WO2015085633A1 - 一种基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶及其制备方法 - Google Patents

一种基于γ-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶及其制备方法 Download PDF

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迟波
夏军
李莎
冯小海
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    • C08J2377/04—Polyamides derived from alpha-amino carboxylic acids
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Definitions

  • the invention relates to a method for preparing a biocompatible hydrogel, in particular to obtain a hydrogel of a biocompatible y-polyglutamic acid and polylysine crosslinked polymer by chemical crosslinking.
  • the preparation method of the glue is a method for preparing a biocompatible hydrogel, in particular to obtain a hydrogel of a biocompatible y-polyglutamic acid and polylysine crosslinked polymer by chemical crosslinking.
  • the skin is an important organ of the human body. Due to trauma, burns, etc., it may cause extensive skin damage, which may lead to complications and endanger human life. How to effectively promote the rapid healing of wounds has been a subject of unremitting exploration by the medical community.
  • the traditional view is that it is necessary to create a dry environment for the wound as much as possible, reduce the chance of infection and facilitate wound healing.
  • a moist, uninfected environment is most beneficial to the continuous tissue repair process [Wound repair and regeneration, 2009 (17): 505-510]. Under the guidance of this theory of "wet wound healing", the research and application of medical polymer hydrogel wound dressings has gradually emerged, gradually replacing traditional dressings for various types of ulceration and wound wounds.
  • Hydrogel is a three-dimensional crosslinked network structural material capable of absorbing and retaining a large amount of water but not being soluble in water. Its network is composed of a macromolecular backbone and a hydrophilic functional group, and is a functional polymer that absorbs water and retains water. The material has unique properties such as high mechanical strength, biodegradability, high swelling ratio, biocompatibility and stimuli responsiveness.
  • Polymer hydrogel wound dressing is a major application of hydrogel in medical materials and is a new type of dressing product developed in recent years. Traditionally, doctors usually use sterile gauze and topical antibiotics to treat wounds. Gauze easily adheres to skin wound tissue.
  • hydrogel dressing can effectively overcome the above disadvantages, has good water vapor and gas permeability, does not adhere to the wound, and is easy to replace.
  • Hydrogel dressings can incorporate pharmaceutical ingredients and growth factors to promote wound healing, and the hydrogel material itself has a large heat capacity and a gentle cooling effect on the wound to reduce wound pain. Therefore, domestic and foreign scholars have carried out extensive research on hydrogel dressings and achieved considerable results.
  • y-polyglutamic acid and polylysine are currently the only two naturally occurring amino acid homopolymers, both of which are produced by microbial fermentation.
  • the molecular weight of y-polyglutamic acid varies from 100,000 to 2 million Daltons, and can be degraded into glutamic acid monomers in the living body, which is absorbed by the body and has no toxic side effects.
  • Polylysine has a molecular weight between 3,000 and 5,000 Daltons. It is similar to the protein components and functions in the natural extracellular matrix (ECM).
  • Polylysine itself is a polycation, which is easy to react with polyanions. Electrical action, good penetration of biofilm.
  • the advantages of y-polyglutamic acid and polylysine are more obvious than those of traditional gel materials. Both of them have excellent degradability and biocompatibility in vivo, and will not cause rejection of the body.
  • US Patent 2003/0211129 Al reports the preparation of a film using polyglutamic acid and polylysine as raw materials, self-assembly of polyglutamic acid and polylysine by electrostatic adsorption, and addition of Zr0 2 , A1 2 0 3 and Ti0 2 nanoparticles allow the material to self-assemble into a film which can be used for drug carriers.
  • U.S. Patent No. 2012/0122219 Al reports the preparation of a multi-empty scaffold using polyglutamic acid and chondroitin as raw materials. The polyglutamic acid and chondroitin have excellent biocompatibility, and the prepared porous scaffold can provide three-dimensional growth for cells.
  • WO2007/075016 A1 reports the preparation of hydrogels using polyglutamic acid and vitamin C as raw materials. The two raw materials are reacted to form a gel under the activation of EDC and NHS, and freeze-dried to obtain a solid. The research has found that the product can significantly inhibit the activity of collagenase, and has the functions of anti-oxidation and preventing skin wrinkles, and has broad application prospects in cosmetics and medical fields.
  • WO2009/157595 A1 reports that polyglutamic acid (molecular weight 13000 kDa) obtained by fermentation of Bacillus subtilis is used as a raw material to cross-link y-ray to prepare a hydrogel. Since y-ray crosslinking is used, there is no chemical residue. The safety of hydrogel is guaranteed, and its water absorption and moisturizing ability is extremely strong, and it has broad application prospects in the field of high-grade cosmetics.
  • Chinese invention patents CN1629220A and CN101891954A disclose a method for preparing a hydrogel using polyglutamic acid as a main raw material, all using a glycidyl ether type crosslinking agent, although the gel obtained by the gel has a high water absorption rate, Non-biological sources make it less biocompatible, and are generally used in environmentally friendly flocculation of farmland water retention machines. Applications in the medical field are greatly limited.
  • CN102585303A discloses a method for preparing a hydrogel using polylysine as a raw material, and the composition of the polysaccharide/polypeptide of the chitosan/polylysine hydrogel biomimetic natural extracellular matrix prepared by the invention and The structure is expected to be used as an injectable material for tissue adhesives, but in the preparation process, it is necessary to separately chemically modify chitosan and polylysine, and the steps of synthesis are cumbersome.
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide a hydrogel based on a cross-linked polymer of ⁇ -polyglutamic acid and ⁇ -polylysine with high water absorption, fast swelling rate and good biocompatibility.
  • the technical problem to be solved by the present invention is to provide a method for preparing the above hydrogel, which has mild reaction conditions, simple steps and no further chemical modification of the raw materials.
  • the final technical problem to be solved by the present invention is to provide the medical use of the above hydrogel.
  • the technical solution adopted by the present invention is as follows:
  • n is a natural number in the value 3900 to 17000
  • x is a natural number in the value 5 to 40.
  • the ⁇ -polyglutamic acid and the ⁇ -polylysine are respectively prepared by a microbial fermentation method.
  • Bacillus subtilis Bacillus licheniformis Bacillus megaterium Bacillus anthracis Bacillus halodurans can be used to prepare ⁇ -polyglutamic acid [ Ashiuchi M. Occurrence and biosynthetic mechanism of poly -gamma-glutamic acid. In: Hamano Y editor. Amino-Acid Homopolymers Occurring in Nature [C]. Berlin: Springer; 2010.].
  • Bacillus subtilis NX-2 preerved in China General Microorganisms Collection and Management Center (CGMCC), accession number: CGMCC NO.0833) is fermented to obtain ⁇ -polyglutamic acid.
  • CGMCC General Microorganisms Collection and Management Center
  • the specific preparation method can refer to [Xu, H., Jiang, M., Li, H., Lu, DQ, Ouyang, PK, Efficient production of poly(y-glutamic acid) by newly isolated Bacillus subtilis NX-2. Process Biochem. 2005. ( 40 ) ,519 -523.] or [Liang Jinfeng, Xu Hong, Yao Jun, Wu Qun, ⁇ -polyglutamic acid extraction fermentation liquid pretreatment and separation and purification process, Food and Fermentation Industry, 2009 (3) 10-15].
  • ⁇ -polylysine can be obtained by fermentation of Streptomyces albulus, Streptomyces albidoflavus, Streptomyces rimosus, Streptomyces cyaneus, and Kitasatospora s [Nishikawa M, Ogawa K. Distribution Of microbes producing antimicrobial ⁇ -poly-L-lysine polymers in soil microflora determined by a novel method.
  • the present invention is not limited to the above-mentioned microorganisms and the above-mentioned fermentation preparation methods, and all existing ⁇ -polyglutamic acid and ⁇ -poly which are prepared by using microorganisms (including wild bacteria or genetically engineered bacteria) before the date of this patent application.
