CN104761734A

CN104761734A - 一种氨基酸交联透明质酸钠凝胶的制备方法

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Publication number: CN104761734A
Application number: CN201410007366.1A
Authority: CN
Inventors: 魏长征; 李莉莉; 奚宏伟; 蒋丽霞
Original assignee: QISHENG BIOPREPARATIONS CO Ltd SHANGHAI
Current assignee: QISHENG BIOPREPARATIONS CO Ltd SHANGHAI
Priority date: 2014-01-08
Filing date: 2014-01-08
Publication date: 2015-07-08
Anticipated expiration: 2034-01-08
Also published as: CN104761734B

Abstract

本发明公开了一种氨基酸交联透明质酸钠凝胶的制备方法，其主要特征为其主要特征是以透明质酸钠为原料，通过强酸型离子交换树脂将其活化为酸性的低浓度的透明质酸，然后加入相转移催化剂将其转化为透明质酸有机盐，再通过有机溶剂溶解为一定浓度的溶液，然后加入一定量的氨基酸交联剂、活化剂、催化剂，由分子结构中具有两个或多个氨基的氨基酸或盐与透明质酸进行酰胺化交联反应而制备的抗高温、抗酶降的交联透明质酸钠凝胶。本发明为透明质酸的交联改性提供了新的途径，用本发明制备的凝胶在较低浓度下具有耐高温，抗酶解等特性，浓度为0.85%时，121℃灭菌20min后，仍保持凝胶状态，且动力粘度远远高于同等浓度的透明质酸钠凝胶，300U透明质酸酶酶解24h,降解百分率仅为23%；在整形美容、关节腔注射以及微创手术中有着巨大的应用前景。

Description

一种氨基酸交联透明质酸钠凝胶的制备方法

技术领域

本发明涉及一种氨基酸交联透明质酸凝胶的制备方法，属于生物医用材料领域的制备范畴，可用于注射美容。

背景技术

透明质酸（hyaluronan HA）是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖交替排列构成的阳离子多聚糖，天然HA易于被生物降解，在机体内停留时间很短，同时硬度和力学强度不够大，这限制了HA在软组织填充等方面的应用，因为这些应用需要透明质酸在体内有较长的保留时间。因此，为了增加透明质酸临床应用效果，利用交联的方法来提高透明质酸在体内的稳定性。将天然HA进行交联可得更大交联网状结构的衍生物，其化学和力学性能比HA更稳定且具有生物相容性和生物降解性。交联透明质酸的制备原理是使用一种或多种组合的化学交联剂，利用交联剂自身存在的基团与透明质酸上相关的一个或多个基团（羧基、羟基和乙酰基）发生反应，使透明质酸分子之间交联在一起，从而提高机械强度和抵御机体的降解作用。近年来交联HA制品在临床应用上取得了较大发展，使用的HA衍生物多为对其羧酸和羟基修饰而成，所以交联HA衍生物的应用开发和生产是国内外生物医用材料领域比较热门的课题。

目前国内外很多交联透明质酸产品都是采用DVS和BDDE作用于透明质酸的-OH，在交联剂和HA之间形成醚键，从而将HA分子连接起来。所使用的交联剂是传统化学交联剂，交联的材料细胞毒性大，生物相容性、机械性能以及抗降解性欠佳，很大程度上限制了其发展、应用。同时残留的交联剂会引起体内炎症反应，用常规方法减少交联剂使用量，得到的交联透明质酸耐高温和抗酶解较差，作为组织填充时填充效果不理想。因此使用无毒交联剂，成为交联透明质酸的发展方向。

