氨水控制溶液的pH值为10.0。滴加结束后，继续搅拌200分钟得到羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液；
（5）将步骤（4）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液室温静置45小时后除去上层清液，离心分离出沉淀物，蒸馏水洗涤三次后，放入冷冻干燥机冷冻干燥，随后研磨制得132.4g羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子。其中羟基磷灰石组分100.4g，包埋到纳米复合粒子的实际柞蚕丝素组分为32g；
（6）壳聚糖溶于5.0 wt%的乙酸溶液中得到12%的壳聚糖浓溶液。将步骤（5）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子和玉米朊粉末（作为致孔剂）按照质量比1:3.5充分混合后，加入266.7g壳聚糖浓溶液充分调和均匀；
（7）步骤（6）中调和均匀的产物在5MPa的低压力下预成型，冷冻干燥后接着在150MPa压力下等静压成型。将成型后的材料置于乙醇中超声振荡8h去除玉米朊。80℃烘干得到含有柞蚕丝素的多孔纳米骨仿生材料，其中羟基磷灰石、柞蚕丝素和壳聚糖的质量比为1:0.319:0.319。制备的骨仿生材料的力学性能、密度和孔隙率如表1所示。
实施例4
（1） 柞蚕茧在煮沸条件下放进重量百分浓度为3%的Na2CO3溶液中脱胶3次，浴比1:35，用热水冲洗3次，然后在90℃下烘干、剪碎；
（2）将步骤（1）中所得的柞蚕丝纤维在60℃下放入6.0 mol/L的LiSCN溶液中高速搅拌溶解78分钟，浴比1:35。过滤得到柞蚕丝素溶解液；
（3）将步骤（2）中所得的柞蚕丝素溶解液装入透析袋，先置于清水中透析2天，再置于蒸馏水中透析1天，每3小时换一次水，透析后得到重量百分浓度为1.8%的柞蚕丝素溶液；
（4）将CaO溶于蒸馏水中得到0.025g/mL的Ca(OH)2悬浊液。将5.92L的Ca(OH)2悬浊液和385.1g的85 wt% H3PO 4溶液按1.67的钙磷摩尔比在强力搅拌下同时滴入5.0kg步骤（3）所得的柞蚕丝素溶液中，控制反应温度为90℃，利用氨水控制溶液的pH值为9.5。滴加结束后，继续搅拌220分钟得到羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液；
（5）将步骤（4）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液室温静置42小时后除去上层清液，离心分离出沉淀物，蒸馏水洗涤三次后，放入冷冻干燥机冷冻干燥，随后研磨制得275.2g羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子。其中羟基磷灰石组分200.8g，包埋到纳米复合粒子的实际柞蚕丝素组分为74.4g；
（6）壳聚糖溶于3.2 wt%的乙酸溶液中得到7%的壳聚糖浓溶液。将步骤（5）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子和玉米朊粉末（作为致孔剂）按照质量比1:4充分混合后，加入1062.8g壳聚糖浓溶液充分调和均匀；
（7）步骤（6）中调和均匀的产物在9MPa的低压力下预成型，冷冻干燥后接着在280MPa压力下等静压成型。将成型后的材料置于乙醇中超声振荡10h去除玉米朊。110℃烘干得到含有柞蚕丝素的多孔纳米骨仿生材料，其中羟基磷灰石、柞蚕丝素和壳聚糖的质量比为1:0.37:0.37。制备的骨仿生材料的力学性能、密度和孔隙率如表1所示。
实施例5
（1）柞蚕茧在煮沸条件下放进重量百分浓度为4.5%的Na2CO3溶液中脱胶3次，浴比1:35，用热水冲洗3次，然后在78℃下烘干、剪碎；
（2）将步骤（1）中所得的柞蚕丝纤维在80℃下放入4.5 mol/L的LiSCN溶液中高速搅拌溶解130分钟，浴比1:35。过滤得到柞蚕丝素溶解液；
（3）将步骤（2）中所得的柞蚕丝素溶解液装入透析袋，先置于清水中透析2天，再置于蒸馏水中透析1天，每2小时换一次水，透析后得到重量百分浓度为0.9%的柞蚕丝素溶液；
（4）将CaO溶于蒸馏水中得到0.052g/mL的Ca(OH)2悬浊液。将1.423L的Ca(OH)2悬浊液和192.54g的85 wt% H3PO 4溶液按1. 67的钙磷摩尔比在强力搅拌下同时滴入2.222kg步骤（3）所得的柞蚕丝素溶液中，控制反应温度为75℃，利用氨水控制溶液的pH值为8.2。滴加结束后，继续搅拌145分钟得到羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液；
（5）将步骤（4）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液室温静置40小时后除去上层清液，离心分离出沉淀物，蒸馏水洗涤三次后，放入冷冻干燥机冷冻干燥，随后研磨制得115.1g羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子。其中羟基磷灰石组分100.4g，包埋到纳米复合粒子的实际柞蚕丝素组分为14.7g；
（6）壳聚糖溶于5.5 wt%的乙酸溶液中得到10%的壳聚糖浓溶液。将步骤（5）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子和玉米朊粉末（作为致孔剂）按照质量比1:3.2充分混合后，加入147g壳聚糖浓溶液充分调和均匀；