  • Lysine can be used in the present invention.
  • the polymer formed by crosslinking the above-mentioned biologically derived ⁇ -polyglutamic acid with ⁇ -polylysine has good biocompatibility.
  • the molecular weight of y-polyglutamic acid is 500,000 to 2.2 million Daltons, preferably y-polyglutamic acid having a molecular weight of 1 million to 1.2 million Daltons; the molecular weight of polylysine is 2000 to 5500 channels.
  • Denton preferably polylysine having a molecular weight of 3000 to 4500 daltons.
  • a method for preparing a hydrogel based on a ⁇ -polyglutamic acid and ⁇ -polylysine crosslinked polymer comprising the following steps:
  • the hydrogel formed in the step (2) is placed in a dialysis bag, dialyzed in deionized water to a swelling balance, and then freeze-dried or vacuum-dried to obtain a sponge-like dressing.
  • the ⁇ -polyglutamic acid and the ⁇ -polylysine are each prepared by a microbial fermentation method.
  • the molecular weight of y-polyglutamic acid is 500,000 to 2.2 million Daltons, preferably y-polyglutamic acid having a molecular weight of 1,000,000 to 1.2 million Daltons; the molecular weight of polylysine is 2000 ⁇ 5500 Daltons, preferably molecular weight is
  • the MES buffer is 0.1 mol/L pH 5.0 MES buffer.
  • the poly-lysine-containing MES buffer is a homogeneous solution, wherein the concentration of ⁇ -polylysine is 20 g/L ⁇ 160 g/L, preferably 24 g/L ⁇ 60 g/L;
  • MES buffer containing y-polyglutamic acid is a homogeneous solution, wherein the mass percentage of y-polyglutamic acid is 40 g/L ⁇ 200 g/L, preferably 60 g/L to 120 g/L.
  • the crosslinking agent is 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-carbodiimide hydrochloride (EDC).
  • EDC N-hydroxysulfosuccinimide
  • NHS N-hydroxysulfosuccinimide
  • 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide a combination of 1 -ethyl-3 -(3 -dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, EDC
  • N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt sulfo-NHS) (EDC/sulfo-NHS)
  • Is 1-cyclohexyl-2-morpholineethyl carbodiimide p-toluenesulfonate l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfon
  • the crosslinking agent is a combination of 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide and N-hydroxysuccinimide
  • the carboxyl group contained in ⁇ -polyglutamic acid Amino group contained in polylysine: 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide:
  • the molar ratio of hydrazine-hydroxysuccinimide ranges from 1:0.25-0.5: 0.25 -1: 0.25-1, preferably 1: 0.4-0.5: 0.6-0.8: 0.6 to 0.8.
  • Hydrogels are prepared using EDC and NHS as activators.
  • EDC can rapidly catalyze the formation of amide bonds in the feedstock.
  • NHS can increase the efficiency of the reaction and reduce the formation of rearranged by-products, and the activator can be removed by washing dialysis.
  • the crosslinking agent is a combination of 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide and hydrazine-hydroxythiosuccinimide
  • the ⁇ -polyglutamic acid is contained Carboxyl group: Amino group contained in polylysine: 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide: The molar ratio of hydrazine-hydroxythiosuccinimide is 1 : 0.25 -0.5: 0.25-1: 0.25 to 1, preferably 1: 0.4 to 0.5: 0.5 to 0.8: 0.5 to 0.8.
  • the crosslinking agent is 1-cyclohexyl-2-morpholinethylcarbodiimide p-toluenesulfonate
  • the molar ratio of the hexyl-2-morpholineethylcarbodiimide p-toluenesulfonate is in the range of 1:0.25 to 0.5: 0.25-1, preferably 1:0.4 to 0.5:0.3 to 0.6.
  • Woodward's reagent When the crosslinking agent is Woodward's reagent, the carboxyl group contained in ⁇ -polyglutamic acid: the amino group contained in polylysine: Woodward's reagent ⁇ has a molar ratio ranging from 1:0.25 to 0.5 : 0.25 to 1, preferably 1: 0.4 to 0.5: 0.6 to 0.9.
  • the ice bath reaction time is preferably 30 minutes, and the room temperature reaction time is preferably 2 hours.
  • the freeze-drying temperature is -40 ° C; the vacuum drying temperature is 60 ° C, and after the above drying process, the water content of the product is controlled to be 1 to 3 wt%.
  • the method of the present invention can also further process the prepared sponge dressing.
  • the sponge-like dressing may be ground and pulverized, and dispensed with an aluminum composite film to prepare a dry gel powder.
  • the sponge-like dressing is added with 1 to 10 times by weight of water to form a soft material, which is dispensed in a polyethylene tube and sealed in a package to prepare a hydrogel.
  • the sponge-like dressing is added with 1 to 5 times by weight of water to form a soft material, and the film is pressed into a polyethylene film, and dried at a flow rate of 70 to 90 ° C to make the water content 20 to 60 wt. %, and then combined with a polyethylene gas permeable membrane, after shearing, sealed with an aluminum composite film to prepare a gel film.
  • Hydrogels prepared in accordance with all of the above preparation methods are within the scope of the present invention.
  • hydrogels prepared in accordance with all of the above preparation methods for the preparation of medical wound dressings is also within the scope of the present invention.
  • the invention has the significant advantages that: y-polyglutamic acid and polylysine prepared by microbial fermentation are used as raw materials, and the degradability and biocompatibility of the raw materials are excellent. Does not cause rejection of the body, cell adhesion is good.
  • the preparation method has mild reaction conditions and simple steps, and can be reacted into a hydrogel without further chemical modification of the raw materials, and the obtained hydrogel has high water absorption rate and fast swelling rate, and has good application prospect in the field of wound dressings.
  • Figure 1 is a schematic diagram of the reaction of the present invention.
  • Fig. 2 is a nuclear magnetic resonance spectrum (1H-NMR) of a hydrogel based on a crosslinked polymer of ⁇ -polyglutamic acid and ⁇ -polylysine.
  • Fig. 3 is a ⁇ -polyglutamic acid- ⁇ -polylysine crosslinked polymer hydrogel infrared spectrum (FTIR) of Example 1.
  • FTIR ⁇ -polyglutamic acid- ⁇ -polylysine crosslinked polymer hydrogel infrared spectrum
  • Figure 4 is an electron micrograph (SEM) of a hydrogel based on ⁇ -polyglutamic acid and ⁇ -polylysine crosslinked polymer (Example 1).
  • Figure 5 shows the cell compatibility of the copolymer light laser scanning microscope (CLSM). The cells are grown on a hydrogel scaffold, the living cells are green, and the dead cells are red. a) Growth of fibroblasts on polyglutamic acid hydrogel scaffolds b) Growth of fibroblasts on gamma-polyglutamate- ⁇ -polylysine cross-linked polymer hydrogel scaffolds.
  • Figure 6 shows the wound healing experiment in rabbits. a) The control group is covered with gauze only after bandage, b) treated with polyglutamic acid hydrogel dressing, c) ⁇ -polyglutamic acid- ⁇ -poly Acid crosslinked polymer hydrogel dressing treatment group.
  • Y-polyglutamic acid and polylysine purchased from Nanjing Xuankai Biotechnology Co., Ltd.
  • NHS ⁇ -hydroxysuccinimide
  • Sulfo-NHS N-hydroxythiosuccinimide
  • CMC 1-cyclohexyl-2-morpholineethylcarbazide
  • Amine p-toluenesulfonate and (2-ethyl-5-phenylisoxazole-3-sulfonate) were purchased from Sigma-Aldrich.
  • Magnetic stirrer Model 85-2C, Shanghai Twisting Instrument Equipment Co., Ltd.
  • Freeze dryer Model FD-1C-50, Beijing Bo Yikang Experimental Instrument Co., Ltd.
