CN113368037B - 一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶及其制备方法和应用，属于纳米材料技术领域。本发明将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与中分子量壳聚糖和β‑甘油磷酸钠水溶液的混合液混合，即得到载牛乳铁蛋白肽纳米粒的壳聚糖温敏水凝胶。本发明制备载牛乳铁蛋白肽纳米粒的水凝胶具有温敏成胶性、可降解性、生物相容性和体外抑菌活性，该复合材料可为制备临床治疗细菌性奶牛乳房炎制剂提供新选择。

Description

一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及纳米材料技术领域，尤其涉及一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
水凝胶是一种三维的交联网络结构，它可以吸收和保留大量的水份，而不会溶解或失去其三维结构。由于水凝胶与高含水量的生物组织相似，且具有抗菌活性，因此可用于许多生物医学、组织修复和制药领域，如抗菌伤口敷料、医用支架、骨组织填充材料等。温敏型水凝胶对温度具有独特的智能响应性，预先加入到溶胶-凝胶液体中的治疗药物、生长因子可以通过微创的方式直接注入到所需的组织、器官或体腔内，并随着温度的变化而发生凝胶化。壳聚糖(CS)是一种线性、可生物降解、具有生物相容性和抗菌活性的聚合物，常被制成温敏型水凝胶，通常，向体内植入CS很少引起特异性反应。在CS溶液中添加β-甘油磷酸钠(β-glycerophosphate，β-GP)的功能是在一定的温度下可与CS形成牢固的氢键，从而使混合溶液转变为凝胶。以壳聚糖基温敏水凝胶为药物释放载体，可以保护药物免受外界环境的影响，从而提高药物利用效率和生物相容性，同时可减少其在体内的生物毒副作用。
然而，CS/β-GP水凝胶的局限性之一是它对蛋白质、多肽和低分子质量药物的快速释放速率。因此，现需研究一种可经乳腺导管注射，能够在体外可持续释放药物、具有抗菌活性的复合纳米材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶及其制备方法和应用，本发明制备的温敏水凝胶具有良好的物理化学表征、可降解性和生物相容性，在体外可持续释放药物发挥抑菌活性。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶的制备方法，包含以下步骤：
将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与溶液A混合，即得到载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶；
所述溶液A为质量浓度为1～5％的中分子量壳聚糖溶液与质量浓度为50～60％的β-甘油磷酸钠水溶液的混合溶液；其中中分子量壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠水溶液的体积比为0.5～4：6～9.5。
进一步的，所述溶液A中，中分子量壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠水溶液混合的温度为0～4℃，混合的时间为20～40min。
进一步的，所述中分子量壳聚糖的分子量为300000～500000Da。
进一步的，所述载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与溶液A的质量体积比为50～70mg：1～5mL。
进一步的，载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与溶液A混合后胶凝的温度为34～40℃，成胶的时间为3～8min。
进一步的，所述载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉的制备方法为：
1)将低分子量壳聚糖溶于冰醋酸溶液中，调整溶液pH为3～5，得到低分子量壳聚糖溶液；
2)将牛乳铁蛋白肽加入到低分子量壳聚糖溶液中反应得到反应液A；
3)将三聚磷酸钠溶液加入反应液A中继续反应至得到淡蓝色乳光分散液；
4)将步骤3)的分散液与蔗糖溶液混合预冻至共晶点，之后进行真空冷冻干燥即得到所述冻干粉。
进一步的，所述冰醋酸溶液的体积浓度为0.01～0.5％。
