CN114196041A - 一种用于细胞培养的功能性微凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于细胞培养的功能性微凝胶，所述功能性微凝胶是以MOFs材料为基本骨架，然后在其表面依次修饰聚多巴胺层、细菌纤维素强化γ‑聚谷氨酸/海藻酸钠复合凝胶层。本发明还公开了该功能性微凝胶的制备方法。该微凝胶材料不仅具有良好的生物降解性和细胞粘附性，且稳定性好。

Description

一种用于细胞培养的功能性微凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种用于细胞培养的的功能性微凝胶及其制备方法。
背景技术
随着工业现代化的发展，骨组织坏死、骨关节创伤等导致了大量的骨缺损患者。传统的治疗手段如骨自体移植和异体移植受供体短缺和免疫排斥等副作用的限制，难以满足实际临床需要。人工替代物在体内无法降解，容易松动和断裂，还可能造成二次创伤。近年来，骨组织工程作为替代修复手段引起了广泛的兴趣和关注，旨在利用种子细胞、细胞支架和生物活性因子的相互整合对骨缺损部位进行填充并实现骨组织再生的目的。支架材料是影响骨修复效果的关键因素，并决定了临床应用的可操作性和产业化的实现。理想的支架材料应支持细胞活动，使细胞更易进行黏附、增殖和分化，并且对组织没有任何的毒性作用。支架必须是可降解的，以便被体内的再生组织进行取代，并且需要具备一定的机械强度，以承受手术过程和在体内提供一定物理支撑力。另外，它需要能够渗透必需的营养素和氧气流以供给细胞存活。目前用于生物工程的支架材料虽然具有很好的生物降解性和细胞粘附性，但是一般稳定性较差，不利于支持细胞的长期培养。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种用于细胞培养的功能性微凝胶，该微凝胶材料不仅具有良好的生物降解性和细胞粘附性，且稳定性好。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种用于细胞培养的功能性微凝胶，所述功能性微凝胶是以MOFs材料为基本骨架，然后在其表面依次修饰聚多巴胺层、细菌纤维素强化γ-聚谷氨酸/海藻酸钠复合凝胶层。
为了更好的解决上述技术问题，本发明还提供了如下技术方案：
一种用于细胞培养的功能性微凝胶的制备方法，包括以下步骤：
(1)将锌盐溶于甲醇中，然后加入2-甲基咪唑的甲醇溶液，室温下进行第一次搅拌反应，反应结束后将反应液过滤，将过滤后的固体加入到多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中，室温下进行第二次搅拌反应，反应结束后将反应液进行过滤，并将过滤得到的固体洗涤至中性，制得聚多巴胺修饰的锌基MOF材料；
(2)将木醋杆菌接种于培养基中进行培养，培养得到的细菌纤维膜置于去离子水中加热处理，然后置于氢氧化钠溶液中加热处理，之后采用去离子水洗涤至中性，并将细菌纤维素膜进行冷冻干燥后粉碎，制得细菌纤维素；
(3)将醛基功能化的海藻酸钠以及氨基化聚谷氨酸分别溶于pH为7.4的PBS溶液中，然后迅速混合后，加入细菌纤维素，制得的混合液与聚多巴胺修饰的锌基MOF材料混合凝胶化处理，制得功能性微凝胶。
作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述锌盐为乙酸锌，多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液的浓度为1mg/ml，所述乙酸锌、2-甲基咪唑、多巴胺的质量比为1：(5-6)：10。
作为上述技术方案的优选，步骤(1)中，所述第一次搅拌反应的时间为10-12h，转速为200-400转/分；所述第二次搅拌反应的时间为10-12h，转速为500-800转/分。
作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述培养基以重量份计包括2-3份葡萄糖、3-5份酵母提取物、8-12份胰蛋白胨、2-3份磷酸氢二钠和1000份蒸馏水。
作为上述技术方案的优选，步骤(2)中，所述培养的温度为30℃，培养的时间为7-8天，在去离子水中加热处理的温度为85-95℃，时间为1.5-2h；氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/L，在氢氧化钠溶液中加热处理的温度为95-100℃，时间为10-20min。