  • Vacuum drying oven Model YZG-600, Nanjing Yutai Electric Heating Equipment Co., Ltd.
  • Infrared spectrometer Model Nicolet 380, Thermo Company, USA.
  • EDC EDC
  • NHS was charged at a molar ratio of 1: 0.45: 0.7: 0.7, and subjected to an ice bath reaction for 30 minutes, and then reacted at room temperature for 2 hours to form a hydrogel.
  • the formed hydrogel was placed in a dialysis bag, dialyzed in deionized water to a swelling balance, and then freeze-dried or vacuum-dried to obtain a sponge-like dressing, and the obtained hydrogel had an expansion ratio of 96.6 g/g.
  • the structure is identified in Figure 2.
  • the NMR spectrum of ⁇ -polyglutamic acid- ⁇ -polylysine cross-linked polymer hydrogel shows the chemical combination of ⁇ -polyglutamic acid and ⁇ -polylysine.
  • a crosslinked polymer is formed.
  • the infrared pattern of Figure 3 also demonstrates the formation of gamma-polyglutamic acid and ⁇ -polylysine crosslinked polymer hydrogels.
  • a broad peak appearing at a position of 3500 to 3300 cm 1 is also a characteristic absorption peak of the hydrogel, mainly caused by stretching vibration of a hydroxyl group and NH stretching vibration on an amide bond.
  • the scanning electron microscope of Fig. 4 shows the surface morphology of the prepared hydrogel, indicating that the hydrogel prepared by the present invention has a three-dimensional pore structure with a pore diameter of 100 to 200 ⁇ m, which is suitable as a wound dressing.
  • EDC Sulfo-NHS was charged at a molar ratio of 1:0.4:0.6:0.6, and reacted for 30 minutes in an ice bath, and then reacted at room temperature for 2 hours to form a hydrogel.
  • the formed hydrogel was placed in a dialysis bag, dialyzed in deionized water to a swelling balance, and then freeze-dried or vacuum-dried to obtain a sponge-like dressing, and the obtained hydrogel had an expansion ratio of 73.8 g/g.
  • y-polyglutamic acid (1 million to 1.2 million Daltons, containing 0.035 moles of carboxyl groups) was dissolved in 50 ml of 0.1 mol/L MES buffer (pH 5.0) at room temperature and stirred until a clear solution was formed.
  • 2.24 g of ⁇ -polylysine (3000 ⁇ 4500 Daltons, containing 0.0175 mol of amino group) was dissolved in 50 mL of 0.1 mol/L MES buffer (pH 5.0) at room temperature, and the ⁇ -polylysine solution was added dropwise. The solution was added dropwise to the polyglutamic acid solution, and the solution was uniformly mixed by stirring.
  • Woodward's reagent K is added to the above mixture of y-polyglutamic acid and ⁇ -polylysine to control the carboxyl group contained in y-polyglutamic acid: polylysine Amino group: Woodward's reagent ⁇ has a molar ratio of 1:0.5:0.8, an ice bath reaction for 30 min, and then reacted at room temperature for 2 h to form a hydrogel. The formed hydrogel was placed in a dialysis bag, dialyzed in deionized water to a swelling balance, and then freeze-dried or vacuum-dried to obtain a sponge-like dressing, and the obtained hydrogel had an expansion ratio of 52.7.
  • Example 1 The method of Example 1 is different from controlling the carboxyl group contained in y-polyglutamic acid: the amino group contained in polylysine: EDC: NHS is charged in a molar ratio of 1: 0.25: 0.25: 0.25, resulting in The hydrogel has an expansion ratio of 12.5
  • Example 7 The method of Example 1 is different from controlling the carboxyl group contained in y-polyglutamic acid: the amino group contained in polylysine: EDC: NHS is fed in a molar ratio of 1:0.5:1.
  • the hydrogel has an expansion ratio of 38.6.
  • Example 2 The method of Example 2 is different from controlling the carboxyl group contained in y-polyglutamic acid: the amino group contained in polylysine: EDC: Sulfo-NHS has a molar ratio of 1: 0.25: 0.25: 0.25. As a result, the obtained hydrogel had an expansion ratio of 30.2.
  • Example 2 The method of Example 2 is different from the control of the carboxyl group contained in y-polyglutamic acid: the amino group contained in polylysine: EDC: Sulfo-NHS has a molar ratio of 1: 0.5: 1: 1, The resulting hydrogel has an expansion ratio of 42.3.
  • Example 10 The method of Example 3 was different except that the carboxyl group contained in y-polyglutamic acid was controlled: the amino group contained in polylysine: the molar ratio of CMC was 1: 0.25: 0.25, and the resulting hydrogel was obtained. The expansion ratio is 33.7.
  • Example 10 The carboxyl group contained in y-polyglutamic acid was controlled: the amino group contained in polylysine: the molar ratio of CMC was 1: 0.25: 0.25, and the resulting hydrogel was obtained. The expansion ratio is 33.7.
  • Example 10 The method of Example 3 was different except that the carboxyl group contained in y-polyglutamic acid was controlled: the amino group contained in polylysine: the molar ratio of CMC was 1: 0.25: 0.25, and the resulting hydrogel was obtained. The expansion ratio is 33.7.
  • Example 3 differs from the control of the carboxyl group contained in y-polyglutamic acid: the amino group contained in polylysine: the molar ratio of CMC is 1:0.5: 1, resulting in hydrogel The expansion ratio is 39.4.
  • Example 4 The method of Example 4 is different except that the carboxyl group contained in y-polyglutamic acid is controlled: the amino group contained in polylysine: Woodrow's reagent ⁇ has a molar ratio of 1: 0.25: 0.25, and the result is The swelling rate of the obtained hydrogel It is 36.6 g/g.
  • Example 4 The method of Example 4 is different from the control of the carboxyl group contained in y-polyglutamic acid: the amino group contained in polylysine: Woodward's reagent ⁇ has a molar ratio of 1:0.5:1.
  • the obtained hydrogel has an expansion ratio of 43.4 g/g°
  • Example 4 The same procedure as in Example 4 except that the ice bath was reacted for 10 minutes, and a hydrogel was formed at room temperature for 5 hours. As a result, the obtained hydrogel had an expansion ratio of 35.8 g/g.
  • Example 4 The same procedure as in Example 4 was carried out except that the ice bath was reacted for 120 min and the hydrogel was formed at room temperature for 24 hours. As a result, the obtained hydrogel had an expansion ratio of 26.9 g/g.
  • the formed hydrogel was placed in a dialysis bag, dialyzed in deionized water to a swelling balance, and then subjected to freeze-drying or vacuum drying to obtain a sponge-like dressing, and the obtained hydrogel had an expansion ratio of 3.4 g/g.
  • the sponge-like dressings of Examples 1-4 were ground and pulverized, and were dispensed with an aluminum composite film to prepare a dry gel powder.
  • a soft hydrogel was prepared by adding 3 times the weight of the dressing, and the fibroblasts were inoculated onto the surface of the hydrogel at a concentration of 5 ⁇ 10 4 /cm 2 , 37 in vitro. Culture for 6h. The cells were stained with the LIVE/DEAD Fluorescence Kit, the living cells were stained with a green fluorescent substance (calcein-AM), and the dead cells were stained with a red fluorescent substance (EthD-I) o and then scanned with a condensing light laser ( CLSM) Observe cell survival.
  • the red fluorescent substance in a) is significantly higher than b), indicating that the cells on the ⁇ -polyglutamic acid hydrogel scaffold have a considerable amount of cell death, while ⁇ -polyglutamic acid- ⁇ -poly Most of the cells on the cross-linked polymer hydrogel scaffold are viable, indicating good biocompatibility of the hydrogel of the present invention.