进一步的，所述低分子量壳聚糖溶液和三聚磷酸钠溶液的浓度独立的为0.5～2mg/mL。
进一步的，所述低分子量壳聚糖的分子量为50000～19000Da。
进一步的，所述牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比为0.5～1.5mg：5～15mL：25～35mL。
进一步的，所述步骤2)的反应温度为0～4℃，反应时间为5～15min。
进一步的，所述步骤3)的反应温度为0～4℃，反应时间为20～40min。
进一步的，所述蔗糖溶液的质量浓度为2～8％；所述分散液与蔗糖溶液的体积比为1：2～2：1。
进一步的，所述真空冷冻干燥的条件为：冷冻温度为-75～-80℃，压力0.05～0.15Pa，冷冻时间22～26h。
本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶。
本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶在制备预防和治疗奶牛乳房炎制剂中的应用。
本发明的有益效果：
本发明制备得到的载BLfcin-NPs复合温敏水凝胶的成胶时间短，具有良好的物理化学表征、可降解性和生物相容性，在体外可持续释放药物发挥抑菌活性，可以作为一种替代抗生素的新型复合纳米材料，应用于制备预防和治疗奶牛乳房炎的制剂中。
附图说明
图1为MCS/β-GP水凝胶、BLfcin水凝胶和实施例1的水凝胶的冷冻扫描电镜照片；
图2为实施例1的水凝胶在PBS缓冲液中的降解情况图；
图3为MCS/β-GP水凝胶、BLfcin水凝胶和实施例2的水凝胶对奶牛乳腺上皮细胞的细胞毒性试验结果图；
图4为MCS/β-GP水凝胶、BLfcin水凝胶和实施例3的水凝胶对S.aureus(A)和E.coli(B)的抑菌圈结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶的制备方法，包含以下步骤：
将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与溶液A混合，即得到载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶；
所述溶液A为质量浓度为1～5％的中分子量壳聚糖溶液与质量浓度为40～60％的β-甘油磷酸钠水溶液的混合溶液；其中中分子量壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠水溶液的体积比为0.5～4：6～9.5。
在本发明中，所述中分子量壳聚糖溶液的质量浓度为1～5％，优选为2～4％，进一步优选为3％，所述中分子量壳聚糖的分子量为300000～500000Da，优选为350000～450000Da，进一步优选为400000Da，所述中分子量壳聚糖的黏度为200～800cP，脱乙酰度为75～85％，优选为黏度为300～700cP，脱乙酰度为78～82％，进一步优选为黏度为500cP，脱乙酰度为80％。
在本发明中，所述β-甘油磷酸钠水溶液的质量浓度为50～60％，优选为52～58％，进一步优选为53～57％，更优选为55％。
在本发明中，所述中分子量壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠水溶液的体积比为0.5～4：6～9.5，优选为1～3：7～9，进一步优选为1：9或2：8或3：7。
在本发明中，配制溶液A时，需要将中分子量壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠水溶液置于0～4℃的冰浴中混合20～40min，至得到均匀透亮的混合液，优选为在1～3℃的冰浴中混合25～35min，进一步优选为在2℃的冰浴中混合30min。
在本发明中，所述载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与溶液A的体积比为50～70mg：1～5mL，优选为55～65mg：2～4mL，进一步优选为60mg：3mL。
在本发明中，所述载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与溶液A混合后胶凝的温度为34～40℃，成胶的时间为3～8min，优选为胶凝的温度35～38℃，成胶时间4～7min，进一步优选为胶凝的温度36～37℃，成胶的时间5～6min，更优选为胶凝的温度37℃，成胶的时间为5min。