作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，细菌纤维素、醛基功能化的海藻酸钠、氨基化聚谷氨酸的质量比为(0.8-1)：1:1。
作为上述技术方案的优选，步骤(3)中，醛基功能化的海藻酸钠的制备方法具体为：向质量浓度为2-5％的海藻酸钠溶液中加入高碘酸钠进行搅拌氧化反应，反应结束后滴加乙二醇终止反应后再加入氯化钠混合后加入到无水乙醇中进行沉淀，然后过滤，过滤得到的沉淀干燥后重新溶解于去离子水中进行透析，之后进行冷冻干燥，制得醛基功能化的海藻酸钠。
作为上述技术方案的优选，所述海藻酸钠与高碘酸钠的摩尔比为1：(3-5)；搅拌氧化反应的条件为避光，搅拌转速为500-700转/分，反应时间为24h；氯化钠与海藻酸钠的质量比为2：1；透析的时间为24h。
作为上述技术方案的优选，所述氨基化聚谷氨酸的制备方法为：调节γ-聚谷氨酸溶液的pH至4.5，然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，常温反应，反应结束后调节反应液pH至8.5，向反应液中加入己二酸二酰肼，反应，反应结束后调节反应体系的pH至中性，并将反应液进行透析，将得到的产物进行冷冻干燥制得氨基化聚谷氨酸。
作为上述技术方案的优选，所述γ-聚谷氨酸的质量浓度为5-6％，所述γ-聚谷氨酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、己二酸二酰肼的质量比为1：(0.5-0.6)：(0.3-0.5)：(2-3)；常温反应的时间为10-15min，加入己二酸二酰肼后的反应时间为20-25h；透析时间为2-3d。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果如下：
本发明提供的微凝胶是以MOFs材料为基本骨架，然后在其表面依次修饰聚多巴胺层、细菌纤维素强化γ-聚谷氨酸/海藻酸钠复合凝胶层；M0F材料具有较高的孔隙率且比表面积大，在其表面修饰一层聚多巴胺层来改善其水分散性，且方便进一步功能化处理，之后在聚多巴胺层表面修饰细菌纤维素强化γ-聚谷氨酸/海藻酸钠复合凝胶层，γ-聚谷氨酸和海藻酸钠都具有很好的生物相容性，且具有一定的生物降解性，可有效促进细胞粘附和增殖，细菌纤维素的改性有效提高了复合凝胶层的力学性能。本发明提供的微凝胶性能优异，且制备方法简单。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下述实施例中采用的培养基以重量份计包括2份葡萄糖、5份酵母提取物、12份胰蛋白胨、份磷酸氢二钠和1000份蒸馏水。
实施例1
将1g乙酸锌溶于50ml甲醇中，然后加入含有5.5g 2-甲基咪唑的甲醇溶液，室温、200-400转/分的条件下第一次搅拌反应11h，反应结束后将反应液过滤，将过滤后的固体加入到含有10g多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中，室温、500转/分的条件下进行第二次搅拌反应10h，反应结束后将反应液进行过滤，并将过滤得到的固体洗涤至中性，制得聚多巴胺修饰的锌基MOF材料；
将木醋杆菌接种于培养基中在30℃下进行培养7天，培养得到的细菌纤维膜置于去离子水中在90℃下加热处理2h，然后置于0.5mol/L的氢氧化钠溶液中在100℃下加热处理10min，之后采用去离子水洗涤至中性，并将细菌纤维素膜在-20℃下进行冷冻干燥20h后粉碎，制得细菌纤维素；
向50ml质量浓度为5％的海藻酸钠溶液中加入9.85g高碘酸钠，在避光、500转/分的条件下进行搅拌氧化反应24h，反应结束后滴加3ml乙二醇终止反应后再加入1.25g氯化钠混合后加入到无水乙醇中进行沉淀，然后过滤，过滤得到的沉淀干燥后重新溶解于去离子水中进行透析24h，之后进行冷冻干燥，制得醛基功能化的海藻酸钠；
将50ml浓度为5wt％的γ-聚谷氨酸溶液的pH调节至4.5，然后加入1.25g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和1g N-羟基琥珀酰亚胺，常温反应10min，反应结束后调节反应液pH至8.5，向反应液中加入5g己二酸二酰肼，反应24h，反应结束后调节反应体系的pH至中性，并将反应液进行透析3天，将得到的产物进行冷冻干燥制得氨基化聚谷氨酸。