  • Example 1 The wound dressing of Example 1 was applied to the wound, covered with paraffin-wax cotton gauze, and then bandaged. The control group was covered only with gauze. The bandage was bandaged and the other group was coated with a gamma-polyglutamic acid hydrogel dressing. No bacterial infection occurred in each group during the experiment, and wound healing was observed after 0, 7, and 14 days, respectively.
  • the hydrogel dressing treatment group was superior to the gauze-only treatment group; ⁇ -polyglutamic acid- ⁇ -polylysine was used.
  • the wound area was only 40% of the ⁇ -polyglutamic acid hydrogel control group, the wound was significantly smaller, and the surface was smooth and flat. Overall, it shows excellent biocompatibility and the ability to promote wound healing.
  • the y-polyglutamic acid polylysine hydrogel wound dressing of the invention has good biocompatibility, is favorable for cell adhesion growth, has a promoting effect on wound healing, and effectively reduces tissue fluid exudation in medical wounds.
  • the field of dressing application has broad prospects.

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Abstract

一种基于Y-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶，其由Y-聚谷氨酸与ε-聚赖氨酸交联制备得到，且具有如下结构单元的聚合物，其中，m取值15—45中的自然数，n取值3900—17000中的自然数，x取值5-40中的自然数。上述水凝胶的制备方法及其在制备医用创伤敷料中的应用也被提及。

Description

说 明 书 一种基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶及其制备方法 技术领域
本发明涉及一种生物相容性水凝胶的制备方法，具体来说是通过化学交联的方法得 到生物相容性的 y-聚谷氨酸与 聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法。
背景技术
皮肤是人体的重要器官， 由于创伤、 烧伤等原因， 可能会导致皮肤的大范围伤害， 并有可能导致并发症， 危及人类生命， 如何有效促进伤口快速愈合就一直是医学界不懈 探索的课题。传统的观点认为，应该尽可能为伤口创造一个干燥的环境，减少感染机会， 有利于伤口愈合。但是随着研究的深入， 人们发现湿润的无感染的环境对连续的组织修 复过程是最有利的 [Wound repair and regeneration, 2009 (17):505-510] 。在这种"湿润伤口 愈合"理论指导下， 医用高分子水凝胶创伤敷料的研究应用逐渐兴起， 逐步取代传统敷 料用于各类溃烂和创伤伤口。
水凝胶是能够吸收以及保持大量水分而又不溶于水的三维交联网络结构材料，其网 络由大分子主链和亲水性官能团构成， 是一类集吸水、 保水于一体的功能高分子材料， 具有高力学强度， 生物可降解性， 高溶胀率， 生物相容性以及刺激响应性等独特性质。 高分子水凝胶创伤敷料是水凝胶在医学材料上的一大应用，是近些年发展起来的一种新 型敷料产品。传统上医生一般用无菌纱布及外用抗生素处理伤口， 纱布容易与皮肤伤口 组织粘连， 换药时容易破坏新生的上皮和牙肉组织， 引起出血， 这不但延迟伤口愈合， 而且使病人疼痛难忍。水凝胶敷料可有效克服上述缺点， 其具有良好的水蒸气和气体透 过率， 不会和伤口粘连， 易于更换。 水凝胶敷料可以掺入药物成分和生长因子， 促进伤 口愈合，并且水凝胶材料本身的热容量大，对伤口有温和的冷却作用，可减轻伤口疼痛。 因此， 国内外学者对水凝胶敷料开展了广泛研究并取得了相当的成果。
在组成人体蛋白质的 20中氨基酸中， y-聚谷氨酸和 聚赖氨酸是目前仅有的两种自 然存在的氨基酸均聚物， 二者都是通过微生物发酵法制得的。 y-聚谷氨酸的分子量从十 万到两百万道尔顿不等， 在生物体内能降解为谷氨酸单体， 被机体吸收， 无毒副作用。 其分子链上存在大量游离羧基， 便于修饰改性。 聚赖氨酸的分子量在三千到五千道尔 顿之间，与天然细胞外基质（ECM)中的蛋白成分和功能类似，分子链上拥有众多氨基， 可有效促进细胞粘附生长， 此外， 聚赖氨酸本身是聚阳离子， 易与聚阴离子发生强静 电作用， 对生物膜有良好穿透力。 y-聚谷氨酸和 聚赖氨酸相较于传统凝胶材料优势明 显， 二者在体内的降解性和生物相容性都属优良， 不会引起机体的排斥反应。
美国专利 U.S Patent 2003/0211129 Al 报道了以聚谷氨酸和聚赖氨酸为原料制备薄 膜， 利用静电吸附原理使聚谷氨酸和聚赖氨酸自组装， 同时添加 Zr02、 A1203和 Ti02 纳米颗粒使原料自组装成为薄膜， 该薄膜可以用于药物载体。 美国专利 U.S Patent 2012/0122219 Al报道了以聚谷氨酸和软骨素为原料制备多空支架， 聚谷氨酸和软骨素 生物相容性极好， 制备的多孔支架可以为细胞生长提供了三维的微环境， 细胞在支架上 的附着和生长能力很强，显示了该支架在组织工程方面的应用潜力。 WO2007/075016 A1 报道了以聚谷氨酸和维他命 C为原料制备水凝胶的报道，两种原料在 EDC和 NHS活化 下反应成胶， 冷冻干燥后得到固体。 研究发现该产品可以显著抑制胶原酶的活力， 并且 具有抗氧化、 防止皮肤褶皱的功能， 在化妆品、 医疗领域有广阔的应用前景。 WO2009/157595 A1报道了以 Bacillus subtilis发酵制得的聚谷氨酸 （分子量 13000 kDa 为原料， 在 y射线的作用下交联制备水凝胶， 由于使用 y射线交联， 没有任何化学残留， 该水凝胶的安全性得到保障，且吸水保湿能力极强，在高档化妆品领域有广泛应用前景。
中国发明专利 CN1629220A和 CN101891954A中公开了以聚谷氨酸为主要原料制 备水凝胶的方法， 均采用了縮水甘油醚类交联剂， 虽然所得凝胶吸水率较高， 但由于其 交联剂非生物源， 使其生物相容性较差， 一般应用于农田保水机环保絮凝等方面， 医疗 领域的应用大大受限。中国专利 CN102585303A中公开了一种以聚赖氨酸为原料制备水 凝胶的方法， 该发明制备的壳聚糖 /聚赖氨酸水凝胶仿生天然细胞外基质的多糖 /多肽的 组成成分和结构， 有望作为可注射材料用作组织粘合剂， 但是在制备过程中， 需要分别 对壳聚糖和聚赖氨酸进行化学修饰， 合成的步骤较为繁琐。
综上， 以聚谷氨酸和聚赖氨酸为原料分别制备水凝胶均有报道， 存在着交联剂生物 相容性差以及制备步骤繁琐等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种吸水率高、溶胀速率快且生物相容性好的基 于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶。
本发明还要解决的技术问题是提供上述水凝胶的制备方法， 该方法反应条件温和、 步骤简易且不需要对原料做进一步化学修饰。
本发明最后要解决的技术问题是提供上述水凝胶的医药用途。 说 明 书 为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案如下：