以京尼平和原花青素为代表的天然交联剂，克服了传统化学交联剂的缺点，具有较小的细胞毒性，较好的生物相容性、抗酶降解性和机械性能，逐渐应用于生物材料的制备，但是交联后产物的颜色较深，不适用于透明质酸类注射美容产品的交联。此外，专利申请CN 101611063 B使用EDC作为活化剂、二赖氨酸作为交联剂来交联HA，但是文献报道该方法接枝率较低且二赖氨酸昂贵，而本发明使用赖氨酸作为交联剂，赖氨酸具有改善免疫系统，抵制单纯疱疹和带状疱疹病毒的功效，一些研究还表明，赖氨酸的功效还可能包括防止骨质流失（可造成骨质疏松症），因为它能够帮助身体组织吸收钙。结合其他氨基酸可以促进骨骼活力，并通过增加女性胶原蛋白预防骨质疏松症。增加胶原蛋白可以促进骨骼和结缔组织更强大和更柔韧。

发明内容

本发明的优点是：

本发明为一种氨基酸交联透明质酸钠凝胶的制备方法，与现有的使用化学交联剂交联透明质酸钠的技术相比，具有以下优点：

（1）本发明制备的交联透明质酸钠凝胶，以赖氨酸作为无毒交联剂，由其分子结构中两个氨基与透明质酸进行酰胺化交联反应而制得酰胺衍生物产品，从而达到无毒交联的目的。本发明为透明质酸的交联改性提供了新的途径。

（2）本发明制备的交联透明质酸凝胶，是以羧基的酰胺化反应将其交联，从而将酶识别位点保护起来，所以本发明制备的凝胶在较低浓度下具有耐高温、抗降解特性，作为美容注射产品，可延长在体内的存留时间。

（3）本发明制备的交联透明质酸凝胶在较低的浓度下具有较高的粘弹性，扩展了其在注射美容方面的应用。

附图说明

图1 HA和HA-Lys的动力粘度曲线图

图2 HA-Lys的透明质酸酶降解曲线图

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

实施例一

（1）用强酸型离子交换树脂活化4%（w/v）透明质酸钠水溶液，活化后滤液的PH=2.0。

（2）在滤液中加入四丁基氢氧化铵（透明质酸与四丁基氢氧化铵的摩尔比为2:1），室温搅拌反应2h后，冷冻干燥。

（3）取冻干后的透明质酸海绵2.5g溶于二甲基亚砜50ml，浓度为5%（w/v），将赖氨酸乙酯二盐酸盐（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:2）与2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物（CMPI）（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:2）混合后用2ml DMSO溶解，搅拌下滴加到反应介质中，加入三乙胺（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:1），室温搅拌过夜。首先用冰水对倍稀释，其次分别用水、NaOH， NaCl透析，再次用水透析至终点，得到交联透明质酸钠凝胶。

实施例二

（1）用强酸型离子交换树脂活化3%（w/v）透明质酸钠水溶液，活化后滤液的PH=2.5。

（2）在滤液中加入四丁基氢氧化铵（透明质酸与四丁基氢氧化铵的摩尔比为1:1），室温搅拌反应4h后，冷冻干燥。

（3）取冻干后的透明质酸海绵2.0g溶于二甲基亚砜50ml，浓度为4%（w/v），将赖氨酸乙酯二盐酸盐（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:1）与2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物（CMPI）（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:1）混合后用2ml DMSO溶解，搅拌下滴加到反应介质中，加入三乙胺（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比2:1），室温搅拌过夜。首先用冰水对倍稀释，其次分别用水、NaOH， NaCl透析，再次用水透析至终点，得到交联透明质酸钠凝胶。

实施例三

（1）用强酸型离子交换树脂活化2%（w/v）透明质酸钠水溶液，活化后滤液的PH=3。

（2）在滤液中加入四丁基氢氧化铵（透明质酸与四丁基氢氧化铵的摩尔比为1:2），室温搅拌反应6h后，冷冻干燥。

（3）取冻干后的透明质酸海绵1.5g溶于二甲基亚砜50ml，浓度为3%（w/v），将赖氨酸乙酯二盐酸盐（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1.5:1）与2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物（CMPI）（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1.5:1）混合后用2ml DMSO溶解，搅拌下滴加到反应介质中，加入三乙胺（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为3:1），室温搅拌过夜，首先用冰水对倍稀释，其次分别用水、NaOH， NaCl透析，再次用水透析至终点，得到交联透明质酸钠凝胶。