将1g醛基功能化的海藻酸钠以及1g氨基化聚谷氨酸分别溶于20ml pH为7.4的PBS溶液中，然后迅速混合后，加入1g细菌纤维素，制得的混合液与上述制得的聚多巴胺修饰的锌基MOF材料混合凝胶化处理10min，干燥，制得功能性微凝胶。
实施例2
将1g乙酸锌溶于50ml甲醇中，然后加入含有5.5g 2-甲基咪唑的甲醇溶液，室温、400转/分的条件下第一次搅拌反应11h，反应结束后将反应液过滤，将过滤后的固体加入到含有10g多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中，室温、500-800转/分的条件下进行第二次搅拌反应10h，反应结束后将反应液进行过滤，并将过滤得到的固体洗涤至中性，制得聚多巴胺修饰的锌基MOF材料；
将木醋杆菌接种于培养基中在30℃下进行培养8天，培养得到的细菌纤维膜置于去离子水中在90℃下加热处理2h，然后置于0.5mol/L的氢氧化钠溶液中在100℃下加热处理10min，之后采用去离子水洗涤至中性，并将细菌纤维素膜在-20℃下进行冷冻干燥24h后粉碎，制得细菌纤维素；
向50ml质量浓度为5％的海藻酸钠溶液中加入9.85g高碘酸钠，在避光、700转/分的条件下进行搅拌氧化反应24h，反应结束后滴加3ml乙二醇终止反应后再加入1.25g氯化钠混合后加入到无水乙醇中进行沉淀，然后过滤，过滤得到的沉淀干燥后重新溶解于去离子水中进行透析24h，之后进行冷冻干燥，制得醛基功能化的海藻酸钠；
将50ml浓度为5wt％的γ-聚谷氨酸溶液的pH调节至4.5，然后加入1.25g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和1g N-羟基琥珀酰亚胺，常温反应10min，反应结束后调节反应液pH至8.5，向反应液中加入5g己二酸二酰肼，反应24h，反应结束后调节反应体系的pH至中性，并将反应液进行透析3天，将得到的产物进行冷冻干燥制得氨基化聚谷氨酸。
将1g醛基功能化的海藻酸钠以及1g氨基化聚谷氨酸分别溶于20ml pH为7.4的PBS溶液中，然后迅速混合后，加入1g细菌纤维素，制得的混合液与上述制得的聚多巴胺修饰的锌基MOF材料混合凝胶化处理10min，干燥，制得功能性微凝胶。
实施例3
将1g乙酸锌溶于50ml甲醇中，然后加入含有5.5g 2-甲基咪唑的甲醇溶液，室温、200-400转/分的条件下第一次搅拌反应11h，反应结束后将反应液过滤，将过滤后的固体加入到含有10g多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中，室温、500-800转/分的条件下进行第二次搅拌反应10h，反应结束后将反应液进行过滤，并将过滤得到的固体洗涤至中性，制得聚多巴胺修饰的锌基MOF材料；
将木醋杆菌接种于培养基中在30℃下进行培养7天，培养得到的细菌纤维膜置于去离子水中在90℃下加热处理2h，然后置于0.5mol/L的氢氧化钠溶液中在100℃下加热处理10min，之后采用去离子水洗涤至中性，并将细菌纤维素膜在-20℃下进行冷冻干燥22h后粉碎，制得细菌纤维素；
向50ml质量浓度为5％的海藻酸钠溶液中加入9.85g高碘酸钠，在避光、600转/分的条件下进行搅拌氧化反应24h，反应结束后滴加3ml乙二醇终止反应后再加入1.25g氯化钠混合后加入到无水乙醇中进行沉淀，然后过滤，过滤得到的沉淀干燥后重新溶解于去离子水中进行透析24h，之后进行冷冻干燥，制得醛基功能化的海藻酸钠；
将50ml浓度为5wt％的γ-聚谷氨酸溶液的pH调节至4.5，然后加入1.25g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和1g N-羟基琥珀酰亚胺，常温反应10min，反应结束后调节反应液pH至8.5，向反应液中加入5g己二酸二酰肼，反应24h，反应结束后调节反应体系的pH至中性，并将反应液进行透析3天，将得到的产物进行冷冻干燥制得氨基化聚谷氨酸。
将1g醛基功能化的海藻酸钠以及1g氨基化聚谷氨酸分别溶于20ml pH为7.4的PBS溶液中，然后迅速混合后，加入1g细菌纤维素，制得的混合液与上述制得的聚多巴胺修饰的锌基MOF材料混合凝胶化处理10min，干燥，制得功能性微凝胶。
实施例4
将1g乙酸锌溶于50ml甲醇中，然后加入含有5.5g 2-甲基咪唑的甲醇溶液，室温、200-400转/分的条件下第一次搅拌反应11h，反应结束后将反应液过滤，将过滤后的固体加入到含有10g多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中，室温、700转/分的条件下进行第二次搅拌反应10h，反应结束后将反应液进行过滤，并将过滤得到的固体洗涤至中性，制得聚多巴胺修饰的锌基MOF材料；
