CN106188609A - 一种l‑赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种l‑赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种L‑赖氨酸改性透明质酸衍生物的制备方法，属于生物医用材料领域。其制备方法为，首先利用碳二亚胺法将L‑赖氨酸‑铜络合物接枝于透明质酸分子上，经除铜离子后得到L‑赖氨酸改性透明质酸衍生物，然后与二元醛交联剂进行交联反应，再经硼氢化钠还原，形成L‑赖氨酸改性透明质酸水凝胶，具有生物相容性良好、力学性能稳定、形变恢复能力优异、吸水率大等优点。该水凝胶制备工艺简单、原料易得、反应条件温和。本发明的水凝胶在3D肿瘤模型构建、细胞递送、组织再生修复、医疗敷料等方面具有应用潜力。

Description

一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶及其制备方法。
背景技术
透明质酸是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖为二糖单位的以β-l,3和β-l,4糖苷链交替连接组成的一种线性粘多糖，广泛存在于人体皮肤、角膜、关节液、细胞外基质中，具有保持水分、调节细胞渗透压、促进细胞自我修复和软骨形成等生理功能。透明质酸具有良好的生物相容性、降解性以及黏弹性，改性条件温和、工艺简单，可修饰位点多，其羟基、羧基和乙酰基都可用于修饰改性，因而其研究备受青睐。近年来，以透明质酸为基本原料制备的水凝胶在生物医用材料领域受到广泛关注，在细胞三维培养、药物递送载体、支架材料、再生医学等领域具有广阔的应用前景。
在透明质酸研究与应用中，通常都需要对其进行改性，以满足要求，拓宽适用范围。常用改性方法有化学改性和复合改性两种，化学改性通过酯化、酰胺化、开环、交联、接枝等，复合改性是通过将透明质酸与其它聚合物共混改性或者形成聚电解质复合物实现[JXu,L Ai,HY Bai,et al.Research progress of modification of hyaluronicacid.Polymer Bulletin,2011,2:78-84]。鉴于透明质酸的优异性能，越来越多的研究者以改性为基础，设计制备新的功能化透明质酸衍生物，进一步发掘它的潜能，不断扩大其应用领域。生物体用来直接合成蛋白质的氨基酸有20种，L-赖氨酸作为其中重要一种，为人体必需氨基酸，与其他改性剂相比，具有安全无毒的优点。L-赖氨酸有两个氨基，可保护一个氨基，用另一个氨基进行反应，可见反应位点可控是其一大优点。
利用L-赖氨酸改性的透明质酸衍生物来制备性能优异的水凝胶，交联剂的选择起着十分重要的作用。常用的交联剂大致可分为两类，一类是化学合成的交联剂，另一类是生物交联剂。较为常用的交联剂有戊二醛、环氧化合物等。这些化学合成的交联剂虽然各有优点，但它们的一些缺点也是不容忽视的。由于这些交联剂具有明显的细胞毒性[DP Speer,MChvapil,CD Eskelson,et al.Biological effects of residual glutaraldehyde inglutaraldehyde---tanned collagen biomaterial.J Biomed Mater Res,1980,14:753-764；C Nishi,N Nakajima,Y Ikada,et al.In vitro evaluation of cytotoxicity ofdiepoxycopounds used for biomaterial modification.J Biomed Mater Res,1995,29:829-834]。戊二醛作为最早开始使用且一直在使用的交联剂，具有双官能团，能有效地与氨基进行交联，但大量研究表明其有细胞毒性，会加速组织钙化，使组织硬化，这极大地限制了其在关于生物相容性评价乃至活体实验方面的应用。
发明内容
为克服现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶及其制备方法，通过将L-赖氨酸接枝于透明质酸分子上，再与二元醛交联剂经希夫碱键交联形成水凝胶，最后利用硼氢化钠还原法将希夫碱中的碳氮双键还原，有效解决了二元醛的毒性问题，该水凝胶具有工艺简单、安全无毒、生物相容性良好、结构稳定、形变恢复能力优异等特点，可用于3D肿瘤模型构建、细胞/药物递送、组织再生修复、创伤敷料等方面。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，制备方法如下：
将L-赖氨酸改性透明质酸衍生物溶于水中形成质量浓度为1％～10％的溶液，向其中加入二元醛溶液，混合均匀后，转移至模具中室温交联反应0.5小时～4小时；接着，浸入硼氢化钠溶液中保持12小时～48小时，然后再在磷酸盐缓冲溶液中浸泡1天～3天，最后经冷冻干燥，得到L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶；其中，硼氢化钠的摩尔数是二元醛摩尔数的1～10倍，二元醛溶液中二元醛的质量为L-赖氨酸改性透明质酸衍生物质量的1％～20％。
本发明进一步的改进在于，所述的L-赖氨酸改性透明质酸衍生物的制备方法如下：
1)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到混合物，然后将该混合物煮沸2小时～4小时，热过滤，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为1:1～4:1；混合物中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为0.5～6％：
2)配制质量浓度为0.5％～2％的透明质酸水溶液，加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，然后将pH值调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌12小时～60小时，得到溶液；N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.22～0.99倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的2～10倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.2～0.9倍；