在本发明中，所述载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉的制备方法为：
1)将低分子量壳聚糖溶于冰醋酸溶液中，调整溶液pH为3～5，得到低分子量壳聚糖溶液；
2)将牛乳铁蛋白肽加入到低分子量壳聚糖溶液中反应得到反应液A；
3)将三聚磷酸钠溶液加入反应液A中继续反应至得到淡蓝色乳光分散液；
4)将步骤3)的分散液与蔗糖溶液混合预冻至共晶点，之后进行真空冷冻干燥即得到所述冻干粉。
在本发明中，所述冰醋酸溶液的体积浓度为0.01～0.5％，优选为0.05～0.4％，进一步优选为0.1～0.3％，更优选为0.2％。
在本发明中，所述低分子量壳聚糖溶液的浓度为0.5～2mg/mL，优选为0.6～1.8mg/mL，进一步优选为0.8～1.5mg/mL，更优选为1.0mg/mL。在本发明中，所述低分子量壳聚糖的分子量为50000～190000Da，优选为55000～180000Da，进一步优选为70000～150000Da。在本发明中，所述低分子量壳聚糖的黏度为20～300cP，脱乙酰度＞75％，优选为黏度为50～200cP，脱乙酰度＞80％。
在本发明中，用浓度为0.5～1.5mg/mL的氢氧化钠溶液调整低分子量壳聚糖溶液pH为3～5，优选为用浓度为0.8～1.2mg/mL的氢氧化钠溶液调整低分子量壳聚糖溶液pH为3.5～4.5，进一步优选为用浓度为1.0mg/mL的氢氧化钠溶液调整低分子量壳聚糖溶液pH为4.0。
在本发明中，所述三聚磷酸钠溶液的浓度为0.5～2mg/mL，优选为0.8～1.5mg/mL，进一步优选为1.0mg/mL。
在本发明中，所述牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比为0.5～1.5mg：5～15mL：25～35mL，优选为0.8～1.2mg：8～12mL：28～32mL，进一步优选为1.0mg：10mL：30mL。
在本发明中，低分子量壳聚糖溶液与牛乳铁蛋白肽溶液反应之前，需要将低分子量壳聚糖溶液在55～65℃的水浴中保温5～15min，优选为在58～62℃的水浴中保温7～12min，进一步优选为在60℃的水浴中保温10min。
在本发明中，所述步骤2)的反应温度为0～4℃，反应时间为5～15min，优选为反应温度为1～3℃，反应时间为8～12min，进一步优选为反应温度为2℃，反应时间为10min。
在本发明中，所述步骤3)的反应温度为0～4℃，反应时间为20～40min，优选为反应温度为1～3℃，反应时间为25～35min，进一步优选为反应温度为2℃，反应时间为30min。
在本发明中，所述蔗糖溶液的质量浓度为2～8％，优选为3～7％，进一步优选为4～6％，更优选为5％。
在本发明中，所述分散液与蔗糖溶液的体积比为1：2～2：1，优选为4：10～3：2，进一步优选为1：1。
在本发明中，所述真空冷冻干燥的条件为：冷冻温度为-75～-80℃，压力0.05～0.15Pa，冷冻时间22～26h，优选为冷冻温度为-76～-79℃，压力0.08～0.12Pa，冷冻时间23～25h，进一步优选为冷冻温度为-78℃，压力0.1Pa，冷冻时间24h。
本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶。
本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶在制备预防和治疗奶牛乳房炎制剂中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉的制备：
将低分子量壳聚糖溶于0.2％冰醋酸溶液中，制成1mg/ml的溶液，用1mol/L的氢氧化钠溶液将其pH值调整为4.5，高压灭菌后备用；另精密称取三聚磷酸钠溶于纯水中，制成浓度为1mg/ml的溶液，经0.22μm一次性针式滤器过滤除菌，随后置于冰箱中备用。将低分子量壳聚糖溶液置于60℃水浴中预热10min，在磁力搅拌条件下，加入一定量的牛乳铁蛋白肽混合均匀，随后恒速滴加三聚磷酸钠溶液，搅拌30min后即得具有淡蓝色乳光的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒分散液，其中牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比为1.0mg：10mL：30mL。所述低分子量壳聚糖的分子量为150000Da。