一种基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶，其由 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖 ， 且具有如下结构单元的聚合物：
Figure imgf000005_0001
其中， m取值 15〜45中的自然数， n取值 3900〜17000中的自然数， x取值 5〜40中 的自然数。
其中， 所述的 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸都是分别由微生物发酵法制备得到。
例如可以采用枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis 地衣芽孢杆菌 Bacillus licheniformis 巨大芽孢杆菌 Bacillus megaterium 炭疽芽孢杆菌 Bacillus anthracis 极端而铺芽孢杆菌 Bacillus halodurans 等发酵制备得到 γ-聚谷氨酸 【 Ashiuchi M. Occurrence and biosynthetic mechanism of poly-gamma-glutamic acid. In: Hamano Y editor. Amino-Acid Homopolymers Occurring in Nature [C]. Berlin: Springer;2010.】。 优选枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis NX-2 (保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心 （CGMCC ) , 保藏号： CGMCC NO.0833 )发酵制备得到 γ-聚谷氨酸，具体制备方法可以参考【Xu， H.， Jiang, M.， Li, H.， Lu, D.Q., Ouyang, P.K., Efficient production of poly(y-glutamic acid) by newly isolated Bacillus subtilis NX-2. Process Biochem. 2005. ( 40 ) ，519-523.】或【梁金丰， 徐 虹， 姚俊， 吴群， γ-聚谷氨酸提取的发酵液预处理及分离纯化工艺， 食品与发酵工业， 2009 ( 3 ) 10-15】。
例如可以采用白色链霉菌 Streptomyces albulus 微白黄链霉菌 streptomyces albidoflavus、龟裂链霉菌 Streptomyces rimosus、深蓝链霉菌 Streptomyces cyaneus、北里 孢菌 Kitasatospora s 等发酵制备得到 ε-聚赖氨酸 [Nishikawa M， Ogawa K. Distribution of microbes producing antimicrobial ε-poly-L-lysine polymers in soil microflora determined by a novel method. Appl Environ Microbiol, 2002(68):3575-3581 ], 优选采用白色链霉菌 Streptomyces albulus PD-1 (保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC ) ,保藏号： CCTCC M2011043 ) 制备得到 ε-聚赖氨酸， 具体制备方法可以参考【 Hirohara H， Takehara Μ， Saimura Μ， Ikezaki A, Miyamoto M (2006)Biosynthesis of poly(8-L-lysine)s in two newly isolated strains of Streptomyces sp. Appl Microbiol Biotechnol 73 :321— 331】或【周俊，徐虹， 王军， 姚忠， 王辉， 欧阳平凯， 北里孢菌 PL6-3产 ε-聚赖氨酸的分离纯化和结构表征， 化工学报， 2006 ( 08)： 229-233】或【陈雄， 袁金凤， 王实玉， 章莹， 王金华， 离子交 换树脂提取发酵液中聚 -ε-赖氨酸的研究， 食品科技， 2007 ( 10)： 144-146】。
本发明不局限于上述这些微生物以及上述这些发酵制备方法，在本专利申请日以前 所有的现有的利用微生物 （包括野生菌或者基因工程菌） 制备得到的 γ-聚谷氨酸与 ε- 聚赖氨酸都可以为本发明所用。采用上述生物来源的 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联后形 成的聚合物都具有很好的生物相容性。
其中， y-聚谷氨酸的分子量为 50万〜 220万道尔顿， 优选分子量为 100万〜 120万道 尔顿的 y-聚谷氨酸； 聚赖氨酸的分子量为 2000〜5500道尔顿，优选分子量为 3000〜4500 道尔顿的 聚赖氨酸。
一种基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法，它包括如下步 骤：
(1) 将含 聚赖氨酸的 2- (Ν-吗啡啉） 乙磺酸缓冲液 （2- (Ν-吗啡啉） 乙磺酸缓冲 液简称 MES缓冲液） 滴加至含 y-聚谷氨酸的 2- (N-吗啡啉） 乙磺酸缓冲液 （2- (N-吗 啡啉） 乙磺酸缓冲液简称 MES缓冲液） 中， 搅拌混合均匀；
(2) 将交联剂加入到步骤 (1)得到的反应体系中， 冰浴反应 10〜120min， 再室温反应 2〜24h形成水凝胶；
(3) 将步骤 (2)形成的水凝胶放在透析袋中， 置于去离子水中透析至溶胀平衡， 之后 采用冷冻干燥或者真空干燥， 得到海绵状敷料。
步骤 (1)中， 所述的 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸都是分别由微生物发酵法制备得到。 步骤 (1)中， y-聚谷氨酸的分子量为 50万〜 220万道尔顿， 优选分子量为 100万 -120 万道尔顿的 y-聚谷氨酸； 聚赖氨酸的分子量为 2000〜5500道尔顿， 优选分子量为
3000-4500道尔顿的 聚赖氨酸。
步骤 (1)中， 所述的 MES缓冲液为 0.1 mol/L pH 5.0的 MES缓冲液。
步骤 (1)中， 含 聚赖氨酸的 MES缓冲液为均相溶液， 其中 ε-聚赖氨酸的浓度为 20 g/L〜160 g/L， 优选 24 g/L〜60 g/L; 含 y-聚谷氨酸的 MES缓冲液为均相溶液， 其中 y- 聚谷氨酸的质量百分含量为 40 g/L〜200 g/L， 优选 60 g/L〜120 g/L。
步骤 (2)中， 所述交联剂为 1- ( 3-二甲基氨基丙基） -3-乙基碳二亚胺 ( 1 -ethyl-3 -(3 -dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride, EDC)禾口 N-轻基琥珀酰亚 胺 (N -hydroxysulfosuccinimide, NHS)的组合（简称 EDC/NHS)、 或者为 1- ( 3-二甲基氨 基丙基 ) -3-乙基碳二亚胺 (1 -ethyl-3 -(3 -dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride， EDC)禾卩 N-羟基硫代琥珀酰亚胺 (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt, sulfo-NHS)的组 合 （简称 EDC/sulfo-NHS )， 或者为 1-环己基 -2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐 (l-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimide metho-p-toluenesulfonate , 简禾尔 CMC), 或者伍德沃德 氏试剂 K ( 即 2- 乙基 -5-苯基异恶 唑 -3-磺酸盐 ， N-ethyl-3-phenylisoxazolium-3' -sulfonate )。