3)向步骤2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，搅拌下加入步骤2)到溶液2倍体积量的无水乙醇中，加入过程中出现沉淀，收集沉淀物，再将所得沉淀物溶于与步骤2)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；
将8-羟基喹啉溶于到氯仿中，得到溶液B；接着，将溶液B加入到溶液A中，搅拌12小时～48小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，透析3天后进行冷冻干燥，得到L-赖氨酸改性的透明质酸衍生物；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的1～5倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为0.5:1～1.5:1。
本发明进一步的改进在于，所述的透明质酸分子量为5000Da～3000kDa。
本发明进一步的改进在于，所述的透析所用的透析袋截留分子量为3500Da。
本发明进一步的改进在于，所述的冷冻干燥为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时。
本发明进一步的改进在于，混合均匀是通过磁力搅拌10分钟～30分钟实现的。
本发明进一步的改进在于，所述的硼氢化钠溶液的质量浓度为0.1％～10％。
本发明进一步的改进在于，所述的二元醛为丁二醛、戊二醛或己二醛；二元醛溶液的质量浓度为1％～20％。
本发明进一步的改进在于，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L，pH值为7.4；所述的在磷酸盐缓冲液中浸泡1天～3天，期间每隔2小时～5小时换一次磷酸盐缓冲液。
一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶，该水凝胶平均孔径为145μm，压缩模量为4kPa～10kPa。
与现有透明质酸水凝胶及制备技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)在透明质酸衍生物水凝胶形成中虽然采用了二元醛做交联剂，但通过硼氢化钠还原法将交联桥键中的碳氮双键转变为了碳氮单键，从根本上解决了降解产生毒性的二元醛问题，同时提高了水凝胶的力学稳定性和持久性，该水凝胶平均孔径为145μm，压缩模量为4kPa～10kPa。
(2)该水凝胶制备工艺简单、反应条件温和，通过调节二元醛与L-赖氨酸改性透明质酸衍生物的比例关系，使制备的L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的性能可控可调，适用范围广，可用于3D肿瘤模型构建、细胞/药物递送、组织修复、创伤敷料等方面。
进一步的，透明质酸用L-赖氨酸改性，原料易得，安全无毒，生物相容性优异。
进一步的，在利用L-赖氨酸接枝改性透明质酸时，采用了L-赖氨酸-铜络合物，既确保了反应位点，又有效保留了α-氨基酸端基，并且实验过程简便，反应效率高。
附图说明
图1为本发明实施例1获得的L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶试样的光学照片。
图2为本发明实施例1获得的L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的流变学性能。
图3为本发明实施例1获得的L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的压缩应力-应变曲线。
图4为本发明实施例1获得的L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的扫描电镜图，图4(a)放大倍数为35，图4(b)放大倍数为500。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步描述，但本发明并不限于此。
实施例1
1)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到混合物，然后将该混合物煮沸2小时～4小时，热过滤，滤渣用热水洗涤，洗涤液并入滤液，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为1.5:1；混合物中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为5％：
2)配制质量浓度为1％的透明质酸水溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，然后利用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH值调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌24小时，得到溶液；N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.44倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的4倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.4倍；其中，透明质酸分子量为170kDa。
3)向步骤2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，搅拌下缓慢加入步骤2)到溶液2倍体积量的无水乙醇中，加入过程中出现沉淀，收集沉淀物，再将所得沉淀物溶于与步骤2)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；
将8-羟基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的3倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为1:1，接着，将溶液B加入到溶液A中，磁力搅拌12小时～48小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，采用截留分子量为3500Da的透析袋透析3天后进行冷冻干燥，具体先在零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到L-赖氨酸改性的透明质酸衍生物。