将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒分散液与5％的蔗糖溶液混合均匀后置于西林瓶中，西林瓶不塞盖，放置在预冻架上，在真空冷冻干燥机的冷陷中预冻至共晶点，之后在-75℃、0.1Pa下真空冷冻干燥24h，即得到冻干粉，其中分散液和蔗糖溶液的体积比为1：2。
MCS/β-GP混合液的制备：
称取2g干燥至恒重的MCS，在磁力搅拌的情况下加入到0.1mol/L的盐酸溶液中，配置成2％的中分子量壳聚糖溶液，在室温搅拌24h至完全溶解，灭菌后置于4℃冰箱中备用。称取适量β-GP溶解于纯水中，配置成55％的β-GP水溶液，用0.22um一次性针式滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱中备用。将55％的β-GP水溶液和2％MCS溶液按体积比为1：9的比例混合，在冰浴条件下(0℃)持续搅拌30min，得到均匀透亮的MCS/β-GP混合液。所述中分子量壳聚糖的分子量为300000Da。
将60mg的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与3ml的MCS/β-GP混合液在37℃下5min后胶凝化，即得到温敏水凝胶。
实施例2
载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉的制备：
将低分子量壳聚糖溶于0.5％冰醋酸溶液中，制成0.8mg/ml的溶液，用1.2mol/L的氢氧化钠溶液将其pH值调整为4.0，高压灭菌后备用；另精密称取三聚磷酸钠溶于纯水中，制成浓度为0.8mg/ml的溶液，经0.22μm一次性针式滤器过滤除菌，随后置于冰箱中备用。将低分子量壳聚糖溶液置于55℃水浴中预热15min，在磁力搅拌条件下，加入一定量的牛乳铁蛋白肽混合均匀，随后恒速滴加三聚磷酸钠溶液，搅拌30min后即得具有淡蓝色乳光的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒分散液，其中牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比为1.2mg：14mL：32mL。所述低分子量壳聚糖的分子量为120000Da。
将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒分散液与6％的蔗糖溶液混合均匀后置于西林瓶中，西林瓶不塞盖，放置在预冻架上，在真空冷冻干燥机的冷陷中预冻至共晶点，之后在-80℃、0.08Pa下真空冷冻干燥23h，即得到冻干粉，其中分散液和蔗糖溶液的体积比为2：1。
MCS/β-GP混合液的制备：
称取3g干燥至恒重的MCS，在磁力搅拌的情况下加入到0.1mol/L的盐酸溶液中，配置成3％的中分子量壳聚糖溶液，在室温搅拌24h至完全溶解，灭菌后置于4℃冰箱中备用。称取适量β-GP溶解于纯水中，配置成60％的β-GP水溶液，用0.22um一次性针式滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱中备用。将60％的β-GP水溶液和3％MCS溶液按体积比为2：8的比例混合，在冰浴条件下(2℃)持续搅拌30min，得到均匀透亮的MCS/β-GP混合液。所述中分子量壳聚糖的分子量为400000Da。
将55mg的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与2ml的MCS/β-GP混合液在38℃下4min后胶凝化，即得到温敏水凝胶。
实施例3
载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉的制备：
将低分子量壳聚糖溶于0.3％冰醋酸溶液中，制成1.2mg/ml的溶液，用0.8mol/L的氢氧化钠溶液将其pH值调整为5.0，高压灭菌后备用；另精密称取三聚磷酸钠溶于纯水中，制成浓度为1.2mg/ml的溶液，经0.22μm一次性针式滤器过滤除菌，随后置于冰箱中备用。将低分子量壳聚糖溶液置于65℃水浴中预热5min，在磁力搅拌条件下，加入一定量的牛乳铁蛋白肽混合均匀，随后恒速滴加三聚磷酸钠溶液，搅拌30min后即得具有淡蓝色乳光的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒分散液，其中牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比为0.8mg：8mL：28mL。所述低分子量壳聚糖的分子量为190000Da。