将木醋杆菌接种于培养基中在30℃下进行培养7天，培养得到的细菌纤维膜置于去离子水中在90℃下加热处理2h，然后置于0.5mol/L的氢氧化钠溶液中在100℃下加热处理10min，之后采用去离子水洗涤至中性，并将细菌纤维素膜在-20℃下进行冷冻干燥23h后粉碎，制得细菌纤维素；
向50ml质量浓度为5％的海藻酸钠溶液中加入9.85g高碘酸钠，在避光、650转/分的条件下进行搅拌氧化反应24h，反应结束后滴加3ml乙二醇终止反应后再加入1.25g氯化钠混合后加入到无水乙醇中进行沉淀，然后过滤，过滤得到的沉淀干燥后重新溶解于去离子水中进行透析24h，之后进行冷冻干燥，制得醛基功能化的海藻酸钠；
将50ml浓度为5wt％的γ-聚谷氨酸溶液的pH调节至4.5，然后加入1.25g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和1g N-羟基琥珀酰亚胺，常温反应10min，反应结束后调节反应液pH至8.5，向反应液中加入5g己二酸二酰肼，反应24h，反应结束后调节反应体系的pH至中性，并将反应液进行透析3天，将得到的产物进行冷冻干燥制得氨基化聚谷氨酸。
将1g醛基功能化的海藻酸钠以及1g氨基化聚谷氨酸分别溶于20ml pH为7.4的PBS溶液中，然后迅速混合后，加入1g细菌纤维素，制得的混合液与上述制得的聚多巴胺修饰的锌基MOF材料混合凝胶化处理10min，干燥，制得功能性微凝胶。
实施例5
将1g乙酸锌溶于50ml甲醇中，然后加入含有5.5g 2-甲基咪唑的甲醇溶液，室温、350转/分的条件下第一次搅拌反应11h，反应结束后将反应液过滤，将过滤后的固体加入到含有10g多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中，室温、500-800转/分的条件下进行第二次搅拌反应10h，反应结束后将反应液进行过滤，并将过滤得到的固体洗涤至中性，制得聚多巴胺修饰的锌基MOF材料；
将木醋杆菌接种于培养基中在30℃下进行培养8天，培养得到的细菌纤维膜置于去离子水中在90℃下加热处理2h，然后置于0.5mol/L的氢氧化钠溶液中在100℃下加热处理10min，之后采用去离子水洗涤至中性，并将细菌纤维素膜在-20℃下进行冷冻干燥20-24h后粉碎，制得细菌纤维素；
向50ml质量浓度为5％的海藻酸钠溶液中加入9.85g高碘酸钠，在避光、5500转/分的条件下进行搅拌氧化反应24h，反应结束后滴加3ml乙二醇终止反应后再加入1.25g氯化钠混合后加入到无水乙醇中进行沉淀，然后过滤，过滤得到的沉淀干燥后重新溶解于去离子水中进行透析24h，之后进行冷冻干燥，制得醛基功能化的海藻酸钠；
将50ml浓度为5wt％的γ-聚谷氨酸溶液的pH调节至4.5，然后加入1.25g1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和1g N-羟基琥珀酰亚胺，常温反应10min，反应结束后调节反应液pH至8.5，向反应液中加入5g己二酸二酰肼，反应24h，反应结束后调节反应体系的pH至中性，并将反应液进行透析3天，将得到的产物进行冷冻干燥制得氨基化聚谷氨酸。
将1g醛基功能化的海藻酸钠以及1g氨基化聚谷氨酸分别溶于20ml pH为7.4的PBS溶液中，然后迅速混合后，加入1g细菌纤维素，制得的混合液与上述制得的聚多巴胺修饰的锌基MOF材料混合凝胶化处理10min，干燥，制得功能性微凝胶。
对上述实施例中制得的功能性微凝胶进行性能测试，结果如表1所示。
表1
水接触角，° 压缩模量，kPa
实施例1 33.895 108.5
实施例2 33.796 107.9
实施例3 33.851 108.3
实施例4 33.809 108.5
实施例5 33.902 108.5
从上述测试结果可以看出，本发明提供的功能性微凝胶不仅具有良好的细胞粘附性，且力学性能好。
此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于细胞培养的功能性微凝胶，其特征在于，所述功能性微凝胶是以MOFs材料为基本骨架，然后在其表面依次修饰聚多巴胺层、细菌纤维素强化γ-聚谷氨酸/海藻酸钠复合凝胶层。