4)将L-赖氨酸改性透明质酸衍生物溶于水中形成质量浓度为7％的溶液，向其中加入二元醛溶液，通过磁力搅拌10分钟，混合均匀后，转移至模具中室温交联反应4小时；接着，浸入质量浓度为0.5％的硼氢化钠溶液中保持24小时，然后再在浓度为10mmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡3天，期间每隔2小时换一次磷酸盐缓冲液，最后经冷冻干燥，具体先在零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶；其中，硼氢化钠的摩尔数是二元醛摩尔数的5倍，二元醛溶液中二元醛的质量为L-赖氨酸改性透明质酸衍生物质量的14％，二元醛为丁二醛，二元醛溶液的质量浓度为8％。
由本实施例获得的L-赖氨酸改性透明质酸水凝胶宏观光学照片、流变学性能和压缩应力-应变曲线、扫描电镜图片分别如图1、图2、图3和图4所示。由图1可知，L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶弹性性能很好；由图2可以看出，该水凝胶储能模量均远大于损耗模量，表明弹性性能好，且储能模量和损耗模量随着时间变化基本保持不变，说明该水凝胶结构稳定性好；由图3可知，该水凝胶压缩模量为6.3kPa，且压缩曲线与回弹曲线基本重合，说明该水凝胶形状恢复能力及弹性性能好。图4中两图放大倍数分别为35倍和500倍，从图4(a)可知该水凝胶呈现均匀多孔的结构，平均孔径约为145μm，从图4(b)可以看出其孔壁光滑无褶皱。
实施例2
1)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到混合物，然后将该混合物煮沸2小时，热过滤，滤渣用热水洗涤，洗涤液并入滤液，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为1:1；混合物中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为4％：
2)配制质量浓度为1.5％的透明质酸水溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，然后利用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH值调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌12小时，得到溶液；N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.22倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的10倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.7倍；其中，透明质酸分子量为5000Da。
3)向步骤2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，搅拌下缓慢加入步骤2)到溶液2倍体积量的无水乙醇中，加入过程中出现沉淀，收集沉淀物，再将所得沉淀物溶于与步骤2)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；
将8-羟基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的1倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为0.5:1，接着，将溶液B加入到溶液A中，磁力搅拌12小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，采用截留分子量为3500Da的透析袋透析3天后进行冷冻干燥，具体先在零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到L-赖氨酸改性的透明质酸衍生物。
4)将L-赖氨酸改性透明质酸衍生物溶于水中形成质量浓度为1％的溶液，向其中加入二元醛溶液，通过磁力搅拌20分钟，混合均匀后，转移至模具中室温交联反应1.5小时；接着，浸入质量浓度为0.1％的硼氢化钠溶液中保持48小时，然后再在浓度为10mmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡1天，期间每隔2小时换一次磷酸盐缓冲液，最后经冷冻干燥，具体先在零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶；其中，硼氢化钠的摩尔数是二元醛摩尔数的1倍，二元醛溶液中二元醛的质量为L-赖氨酸改性透明质酸衍生物质量的1％，二元醛为戊二醛，二元醛溶液的质量浓度为5％。
本实施例制得的水凝胶的压缩模量为4kPa。
实施例3
1)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到混合物，然后将该混合物煮沸3小时，热过滤，滤渣用热水洗涤，洗涤液并入滤液，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为2:1；混合物中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为2％：
2)配制质量浓度为0.5％的透明质酸水溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，然后利用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH值调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌45小时，得到溶液；N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.5倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的2倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.4倍；其中，透明质酸分子量为30kDa。
3)向步骤2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，搅拌下缓慢加入步骤2)到溶液2倍体积量的无水乙醇中，加入过程中出现沉淀，收集沉淀物，再将所得沉淀物溶于与步骤2)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；