将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒分散液与4％的蔗糖溶液混合均匀后置于西林瓶中，西林瓶不塞盖，放置在预冻架上，在真空冷冻干燥机的冷陷中预冻至共晶点，之后在-78℃、0.12Pa下真空冷冻干燥25h，即得到冻干粉，其中分散液和蔗糖溶液的体积比为1：1。
MCS/β-GP混合液的制备：
称取4g干燥至恒重的MCS，在磁力搅拌的情况下加入到0.1mol/L的盐酸溶液中，配置成4％的中分子量壳聚糖溶液，在室温搅拌24h至完全溶解，灭菌后置于4℃冰箱中备用。称取适量β-GP溶解于纯水中，配置成50％的β-GP水溶液，用0.22um一次性针式滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱中备用。将50％的β-GP水溶液和4％MCS溶液按体积比为3：7的比例混合，在冰浴条件下(4℃)持续搅拌30min，得到均匀透亮的MCS/β-GP混合液。所述中分子量壳聚糖的分子量为500000Da。
将65mg的载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与4ml的MCS/β-GP混合液在36℃下3min后胶凝化，即得到温敏水凝胶。
对比例1
采用与实施例1相同的制备方法，区别在于55％的β-GP水溶液和2％MCS溶液的体积比为1：1。
实验例1
测量实施例1～3和对比例1的胶凝时间，结果见表1
表1
β-GP：MCS 胶凝时间/min
1：9 5
2：8 4
3：7 3
1：1 ＞30min
实验例2
用冷冻扫描电子显微镜对实施例1制备得到的水凝胶的形貌进行了表征，结果见图1，从图1中可以看出，MCS/β-GP水凝胶，BLfcin水凝胶以及BLfcin-NPs水凝胶均显示出多孔结构，且存在纳米和微米尺寸的孔隙。MCS/β-GP水凝胶的Cyro-SEM图像显示出相对未交联的网络和刚性结构，交联结构不紧密，有中断。在水凝胶中加入BLfcin或BLfcin-NPs后，水凝胶具有更高的孔隙率和更均匀的孔径，交联结构更紧密。BLfcin-NPs水凝胶孔径在20-60μm之间，其多孔结构可有利于药物从中释放；高的孔隙率也可确保水凝胶与体液中溶质分子进行交换，水凝胶吸水溶胀后可促进药物从纳米粒中释放。
实验例3
水凝胶的体外降解情况测试：通过观察用PBS浸泡三周后水凝胶的剩余重量，考察水凝胶的降解情况。图2显示了MCS/β-GP水凝胶、含Blfcin水凝胶和含有Blfcin纳米粒水凝胶的剩余重量，由图可知，MCS/β-GP水凝胶、BLfcin水凝胶以及BLfcin-NPs水凝胶的剩余重量在21天后分别为21.28±1.05％、30.42±5.21％和30.54±3.82％。纳米颗粒的增加降低了降解速率，这可能是由于纳米颗粒对水凝胶结构的高度整合，纳米粒子的增加可能导致分子团聚和分子间相互作用的增强。
实验例4
细胞毒性试验：
取1ml实施例2的水凝胶加入到24孔细胞培养板中，置于37℃下使其形成凝胶。室温下去除多余水分后，在紫外光照射下灭菌40min，然后用无菌PBS清洗3次。加入1ml低血清高糖的DMEM细胞培养液和抗生素。置于37℃细胞培养箱中培养24、48和72h，获得的水凝胶浸提物使用0.22um滤膜过滤除菌，结果见图3。图3显示了BLfcin-NPs水凝胶浸提液作用于BMECs的体外细胞毒性试验结果。24、48和72h的水凝胶浸提液分别与BMECs培养1～3天，与对照组相比，MTT法显示所有水凝胶浸提液在培养过程中对细胞活力没有显著的负面影响，72h的水凝胶浸提液与BMECs培养3天后其细胞的活力高于90％，表明凝胶对于BMECs无细胞毒性，生物相容性高。
实验例5
体外抑菌试验：
用抑菌圈大小来评价纳米温敏水凝胶的抑菌性能。无菌条件下，将两种细菌悬液(1×108CFU/mL，100ul)均匀涂布于凝固后的固体培养基上，静置30min。将实施例3的水凝胶样品用直径为0.6cm的打孔器制成凝胶片，放置在培养基表面。在37℃恒温电热培养箱中孵育24h后，观察水凝胶与培养基接触面有无细菌生长，用数字游标卡尺获得抑制圈的直径，结果见图4和表2。
表2水凝胶抑菌圈的测定结果(
Figure BDA0003115769880000101
mm)
S.aureusATCC25923 E.coliATCC25922