当所述交联剂为 1- ( 3-二甲基氨基丙基） -3-乙基碳二亚胺和 N-羟基琥珀酰亚胺的 组合， 则 γ-聚谷氨酸所含羧基： 聚赖氨酸所含氨基： 1- ( 3-二甲基氨基丙基） -3-乙基 碳二亚胺： Ν-羟基琥珀酰亚胺的投料摩尔比例范围为 1： 0.25-0.5： 0.25-1： 0.25-1 , 优 选 1 : 0.4-0.5： 0.6-0.8： 0.6〜0.8。 以 EDC和 NHS为活化剂制备水凝胶， EDC可快速催 化原料形成酰胺键， NHS可以提高反应的效率并减少重排副产物的生成，并可以通过水 洗透析将活化剂除去。
当所述交联剂为 1- ( 3-二甲基氨基丙基） -3-乙基碳二亚胺和 Ν-羟基硫代琥珀酰亚 胺的组合， 则 γ-聚谷氨酸所含羧基： 聚赖氨酸所含氨基： 1- ( 3-二甲基氨基丙基） -3- 乙基碳二亚胺： Ν-羟基硫代琥珀酰亚胺的投料摩尔比例范围为 1 : 0.25-0.5： 0.25-1： 0.25〜1， 优选 1 : 0.4-0.5： 0.5〜0.8： 0.5〜0.8。
当所述交联剂为 1-环己基 -2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐，则 γ-聚谷氨酸所含羧 基： 聚赖氨酸所含氨基： 1-环己基 -2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐的投料摩尔比例 范围为 1 : 0.25〜0.5： 0.25-1 , 优选 1 : 0.4〜0.5： 0.3〜0.6。
当所述交联剂为伍德沃德氏试剂 Κ，在 γ-聚谷氨酸所含羧基： 聚赖氨酸所含氨基： 伍德沃德氏试剂 Κ的投料摩尔比例范围为 1 : 0.25〜0.5 : 0.25〜1，优选 1： 0.4〜0.5： 0.6〜0.9。
步骤 (2)中， 冰浴反应时间优选 30min， 室温反应时间优选 2h。
步骤 (3)中， 冷冻干燥温度为 -40°C ; 真空干燥温度为 60°C， 上述干燥过程后， 使得 产品的含水量控制在 l〜3wt%。 本发明方法还可以对制得的海绵状敷料做进一步的加工。
例如， 可以将所述海绵状敷料研磨粉碎， 用铝复合膜分装， 以制得干凝胶粉剂。 或者， 将所述海绵状敷料加 1〜10倍重量的水制成软材， 分装于聚乙烯管中， 密封 包装， 以制得水凝胶剂。
或者，将所述海绵状敷料加 1〜5倍重量的水制成软材，压成薄膜片置于聚乙烯膜上， 70〜90 °C气流烘干， 使其含水量为 20〜60 wt%， 再复合上聚乙烯透气膜， 剪切后用铝复 合膜密封， 以制得凝胶膜剂。
按照上述所有的制备方法制得的水凝胶都在本发明的保护范围之内。
按照上述所有的制备方法制得的水凝胶在制备医用创伤敷料中的应用也都在本发 明的保护范围之内。
本发明的反应原理图见图 1。
本发明与现有技术相比， 具有的显著优点是： 以微生物发酵制得的 y-聚谷氨酸和 聚赖氨酸为原料， 原料的体内的降解性和生物相容性都属优良， 不会引起机体的排斥反 应， 细胞粘附性良好。 制备方法反应条件温和， 步骤简易， 不需要对原料做进一步化学 修饰即可反应制成水凝胶， 所得水凝胶吸水率高， 溶胀速率快， 在创伤敷料领域具有良 好应用前景。
附图说明
图 1为本发明的反应原理图。
图 2为基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的核磁共振氢谱 （1H-NMR)。 图 3为实施例 1的 γ-聚谷氨酸 -ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶红外图谱 （FTIR)。 （a) ^聚 赖氨酸， （b) y-聚谷氨酸， （c) 聚赖氨酸 -y-聚谷氨酸水凝胶。
图 4为基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶（实施例 1 )的电镜图片（ SEM)。 图 5为共聚光激光扫描显微镜 （CLSM) 测定细胞相容性情况， 细胞生长在水凝胶支架 上， 活细胞为绿色， 死亡细胞为红色。 a) 聚谷氨酸水凝胶支架上成纤维细胞的生长 b) γ-聚谷氨酸 -ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶支架上成纤维细胞的生长。
图 6为家兔背部伤口愈合实验， a)对照组仅用纱布覆盖后绷带包扎， b)使用聚谷氨酸水 凝胶敷料处理组， c)使用 γ-聚谷氨酸 -ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶敷料处理组。
具体实施方式
根据下述实施例， 可以更好地理解本发明。 然而， 本领域的技术人员容易理解， 实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的 本发明。
以下实施例所用试剂来源如下：
y-聚谷氨酸和 聚赖氨酸： 购于南京轩凯生物科技有限公司。
MES (2- (Ν-吗啡啉） 乙磺酸）， EDC (1- (3-二甲基氨基丙基） -3-乙基碳二亚胺）
NHS (Ν-羟基琥珀酰亚胺)和 Sulfo-NHS(N-羟基硫代琥珀酰亚胺)购自国药集团化学试剂 有限公司， CMC (1-环己基 -2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐)和 （2-乙基 -5-苯基异恶 唑 -3-磺酸盐） 购自 Sigma-Aldrich公司。
以下实施例所用设备来源如下：
磁力搅拌器： 型号 85-2C, 上海扭航仪器设备有限公司。
冷冻干燥机： 型号 FD-1C-50, 北京博医康实验仪器有限公司。
真空干燥箱： 型号 YZG-600, 南京焱泰电热设备有限公司。
红外光谱仪： 型号 Nicolet 380， 美国 Thermo公司。
核磁共振仪： 型号 AVANCE AV-500, 美国 Bruker Daltonics 公司。
实施例 1 :
室温下将 4.0 g y-聚谷氨酸 （100万〜 120万道尔顿， 含有 0.031mol羧基） 溶解于 50 ml的 0.1 mol/L MES缓冲液 （pH 5.0) 中， 并搅拌至形成澄清溶液。 室温下将 1.78 g e- 聚赖氨酸 （3000〜4500道尔顿， 含有 0.014mol氨基） 溶解于 50 ml 0.1 mol/L MES缓冲 液（pH 5.0)， 逐滴将 ε-聚赖氨酸溶液滴加到聚谷氨酸溶液中， 搅拌使溶液均匀混合。 将 4.17g (0.0217mol) EDC和 2.50g (0.0217mol ) NHS加入到上述 y-聚谷氨酸和 ε-聚赖氨酸 混合液中， 控制 y-聚谷氨酸所含有的羧基： 聚赖氨酸所含有的氨基： EDC: NHS的投 料摩尔比为 1 : 0.45： 0.7： 0.7， 冰浴反应 30 min， 之后室温反应 2h形成水凝胶。 将形 成的水凝胶放在透析袋中， 置于去离子水中透析至溶胀平衡， 之后采用冷冻干燥或者真 空干燥得到海绵状敷料， 所得水凝胶的膨胀率为 96.6 g/g。 其结构鉴定见图 2， γ-聚谷氨 酸 -ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶 NMR图谱，可以看到 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸的化学 结合， 形成了交联聚合物。 图 3的红外图谱同样证明了 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚 合物水凝胶的形成。 由于 ε-聚赖氨酸有很多游离氨基， 在 1546cm- 1和 1113cm- 1处特征 峰明显， 交联形成水凝胶后， 在 ε-聚赖氨酸的氨基与 γ-聚谷氨酸的羧基之间发生反应生 成酰胺键，在形成的聚合物中游离氨基数量大大减少，故这两处特征峰不再明显。此外， 在 3500〜3300 cm 1的位置出现的一个宽峰也是水凝胶的特征吸收峰， 主要是羟基的伸縮 振动和酰胺键上的 N-H伸縮振动引起的。图 4的扫描电镜显示了制备的水凝胶的表面形 貌， 表明本发明制备的水凝胶为三维孔状结构， 孔径 100〜200μηι之间， 适合作为创伤 敷料。
实施例 2:
室温下将 5.0 g y-聚谷氨酸 （100万〜 120万道尔顿， 含有 0.039mol羧基） 溶解于 50 mL的 0.1 mol/L MES缓冲液 （pH 5.0 ) 中， 并搅拌至形成澄清溶液。 室温下将 1.99 g i> 聚赖氨酸（3000〜4500道尔顿， 含有 0.0156mol氨基）溶解于 50 mL 0.1 mol/L MES缓冲 液（pH 5.0)， 逐滴将 ε-聚赖氨酸溶液滴加到聚谷氨酸溶液中， 搅拌使溶液均匀混合。 将 4.49 g ( 0.023mol) EDC和 5.08 g ( 0.023mol) sulfo-NHS加入到上述 y-聚谷氨酸和 ε- 聚赖氨酸混合液中， 控制 y-聚谷氨酸所含有的羧基： 聚赖氨酸所含有的氨基： EDC: Sulfo-NHS的投料摩尔比为 1 : 0.4： 0.6： 0.6， 冰浴反应 30 min， 之后室温反应 2h形成 水凝胶。 将形成的水凝胶放在透析袋中， 置于去离子水中透析至溶胀平衡， 之后采用冷 冻干燥或者真空干燥得到海绵状敷料， 所得水凝胶的膨胀率为 73.8 g/g。