将8-羟基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的2倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为1.5:1，接着，将溶液B加入到溶液A中，磁力搅拌20小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，采用截留分子量为3500Da的透析袋透析3天后进行冷冻干燥，具体先在零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到L-赖氨酸改性的透明质酸衍生物。
4)将L-赖氨酸改性透明质酸衍生物溶于水中形成质量浓度为5％的溶液，向其中加入二元醛溶液，通过磁力搅拌30分钟，混合均匀后，转移至模具中室温交联反应4小时；接着，浸入质量浓度为10％的硼氢化钠溶液中保持12小时，然后再在浓度为10mmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡2天，期间每隔5小时换一次磷酸盐缓冲液，最后经冷冻干燥，具体先在零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶；其中，硼氢化钠的摩尔数是二元醛摩尔数的10倍，二元醛溶液中二元醛的质量为L-赖氨酸改性透明质酸衍生物质量的20％，二元醛为己二醛，二元醛溶液的质量浓度为10％。
本实施例制得的水凝胶的压缩模量为10kPa。
实施例4
1)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到混合物，然后将该混合物煮沸4小时，热过滤，滤渣用热水洗涤，洗涤液并入滤液，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为3:1；混合物中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为0.5％：
2)配制质量浓度为1％的透明质酸水溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，然后利用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH值调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌60小时，得到溶液；N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.99倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的5倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.2倍；其中，透明质酸分子量为1000kDa。
3)向步骤2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，搅拌下缓慢加入步骤2)到溶液2倍体积量的无水乙醇中，加入过程中出现沉淀，收集沉淀物，再将所得沉淀物溶于与步骤2)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；
将8-羟基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的5倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为1.5:1，接着，将溶液B加入到溶液A中，磁力搅拌35小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，采用截留分子量为3500Da的透析袋透析3天后进行冷冻干燥，具体先在零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到L-赖氨酸改性的透明质酸衍生物。
4)将L-赖氨酸改性透明质酸衍生物溶于水中形成质量浓度为10％的溶液，向其中加入二元醛溶液，通过磁力搅拌10分钟，混合均匀后，转移至模具中室温交联反应0.5小时；接着，浸入质量浓度为3％的硼氢化钠溶液中保持20小时，然后再在浓度为10mmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡3天，期间每隔4小时换一次磷酸盐缓冲液，最后经冷冻干燥，具体先在零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶；其中，硼氢化钠的摩尔数是二元醛摩尔数的3倍，二元醛溶液中二元醛的质量为L-赖氨酸改性透明质酸衍生物质量的5％，二元醛为己二醛，二元醛溶液的质量浓度为20％。
实施例5
1)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到混合物，然后将该混合物煮沸2小时，热过滤，滤渣用热水洗涤，洗涤液并入滤液，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为4:1；混合物中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为6％：
2)配制质量浓度为2％的透明质酸水溶液，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，然后利用浓度均为1mol/L的NaOH溶液或盐酸将pH值调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌30小时，得到溶液；N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.7倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的8倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.9倍；其中，透明质酸分子量为3000kDa。
3)向步骤2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，搅拌下缓慢加入步骤2)到溶液2倍体积量的无水乙醇中，加入过程中出现沉淀，收集沉淀物，再将所得沉淀物溶于与步骤2)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；