（7）步骤（6）中调和均匀的产物在9.5MPa的低压力下预成型，冷冻干燥后接着在320MPa压力下等静压成型。将成型后的材料置于乙醇中超声振荡12h去除玉米朊。100℃烘干得到含有柞蚕丝素的多孔纳米骨仿生材料，其中羟基磷灰石、柞蚕丝素和壳聚糖的质量比为1:0.146:0.146。制备的骨仿生材料的力学性能、密度和孔隙率如表1所示。
实施例6
（1）柞蚕茧在煮沸条件下放进重量百分浓度为0.4%的Na2CO3溶液中脱胶3次，浴比1:35，用热水冲洗3次，然后在65℃下烘干、剪碎；
（2）将步骤（1）中所得的柞蚕丝纤维在56℃下放入17.5 mol/L的LiSCN溶液中高速搅拌溶解55分钟，浴比1:35。过滤得到柞蚕丝素溶解液；
（3）将步骤（2）中所得的柞蚕丝素溶解液装入透析袋，先置于清水中透析2天，再置于蒸馏水中透析1天，每2.5小时换一次水，透析后得到重量百分浓度为1.2%的柞蚕丝素溶液；
（4）将CaO溶于蒸馏水中得到0.042g/mL的Ca(OH)2悬浊液。将3.524L的Ca(OH)2悬浊液和385.1g的85 wt% H3PO 4溶液按1.67的钙磷摩尔比在强力搅拌下同时滴入3.75kg步骤（3）所得的柞蚕丝素溶液中，控制反应温度为80℃，利用氨水控制溶液的pH值为10.2。滴加结束后，继续搅拌120分钟得到羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液；
（5）将步骤（4）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液室温静置45小时后除去上层清液，离心分离出沉淀物，蒸馏水洗涤三次后，放入冷冻干燥机冷冻干燥，随后研磨制得239.5g羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子。其中羟基磷灰石组分200.8g，包埋到纳米复合粒子的实际柞蚕丝素组分为38.7g；
（6）壳聚糖溶于2.5 wt%的乙酸溶液中得到3.5%的壳聚糖浓溶液。将步骤（5）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子和玉米朊粉末（作为致孔剂）按照质量比1:1.2充分混合后，加入1105.7g壳聚糖浓溶液充分调和均匀；
（7）步骤（6）中调和均匀的产物在3.5MPa的低压力下预成型，冷冻干燥后接着在210MPa压力下等静压成型。将成型后的材料置于乙醇中超声振荡7h去除玉米朊。110℃烘干得到含有柞蚕丝素的多孔纳米骨仿生材料，其中羟基磷灰石、柞蚕丝素和壳聚糖的质量比为1:0.193:0.193。制备的骨仿生材料的力学性能、密度和孔隙率如表1所示。
表1 含有柞蚕丝素的多孔纳米骨仿生材料的力学性能
Claims (1)
1.一种含有柞蚕丝素的纳米骨仿生材料的制备方法，所述含有柞蚕丝素的纳米骨仿生材料由羟基磷灰石、柞蚕丝素和壳聚糖组成，羟基磷灰石、柞蚕丝素和壳聚糖的质量比为1:0.1-0.5:0.1-0.5，其特征在于按以下步骤进行：
（1）制备质量百分浓度为0.5-2%的柞蚕丝素溶液，
① 柞蚕茧在煮沸条件下放进重量百分浓度为0.1-5%的Na2CO3溶液中脱胶3次，浴比1:35，用热水冲洗3次，然后在40-100℃下烘干、剪碎；
② 将步骤①中所得的柞蚕丝纤维在40-100℃条件下放入3-20mol/L的LiSCN溶液中高速搅拌溶解30-240分钟，浴比1:35，过滤得到柞蚕丝素溶解液；
③ 将步骤②中所得的柞蚕丝素溶解液装入透析袋，先置于清水中透析2天，再置于蒸馏水中透析1天，每2-4小时换一次水，透析后得到重量百分浓度为0.5-2%的柞蚕丝素溶液；
（2）制备0.01-0.07g/mL的Ca(OH)2悬浊液和质量百分浓度为85 %的H3PO4溶液，按钙与磷的物质的量之比为1.67:1的比例，将Ca(OH)2悬浊液和H3PO 4溶液在搅拌下同时滴入步骤（1）制备的柞蚕丝素溶液中，每克柞蚕丝素滴加0.02-0.10mol的钙离子，反应温度为30-90℃，利用氨水控制溶液的pH值为7.0-11.0，滴加结束后，继续搅拌30-250分钟得到羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液；
（3）将步骤（2）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子悬浊液室温静置40-50小时后除去上层清液，离心分离出沉淀物，蒸馏水洗涤三次后，放入冷冻干燥机冷冻干燥，然后研磨制得羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子；
（4）将壳聚糖溶于质量百分浓度为1.0-6.0%的乙酸溶液中，制备质量百分浓度为1-15 %的壳聚糖浓溶液，然后将步骤（3）所得的羟基磷灰石/柞蚕丝素纳米复合粒子和玉米朊粉末按照质量比1:1-5充分混合后，加入壳聚糖浓溶液充分调和均匀；
（5）步骤（4）中调和均匀的产物在1-10MPa的压力下预成型，冷冻干燥后接着在100-400MPa压力下等静压成型，将成型后的材料置于乙醇中超声振荡6-12h去除玉米朊，在60-120℃烘干得到含有柞蚕丝素的多孔纳米骨仿生材料。
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