实施例 3 :
室温下将 6.0 g y-聚谷氨酸 （100万〜 120万道尔顿， 含有 0.047mol羧基） 溶解于 50 mL的 0.1 mol/L MES缓冲液 （pH 5.0 ) 中， 并搅拌至形成澄清溶液。 室温下将 3.0 g e- 聚赖氨酸（3000〜4500道尔顿， 含有 0.0235mol氨基）溶解于 50 mL 0.1 mol/L MES缓冲 液（pH 5.0)， 逐滴将 ε-聚赖氨酸溶液滴加到聚谷氨酸溶液中， 搅拌使溶液均匀混合。 将 7.95 g ( 0.0188mol) CMC加入到上述 y-聚谷氨酸和 聚赖氨酸混合液中， 控制 γ-聚谷 氨酸所含有的羧基： 聚赖氨酸所含有的氨基： CMC的投料摩尔比为 1 : 0.5： 0.4， 冰 浴反应 30 min， 之后室温反应 2h形成水凝胶。 将形成的水凝胶放在透析袋中， 置于去 离子水中透析至溶胀平衡， 之后采用冷冻干燥或者真空干燥得到海绵状敷料， 所得水凝 胶的膨胀率为 48.4 g/g。
实施例 4:
室温下将 4.5 g y-聚谷氨酸 （100万〜 120万道尔顿， 含有 0.035mol羧基） 溶解于 50 ml的 0.1 mol/L MES缓冲液 （pH 5.0 ) 中， 并搅拌至形成澄清溶液。 室温下将 2.24 g ε- 聚赖氨酸（3000〜4500道尔顿， 含有 0.0175mol氨基）溶解于 50 mL 0.1 mol/L MES缓冲 液（pH 5.0)， 逐滴将 ε-聚赖氨酸溶液滴加到聚谷氨酸溶液中， 搅拌使溶液均匀混合。 将 7.08 (0.028mol) 伍德沃德氏试剂 K加入到上述 y-聚谷氨酸和 ε-聚赖氨酸混合液中， 控制 y-聚谷氨酸所含有的羧基： 聚赖氨酸所含有的氨基： 伍德沃德氏试剂 Κ的投料摩 尔比为 1 : 0.5： 0.8， 冰浴反应 30 min， 之后室温反应 2h形成水凝胶。 将形成的水凝胶 放在透析袋中， 置于去离子水中透析至溶胀平衡， 之后采用冷冻干燥或者真空干燥得到 海绵状敷料， 所得水凝胶的膨胀率为 52.7 。
实施例 5:
同实施例 1的方法， 所不同的是控制 y-聚谷氨酸所含有的羧基： 聚赖氨酸所含有 的氨基： EDC: NHS的投料摩尔比为 1 : 0.25： 0.25： 0.25， 结果所得水凝胶的膨胀率为 12.5
实施例 6:
同实施例 1的方法， 所不同的是控制 y-聚谷氨酸所含有的羧基： 聚赖氨酸所含有 的氨基： EDC: NHS的投料摩尔比为 1 : 0.5： 1： 1，结果所得水凝胶的膨胀率为 38.6 。 实施例 7:
同实施例 2的方法， 所不同的是控制 y-聚谷氨酸所含有的羧基： 聚赖氨酸所含有 的氨基： EDC: Sulfo-NHS的投料摩尔比为 1 : 0.25： 0.25： 0.25， 结果所得水凝胶的膨 胀率为 30.2 。
实施例 8:
同实施例 2的方法， 所不同的是控制 y-聚谷氨酸所含有的羧基： 聚赖氨酸所含有 的氨基： EDC: Sulfo-NHS的投料摩尔比为 1 : 0.5： 1： 1， 结果所得水凝胶的膨胀率为 42.3
实施例 9:
同实施例 3的方法， 所不同的是控制 y-聚谷氨酸所含有的羧基： 聚赖氨酸所含有 的氨基： CMC的投料摩尔比为 1 : 0.25： 0.25， 结果所得水凝胶的膨胀率为 33.7 。 实施例 10:
同实施例 3的方法， 所不同的是控制 y-聚谷氨酸所含有的羧基： 聚赖氨酸所含有 的氨基： CMC的投料摩尔比为 1 : 0.5： 1， 结果所得水凝胶的膨胀率为 39.4 。
实施例 11 :
同实施例 4的方法， 所不同的是控制 y-聚谷氨酸所含有的羧基： 聚赖氨酸所含有 的氨基： 伍德沃德氏试剂 Κ的投料摩尔比为 1 : 0.25： 0.25， 结果所得水凝胶的膨胀率 为 36.6 g/g。
实施例 12:
同实施例 4的方法， 所不同的是控制 y-聚谷氨酸所含有的羧基： 聚赖氨酸所含有 的氨基：伍德沃德氏试剂 Κ的投料摩尔比为 1 : 0.5： 1，结果所得水凝胶的膨胀率为 43.4 g/g°
实施例 13:
同实施例 4的方法， 所不同的是冰浴反应 lOmin, 再室温 5h形成水凝胶， 结果所 得水凝胶的膨胀率为 35.8 g/g。
实施例 14:
同实施例 4的方法， 所不同的是冰浴反应 120min， 再室温 24h形成水凝胶， 结果 所得水凝胶的膨胀率为 26.9 g/g。
对比例 1 :
室温下将 4.0 g y-聚谷氨酸 （100万〜 120万道尔顿， 含有 0.031mol羧基） 溶解于 50 mL的 0.1 mol/L MES缓冲液（pH 5.0)中，并搅拌至形成澄清溶液。将 4.17g (0.0217mol) EDC和 2.50g (0.0217mol) NHS 加入到 y-聚谷氨酸溶液中， 控制 y-聚谷氨酸所含有的 羧基： EDC: NHS的投料摩尔比为 1 : 0.7： 0.7， 冰浴反应 30 min， 之后室温反 6h形成 水凝胶。 将形成的水凝胶放在透析袋中， 置于去离子水中透析至溶胀平衡， 之后采用冷 冻干燥或者真空干燥得到海绵状敷料， 所得水凝胶的膨胀率为 3.4 g/g。
对比例 2:
室温下将 1.78 g 聚赖氨酸（3000〜4500道尔顿，含有 0.014mol氨基）溶解于 50 mL 的 0.1 mol/L MES缓冲液 （pH 5.0) 中， 并搅拌至形成澄清溶液。 将 4.16 g EDC
(0.0217mmol) 禾 B 2.50 g NHS (0.0217mmol) 加入到 ε-聚赖氨酸溶液中， 控制 ε-聚赖 氨酸所含有的氨基： EDC: NHS的投料摩尔比为 0.45: 0.7： 0.7。 冰浴反应 30 min， 之 后室温反 9h形成水凝胶。 将形成的水凝胶放在透析袋中， 置于去离子水中透析至溶胀 平衡，之后采用冷冻干燥或者真空干燥得到海绵状敷料，所得水凝胶的膨胀率为 2.8 g/go 对比例 3:
室温下将 4.0 g y-聚谷氨酸 （100万〜 120万道尔顿， 含有 0.031mol羧基） 溶解于 50 mL的 O.l mol/L MES缓冲液 （pH 5.0) 中， 并搅拌至形成澄清溶液。 室温下将 1.78 g i> 聚赖氨酸 （3000〜4500道尔顿， 含有 0.014mol氨基） 溶解于 50 mL 0.1 mol/L MES缓冲 液（pH 5.0)， 逐滴将 ε-聚赖氨酸溶液滴加到聚谷氨酸溶液中， 控制 y-聚谷氨酸所含有的 羧基： 聚赖氨酸所含有的氨基的投料摩尔比为 1 :0.45， 搅拌使溶液均匀混合， 不能形 成水凝胶。
实施例 15:
将实施例 1-4中的海绵状敷料研磨粉碎， 用铝复合膜分装， 制成干凝胶粉剂。
实施例 16:
取实施例 1-4中的海绵状敷料 5g， 加 30g水制成软材， 分装于聚乙烯管中， 密封而 制成水凝胶剂。
实施例 17:
取实施例 1-4中的海绵状敷料 5g，加 20g水制成软材，压成薄膜片置于聚乙烯膜上， 80 °C气流烘干， 使其含水量 40 wt%， 再复合上聚乙烯透气膜， 剪切后用铝复合膜密封 而制成凝胶膜剂。
实验例 18: 细胞相容性实验。
向实施例 1中的海绵状敷料中， 加入 3倍敷料重量的水制成软材水凝胶， 将成纤维 细胞以 5 X 104 /cm2的浓度，接种到水凝胶的表面， 37 体外培养 6h。细胞用 LIVE/DEAD 荧光试剂盒染色， 活细胞被染上绿色的荧光物质 (calcein-AM ), 而死细胞则被染上红色 的荧光物质 (EthD-I ) o 然后用共聚光激光扫描显微镜 （CLSM) 观测细胞存活情况。 参 见图 5， a)中的红色荧光物质明显高于 b)， 说明 γ-聚谷氨酸水凝胶支架上的细胞有相当 数量的细胞死亡， 而 γ-聚谷氨酸 -ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶支架上的细胞， 大部分都 是存活的， 这显示了本发明的水凝胶良好的生物相容性。
实验例 19: 伤口愈合实验。