实施例四

（1）用强酸型离子交换树脂活化1%（w/v）透明质酸钠水溶液，活化后滤液的PH=3.5。

（2）在滤液中加入四丁基氢氧化铵（透明质酸与四丁基氢氧化铵的摩尔比为1:3），搅拌反应2h后，冷冻干燥。

（3）取冻干后的透明质酸海绵1.0g溶于二甲基亚砜50ml，浓度为2%（w/v），将赖氨酸乙酯二盐酸盐（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为2:1）与2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物（CMPI）（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为2:1）混合后用2ml DMSO溶解，搅拌下滴加到反应介质中，加入三乙胺（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为4:1），室温搅拌过夜。首先用冰水对倍稀释，其次分别用水、NaOH， NaCl透析，再次用水透析至终点，得到交联透明质酸钠凝胶。

实施例五

（1）用强酸型离子交换树脂活化0.7%（w/v）透明质酸钠水溶液，活化后滤液的PH=4。

（2）在滤液中加入四丁基氢氧化铵（透明质酸与四丁基氢氧化铵的摩尔比为1:4），搅拌反应4h后，冷冻干燥。

（3）取冻干后的透明质酸海绵0.5g溶于二甲基亚砜50ml，浓度为1%，将赖氨酸乙酯二盐酸盐（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:2）与2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物（CMPI）（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:2）用2ml DMSO混合溶解，滴加到反应介质中，加入少量三乙胺（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:1），室温搅拌过夜。首先用冰水对倍稀释，其次分别用水、NaOH， NaCl透析，再次用水透析至终点，得到交联透明质酸钠凝胶。

实施例六

（1）用强酸型离子交换树脂活化0.7%（w/v）透明质酸钠水溶液，活化后滤液的PH=2.0。

（2）在滤液中加入四丁基氢氧化铵（透明质酸与四丁基氢氧化铵的摩尔比为2:1），搅拌反应6h后，冷冻干燥。

（3）取冻干后的透明质酸海绵0.5g溶于二甲基亚砜50ml，浓度为1%，将赖氨酸乙酯二盐酸盐（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为2:1）与2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物（CMPI）（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为2:1）混合后用2ml DMSO溶解，搅拌下滴加到反应介质中，加入三乙胺（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为4:1），室温搅拌过夜。首先用冰水对倍稀释，其次分别用水、NaOH， NaCl透析，再次用水透析至终点，得到交联透明质酸钠凝胶。

实施例七

（1）用强酸型离子交换树脂活化1%（w/v）透明质酸钠水溶液，活化后滤液的PH=2.5。

（2）在滤液中加入四丁基氢氧化铵（透明质酸与四丁基氢氧化铵的摩尔比为1:1），搅拌反应2h后，冷冻干燥。

（3）取冻干后的透明质酸海绵1.0g溶于二甲基亚砜50g，浓度为2%，将赖氨酸乙酯二盐酸盐（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:1）与2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物（CMPI）（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:1）混合后用2ml DMSO溶解，搅拌下滴加到反应介质中，加入三乙胺（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为2:1），室温搅拌过夜。首先用冰水对倍稀释，其次分别用水、NaOH， NaCl透析，再次用水透析至终点，得到交联透明质酸钠凝胶。

实施例八

（2）在滤液中加入四丁基氢氧化铵（透明质酸与四丁基氢氧化铵的摩尔比为1:2），搅拌反应4h后，冷冻干燥。

（3）取冻干后的透明质酸海绵1.5g溶于二甲基亚砜50g，浓度为3%，将赖氨酸乙酯二盐酸盐（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:1）与2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物（CMPI）（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:1）用2ml DMSO混合溶解，搅拌下滴加到反应介质中，加入三乙胺（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为2:1），室温搅拌过夜。首先用冰水对倍稀释，其次分别用水、NaOH， NaCl透析，再次用水透析至终点，得到交联透明质酸钠凝胶。