MCS/β-GPHydrogel － －
BLfcinHydrogel 8.35±0.34<sup>A</sup> 7.90±0.25<sup>A</sup>
BLfcin-NPsHydrogel 17.15±0.11<sup>AB</sup> 16.63±0.72<sup>AB</sup>
注：与MCS/β-GP水凝胶组比较，A代表p<0.01，差异极显著；与载BLfcin水凝胶组相比，B代表p<0.01，差异极显著。
由以上实施例可知，本发明提供了一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶及其制备方法和应用，本发明制备得到的载BLfcin-NPs复合温敏水凝胶的成胶时间短，具有良好的物理化学表征、可降解性和生物相容性，在体外可持续释放药物发挥抑菌活性，可以作为一种替代抗生素的新型复合纳米材料，应用于制备预防和治疗奶牛乳房炎的制剂中。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
将载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与溶液A混合，即得到载牛乳铁蛋白肽纳米粒温敏水凝胶；
所述溶液A为质量浓度为1～5％的中分子量壳聚糖溶液与质量浓度为50～60％的β-甘油磷酸钠水溶液的混合溶液；其中中分子量壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠水溶液的体积比为0.5～4：6～9.5；
所述中分子量壳聚糖的分子量为300000～500000Da；
所述载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉的制备方法为：
1)将低分子量壳聚糖溶于冰醋酸溶液中，调整溶液pH为3～5，得到低分子量壳聚糖溶液；
2)将牛乳铁蛋白肽加入到低分子量壳聚糖溶液中反应得到反应液A；
3)将三聚磷酸钠溶液加入反应液A中继续反应至得到淡蓝色乳光分散液；
4)将步骤3)的分散液与蔗糖溶液混合预冻至共晶点，之后进行真空冷冻干燥即得到所述冻干粉；
所述低分子量壳聚糖的分子量为50000～19000Da。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述溶液A中，中分子量壳聚糖溶液与β-甘油磷酸钠水溶液混合的温度为0～4℃，混合的时间为20～40min；
所述中分子量壳聚糖的分子量为300000～500000Da。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与溶液A的质量体积比为50～70mg：1～5mL；
载牛乳铁蛋白肽壳聚糖纳米粒冻干粉与溶液A混合后胶凝的温度为34～40℃，成胶的时间为3～8min。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述冰醋酸溶液的体积浓度为0.01～0.5％；
所述低分子量壳聚糖溶液和三聚磷酸钠溶液的浓度独立的为0.5～2mg/mL；
所述低分子量壳聚糖的分子量为50000～19000Da。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述牛乳铁蛋白肽、三聚磷酸钠溶液与低分子量壳聚糖溶液的质量体积比为0.5～1.5mg：5～15mL：25～35mL。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2)的反应温度为0～4℃，反应时间为5～15min；
所述步骤3)的反应温度为0～4℃，反应时间为20～40min。
7.根据权利要求4～6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述蔗糖溶液的质量浓度为2～8％；所述分散液与蔗糖溶液的体积比为1：2～2：1；
所述真空冷冻干燥的条件为：冷冻温度为-75～-80℃，压力0.05～0.15Pa，冷冻时间22～26h。
8.权利要求1～7任一项所述制备方法得到的载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶。
9.权利要求8所述的载牛乳铁蛋白肽纳米粒壳聚糖温敏水凝胶在制备预防和治疗奶牛乳房炎制剂中的应用。
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