在家兔背部剪毛后， 再用硫化钠溶液脱毛 48h， 每只家兔皮下注射 0.5%利多卡因注 射液 0.5 mL局麻， 供 3处， 在局麻部位用手术剪剪出直径约 1.0 cm的圆形全皮切口三 处， 用 70v/v%酒精消毒， 将实施例 1 中的创伤敷料涂布在伤口处， 用石蜡脱脂棉纱布 覆盖， 再用绷带包扎， 对照组一组仅用纱布覆盖后绷带包扎， 另外一组采用 γ-聚谷氨酸 水凝胶敷料涂敷。 实验过程中各组均未发生细菌感染现象， 分别于 0， 7， 14天后观察 伤口愈合情况。 参见图 6， 随着治疗时间的延长， 三组家兔伤口均有愈合的现象， 水凝 胶敷料处理组均优于仅用纱布处理组；使用 γ-聚谷氨酸 -ε-聚赖氨酸交联聚合物水凝胶敷 料处理组， 伤口面积只有 γ-聚谷氨酸水凝胶对照组的 40%， 伤口明显变小， 表面光滑平
Figure imgf000014_0001
整， 显示出优良的生物相容性及促进伤口愈合的能力。
综合评价： 本发明的 y-聚谷氨酸 聚赖氨酸水凝胶创伤敷料， 生物相容性良好， 有 利于细胞附着生长， 对伤口愈合具有促进作用， 有效减少组织液渗出， 在医用创伤敷料 领域应用前景广阔。

Claims

权 利 要 求 书
1、 一种基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶， 其特征在于， 其由 γ- 聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联制备得到， 且具有如下结构单元的聚合物：
Figure imgf000015_0001
其中， m取值 15〜45中的自然数， n取值 3900〜17000中的自然数， x取值 5-40中 的自然数。
2、 根据权利要求 1所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶， 其 特征在于， 所述的 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸都是分别由微生物发酵法制备得到。
3、根据权利要求 1或 2所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶， 其特征在于， y-聚谷氨酸的分子量为 50万〜 220万道尔顿， ε-聚赖氨酸的分子量为 2000-5500道尔顿。
4、 一种基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制备方法， 其特征在 于， 它包括如下步骤：
(1) 将含 聚赖氨酸的 2- (Ν-吗啡啉） 乙磺酸缓冲液滴加至含 y-聚谷氨酸的 2- (N- 吗啡啉） 乙磺酸缓冲液中， 搅拌混合均匀；
(2) 将交联剂加入到步骤 (1)得到的反应体系中， 冰浴反应 10〜120min， 再室温反应 2〜24h形成水凝胶；
(3) 将步骤 (2)形成的水凝胶放在透析袋中， 置于去离子水中透析至溶胀平衡， 之后 采用冷冻干燥或者真空干燥， 得到海绵状敷料。
5、 根据权利要求 4所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制 备方法， 其特征在于， 步骤 (1)中， 所述的 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸都是分别由微生物发 酵法制备得到。
6、 根据权利要求 4所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制 权 利 要 求 书 备方法， 其特征在于， 步骤 (1)中， y-聚谷氨酸的分子量为 50万〜 220万道尔顿， ε-聚赖 氨酸的分子量为 2000〜5500道尔顿。
7、 根据权利要求 4所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制 备方法， 其特征在于， 步骤 (1)中， 所述的MES缓冲液为0.1 mol/L pH 5.0的MES缓冲 液。
8、 根据权利要求 4所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制 备方法， 其特征在于， 步骤 (1)中， 含 聚赖氨酸的 MES缓冲液为均相溶液， 其中 ε-聚 赖氨酸的浓度为 20g/L〜160g/L; 含 y-聚谷氨酸的 MES缓冲液为均相溶液， 其中 y-聚谷 氨酸的质量百分含量为 40g/L〜200g/L。
9、 根据权利要求 4所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制 备方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 所述交联剂为 1- (3-二甲基氨基丙基） -3-乙基碳二亚 胺和 Ν-羟基琥珀酰亚胺的组合， 或者为 1- (3-二甲基氨基丙基） -3-乙基碳二亚胺和 Ν- 羟基硫代琥珀酰亚胺的组合，或者为 1-环己基 -2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐，或者 为伍德沃德氏试剂 Κ。
10、根据权利要求 9所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制 备方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 所述交联剂为 1- (3-二甲基氨基丙基） -3-乙基碳二亚 胺和 Ν-羟基琥珀酰亚胺的组合， 则 γ-聚谷氨酸所含羧基： 聚赖氨酸所含氨基： 1- (3- 二甲基氨基丙基） -3-乙基碳二亚胺： Ν-羟基琥珀酰亚胺的投料摩尔比例范围为 1 : 0.25〜0.5： 0.25〜1： 0.25〜1。
11、根据权利要求 9所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制 备方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 所述交联剂为 1- (3-二甲基氨基丙基） -3-乙基碳二亚 胺和 Ν-羟基硫代琥珀酰亚胺的组合， 则 γ-聚谷氨酸所含羧基： 聚赖氨酸所含氨基： 1-
(3-二甲基氨基丙基） -3-乙基碳二亚胺： Ν-羟基硫代琥珀酰亚胺的投料摩尔比例范围为 1： 0.25〜0.5： 0.25〜1： 0.25〜1。
12、根据权利要求 9所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制 备方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 所述交联剂为 1-环己基 -2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯 磺酸盐， 则 γ-聚谷氨酸所含羧基： 聚赖氨酸所含氨基： 1-环己基 -2-吗啉乙基碳二亚胺 对甲苯磺酸盐的投料摩尔比例范围为 1 : 0.25〜0.5： 0.25〜1。
13、根据权利要求 9所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制 权 利 要 求 书 备方法， 其特征在于， 步骤 (2)中， 所述交联剂为伍德沃德氏试剂 K， 在 γ-聚谷氨酸所含 羧基： 聚赖氨酸所含氨基： 伍德沃德氏试剂 Κ的投料摩尔比例范围为 1 : 0.25-0.5： 0.25〜1。
14、根据权利要求 4所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制 备方法， 其特征在于， 将所述海绵状敷料研磨粉碎， 用铝复合膜分装， 制得干凝胶粉剂。
15、根据权利要求 4所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制 备方法， 其特征在于， 将所述海绵状敷料加 1〜10倍重量的水制成软材， 分装于聚乙烯 管中， 密封包装， 制得水凝胶剂。
16、根据权利要求 4所述的基于 γ-聚谷氨酸与 ε-聚赖氨酸交联聚合物的水凝胶的制 备方法， 其特征在于， 将所述海绵状敷料加 1〜5倍重量的水制成软材， 压成薄膜片置于 聚乙烯膜上， 70〜90 °C气流烘干， 使其含水量为 20〜60 wt%， 再复合上聚乙烯透气膜， 剪切后用铝复合膜密封， 制得凝胶膜剂。
17、 权利要求 4〜16中任意一项方法制备得到的水凝胶。
18、 权利要求 1〜3中任意一项或权利要求 17所述的水凝胶在制备医用创伤敷料中 的应用。
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