实施例九

（1）用强酸型离子交换树脂活3%（w/v）透明质酸钠水溶液，活化后滤液的PH=3.5。

（2）在滤液中加入四丁基氢氧化铵（透明质酸与四丁基氢氧化铵的摩尔比为1:3），搅拌反应6h后，冷冻干燥。

（3）取冻干后的透明质酸海绵2.0g溶于二甲基亚砜50g，浓度为4%，将赖氨酸乙酯二盐酸盐（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:2）与2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物（CMPI）（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:2）混合后用2ml DMSO溶解，搅拌下滴加到反应介质中，加入三乙胺（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1:1），室温搅拌过夜。首先用冰水对倍稀释，其次分别用水、NaOH， NaCl透析，再次用水透析至终点，得到交联透明质酸钠凝胶。

实施例十

（1）用强酸型离子交换树脂活化4%（w/v）透明质酸钠水溶液，活化后滤液的PH=4.0。

（3）取冻干后的透明质酸海绵2.5g溶于二甲基亚砜50g，浓度为5%，将赖氨酸乙酯二盐酸盐（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1.5:1）与2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物（CMPI）（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为1.5:1）混合后用2ml DMSO溶解，搅拌下滴加到反应介质中，加入三乙胺（加入的摩尔量与透明质酸摩尔数比为3:1），室温搅拌过夜。首先用冰水对倍稀释，其次分别用水、NaOH， NaCl透析，再次用水透析至终点，得到交联透明质酸钠凝胶。

实施例十一

将实施例七得到的样品，通过无水乙醇沉淀得到交联透明质酸钠纤维，用磷酸缓冲液重新溶解得到浓度为0.85%（m/v）的交联透明质酸钠凝胶，同时配置浓度为0.85%的未交联透明质酸钠水溶液，25℃下进行频率扫描，考察两者之间的动力粘度的变化。结果（附图1）显示相同浓度下的氨基酸交联透明质酸钠凝胶的动力粘度远远高于未交联透明质酸钠凝胶。

实施例十二

将实施例七得到的样品，通过无水乙醇沉淀得到交联透明质酸钠纤维，用磷酸缓冲液重新溶解得到浓度为0.85%（m/v）的交联透明质酸钠凝胶，用30U/ml透明质酸酶考察酶降性能，不同时间段取样测定酶降体系的糖醛酸含量进而计算降解百分率。结果（附图2）显示，运用本专利提供的方法制备的交联透明质酸钠凝胶具有良好的抗透明质酸酶降解能力，其24h的降解百分率低于25%。

Claims

1.一种氨基酸交联透明质酸钠凝胶的制备过程，其主要特征是以透明质酸钠为原料，通过强酸型离子交换树脂将其活化为酸性的低浓度的透明质酸，然后加入相转移催化剂将其转化为透明质酸有机盐，再通过有机溶剂溶解为一定浓度的溶液，然后加入一定量的氨基酸交联剂、活化剂、催化剂，得到抗高温、抗酶降的交联透明质酸钠凝胶。

2.权利要求1中所述的酸性低浓度的透明质酸浓度为0.1%-4%（质量体积比），pH为2.0-4.0。

3.权利要求1中所述的透明质酸有机盐为活化后的透明质酸与四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、四丁基硫酸氢铵以1:4-2:1（摩尔比）比例形成的有机盐。

4.权利要求1中所述有机溶剂是指二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的一种或两种。

5.权利要求1中所述的一定浓度的溶液为0.5%-5%（质量体积比）。

6.权利要求1中所述的氨基酸交联剂为具有两个或多个活性氨基的氨基酸及其盐。

7.权利要求1中所述的一定量的氨基酸交联剂是指与透明质酸有机盐的比例为1:2-2:1（摩尔比）。

8.权利要求1中所述的活化剂为2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物（CMPI）。

9.权利要求1中所述的一定量的活化剂是指与透明质酸有机盐的比例为1:2-2:1（摩尔比）。

10.权利要求1中所述的催化剂为三乙胺或其他有机碱。

11.权利要求1中所述的一定量的催化剂是指与透明质酸有机盐的比例1:1-4:1（摩尔比）。