将8-羟基喹啉溶于氯仿中，得到溶液B；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的4倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为1:1，接着，将溶液B加入到溶液A中，磁力搅拌48小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，采用截留分子量为3500Da的透析袋透析3天后进行冷冻干燥，具体先在零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到L-赖氨酸改性的透明质酸衍生物。
4)将L-赖氨酸改性透明质酸衍生物溶于水中形成质量浓度为7％的溶液，向其中加入二元醛溶液，通过磁力搅拌15分钟，混合均匀后，转移至模具中室温交联反应3小时；接着，浸入质量浓度为7％的硼氢化钠溶液中保持30小时，然后再在浓度为10mmol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中浸泡1.5天，期间每隔3小时换一次磷酸盐缓冲液，最后经冷冻干燥，具体先在零下20℃保持72小时、20℃保持4小时，得到L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶；其中，硼氢化钠的摩尔数是二元醛摩尔数的8倍，二元醛溶液中二元醛的质量为L-赖氨酸改性透明质酸衍生物质量的12％，二元醛为己二醛，二元醛溶液的质量浓度为1％。
本发明用L-赖氨酸来改性透明质酸，并用这种透明质酸衍生物与二元醛交联形成水凝胶，并通过硼氢化钠还原交联化学键希夫碱来解决二元醛的毒性问题，使水凝胶中席夫碱的碳氮双键变成碳氮单键，从而具有更好的结构稳定性。该水凝胶力学性能优异、弹性好、吸水率大，主要成分为生物相容性好的透明质酸和L-赖氨酸，在3D肿瘤模型、细胞/药物递送、组织再生修复、创伤敷料等方面可发挥重要作用。

Claims (10)

1.一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，制备方法如下：
将L-赖氨酸改性透明质酸衍生物溶于水中形成质量浓度为1％～10％的溶液，向其中加入二元醛溶液，混合均匀后，转移至模具中室温交联反应0.5小时～4小时；接着，浸入硼氢化钠溶液中保持12小时～48小时，然后再在磷酸盐缓冲溶液中浸泡1天～3天，最后经冷冻干燥，得到L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶；其中，硼氢化钠的摩尔数是二元醛摩尔数的1～10倍，二元醛溶液中二元醛的质量为L-赖氨酸改性透明质酸衍生物质量的1％～20％。
2.根据权利要求1中所述的一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的L-赖氨酸改性透明质酸衍生物的制备方法如下：
1)将L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜加入到水中，得到混合物，然后将该混合物煮沸2小时～4小时，热过滤，将滤液冷冻干燥，得到L-赖氨酸-铜络合物；其中L-赖氨酸单盐酸盐与碱式碳酸铜的摩尔比为1:1～4:1；混合物中L-赖氨酸单盐酸盐的质量浓度为0.5％～6％：
2)配制质量浓度为0.5％～2％的透明质酸水溶液，加入N-羟基琥珀酰亚胺、L-赖氨酸-铜络合物和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，然后将pH值调至5.0～5.5，在室温下继续搅拌12小时～60小时，得到溶液；N-羟基琥珀酰亚胺的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.22～0.99倍，L-赖氨酸-铜络合物的用量为透明质酸重复单元摩尔数的2～10倍，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为透明质酸重复单元摩尔数的0.2～0.9倍；
3)向步骤2)中溶液加入NaCl，完全溶解后，搅拌下加入步骤2)到溶液2倍体积量的无水乙醇中，加入过程中出现沉淀，收集沉淀物，再将所得沉淀物溶于与步骤2)溶液等体积量的水中，得到溶液A；其中，每100mL溶液中加入10g NaCl；
将8-羟基喹啉溶于到氯仿中，得到溶液B；接着，将溶液B加入到溶液A中，搅拌12小时～48小时后过滤去除固体，水相用溶液B洗至无色，透析3天后进行冷冻干燥，得到L-赖氨酸改性的透明质酸衍生物；其中，8-羟基喹啉的摩尔量是L-赖氨酸-铜络合物中铜离子的1～5倍，氯仿的体积与A溶液的体积比为0.5:1～1.5:1。
3.根据权利要求2中所述的一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的透明质酸分子量为5000Da～3000kDa。
4.根据权利要求2中所述的一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的透析所用的透析袋截留分子量为3500Da。
5.根据权利要求2中所述的一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的冷冻干燥为零下20℃保持72小时、20℃保持4小时。
6.根据权利要求1中所述的一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，混合均匀是通过磁力搅拌10分钟～30分钟实现的。
7.根据权利要求1中所述的一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的硼氢化钠溶液的质量浓度为0.1％～10％。
8.根据权利要求1中所述的一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的二元醛为丁二醛、戊二醛或己二醛；二元醛溶液的质量浓度为1％～20％。
9.根据权利要求1中所述的一种L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为10mmol/L，pH值为7.4；所述的在磷酸盐缓冲液中浸泡1天～3天，期间每隔2小时～5小时换一次磷酸盐缓冲液。
10.一种如权利要求1中所述方法制备的L-赖氨酸改性透明质酸衍生物水凝胶，其特征在于，该水凝胶平均孔径为145μm，压缩模量为4kPa～10kPa。
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