2.根据权利要求1所述的一种用于细胞培养的功能性微凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将锌盐溶于甲醇中，然后加入2-甲基咪唑的甲醇溶液，室温下进行第一次搅拌反应，反应结束后将反应液过滤，将过滤后的固体加入到多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液中，室温下进行第二次搅拌反应，反应结束后将反应液进行过滤，并将过滤得到的固体洗涤至中性，制得聚多巴胺修饰的锌基MOF材料；
(2)将木醋杆菌接种于培养基中进行培养，培养得到的细菌纤维膜置于去离子水中加热处理，然后置于氢氧化钠溶液中加热处理，之后采用去离子水洗涤至中性，并将细菌纤维素膜进行冷冻干燥后粉碎，制得细菌纤维素；
(3)将醛基功能化的海藻酸钠以及氨基化聚谷氨酸分别溶于pH为7.4的PBS溶液中，然后迅速混合后，加入细菌纤维素，制得的混合液与聚多巴胺修饰的锌基MOF材料混合凝胶化处理，制得功能性微凝胶。
3.根据权利要求2所述的一种用于细胞培养的功能性微凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述锌盐为乙酸锌，多巴胺的Tris-HCl缓冲溶液的浓度为1mg/ml，所述乙酸锌、2-甲基咪唑、多巴胺的质量比为1：(5-6)：10；所述第一次搅拌反应的时间为10-12h，转速为200-400转/分；所述第二次搅拌反应的时间为10-12h，转速为500-800转/分。
4.根据权利要求2所述的一种用于细胞培养的功能性微凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养基以重量份计包括2-3份葡萄糖、3-5份酵母提取物、8-12份胰蛋白胨、2-3份磷酸氢二钠和1000份蒸馏水。
5.根据权利要求2所述的一种用于细胞培养的功能性微凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述培养的温度为30℃，培养的时间为7-8天，在去离子水中加热处理的温度为85-95℃，时间为1.5-2h；氢氧化钠溶液的浓度为0.5mol/L，在氢氧化钠溶液中加热处理的温度为95-100℃，时间为10-20min。
6.根据权利要求2所述的一种用于细胞培养的功能性微凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，细菌纤维素、醛基功能化的海藻酸钠、氨基化聚谷氨酸的质量比为(0.8-1)：1:1。
7.根据权利要求2所述的一种用于细胞培养的功能性微凝胶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，醛基功能化的海藻酸钠的制备方法具体为：向质量浓度为2-5％的海藻酸钠溶液中加入高碘酸钠进行搅拌氧化反应，反应结束后滴加乙二醇终止反应后再加入氯化钠混合后加入到无水乙醇中进行沉淀，然后过滤，过滤得到的沉淀干燥后重新溶解于去离子水中进行透析，之后进行冷冻干燥，制得醛基功能化的海藻酸钠。
8.根据权利要求7所述的一种用于细胞培养的功能性微凝胶的制备方法，其特征在于，所述海藻酸钠与高碘酸钠的摩尔比为1：(3-5)；搅拌氧化反应的条件为避光，搅拌转速为500-700转/分，反应时间为24h；氯化钠与海藻酸钠的质量比为2：1；透析的时间为24h。
9.根据权利要求2所述的一种用于细胞培养的功能性微凝胶的制备方法，其特征在于，所述氨基化聚谷氨酸的制备方法为：调节γ-聚谷氨酸溶液的pH至4.5，然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，常温反应，反应结束后调节反应液pH至8.5，向反应液中加入己二酸二酰肼，反应，反应结束后调节反应体系的pH至中性，并将反应液进行透析，将得到的产物进行冷冻干燥制得氨基化聚谷氨酸。
10.根据权利要求9所述的一种用于细胞培养的功能性微凝胶的制备方法，其特征在于，所述γ-聚谷氨酸的质量浓度为5-6％，所述γ-聚谷氨酸、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、己二酸二酰肼的质量比为1：(0.5-0.6)：(0.3-0.5)：(2-3)；常温反应的时间为10-15min，加入己二酸二酰肼后的反应时间为20-25h；透析时间为2-3d。
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