CN103613686B - 巯基化透明质酸的制备方法及其应用 - Google Patents
巯基化透明质酸的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属高分子材料技术领域，具体涉及一种巯基化透明质酸的制备方法和应用。以透明质酸为原料，以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)活化羧基，加入带二硫键的化合物，使其与透明质酸的羧基反应，再用二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇还原二硫键成巯基，制得巯基化透明质酸。本发明通过使用不同于半胱氨酸的巯基化试剂，并且优化反应条件，大大提高透明质酸的巯基化率。
Description
技术领域
本发明属高分子材料技术领域，具体涉及一种高产率巯基化透明质酸的制备方法以及在临床上的应用。
背景技术
透明质酸是一种独特的线性大分子酸性粘多糖，由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的双糖单位玻尿酸（Hyaluronan），又称糖醛酸，基本结构是由两个双糖单位D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的大型多糖类。与其它粘多糖不同，它不含硫。它的透明质分子能携带500倍以上的水分，为目前所公认的最佳保湿成分，目前广泛的应用在保养品跟化妆品中。
透明质酸本身带有负电荷，它的水溶液为粘弹性流体，填充在细胞与胶原纤维空间之中且覆盖在某些表皮组织上。在动物体，其主要功能乃保护及润滑细胞，调节细胞在此粘弹性基质上的移动，稳定胶原网状结构及保护它免于受到机械性的破坏。因为透明质酸为天然性润滑以及吸震高分子，在肌腱、肌腱鞘及粘滑膜表面作为润滑剂。
它以其独特的分子结构和理化性质在机体内显示出多种重要的生理功能，在临床上得到广泛应用。透明质酸及其衍生物具有良好的生物相容性、生物可降解性和化学修饰的多样性等优点，可广泛应用于组织工程和医药领域。
公开号为CN1328573的中国专利公开了一种交联的透明质酸和它在医药方面的应用，由提取的或生物合成的天然的线状透明质酸中活化了的羧基与多胺尤其是二胺反应而制得的。本发明的交联透明质酸可任选地硫酸化或半琥珀酰化，可用来作为滑液、玻璃体液的代用品，药物控制释放的基质，愈合剂与抗粘连剂，并可用来制备血管的修复物，混种生理器官，愈合用器材，眼科与耳科用的组合物，假体，(体内)植入物和医用器材。
公开号为CN1882602的中国专利公开了一种在疾病治疗中乙酰透明质酸合成的调节和降解，提供了组合物和方法，用于调节编码主要参与乙酰透明质酸代谢的HA合酶(HAX)和其他酶或者受体的遗传物质；或者用于调节合成或者降解乙酰透明质酸，包括HAS功能或者活性的蛋白质。组合物包括或包含核酸分子和相互作用分子例如抗体和小分子抑制剂以及HAS底物类似物。本发明还涉及细胞增殖的调节，用于预防和/或治疗炎症性病患包括过度增殖性病况例如但是不止限于，癌症和银屑病。
公开号为CN101316864的中国专利公开了一种阳离子化透明质酸，提供能够与透明质酸等阴离子性材料形成聚离子络合物的、更接近于人体成分的阳离子性高分子。本发明的阳离子化透明质酸的特征在于：透明质酸的羟基的氢原子的至少一部分被具有季铵阳离子基团的基团取代。该阳离子化透明质酸可以通过使缩水甘油基三烷基卤化铵等阳离子化剂与透明质酸反应来合成。本发明的阳离子化透明质酸在水共存下与透明质酸等形成聚离子络合物。
公开号为CN102226009A的中国专利公开了一种交联透明质酸凝胶的制备方法，二乙烯基砜先与聚乙二醇结合成新的交联剂，再与透明质酸分子发生反应而成交联透明质酸凝胶。该方法制备得到的交联透明质酸钠凝胶具有良好的生物相容性及较长的半衰期，且颗粒细小均匀，适合整形美容，组织填充，骨关节润滑或药物缓释制剂等。
公开号为CN102321258A的中国专利公开了一种季铵碱参与合成的高交联度透明质酸及其工艺方法，透明质酸(HA)的交联反应采用的交联剂为1，2，7，8-二环氧辛烷(DEO)，以季铵碱作为碱催化剂与相转移催化剂的结合体，采用氧化法或者乙醇法合成季铵碱；用盐酸调节至微酸性。此先碱后酸的交联过程确保了透明质酸的羟基与羧基均能参与交联。本发明具有反应条件简单，交联剂利用率高，凝胶的热稳定性较好，无菌无毒无热原，生物相容性等优点。
公开号为CN101591441的中国专利公开了一种透明质酸与琼脂糖凝胶连接的方法，透明质酸与己二酸二酰肼合成透明质酸-己二酸二酰肼衍生物，用高碘酸钠对琼脂糖凝胶Sepharose4B进行活化，得到含有醛基的琼脂糖凝胶，将透明质酸-己二酸二酰肼与含有醛基的琼脂糖凝胶Sepharose4B用硼氢化钠还原，得到透明质酸与琼脂糖凝胶Sepharose4B连接物。
公开号为CN103157140A的中国专利公开了一种可引导骨组织再生的骨修复材料，煅烧骨粉的颗粒大小范围为0.1-2mm；生物可吸收高分子材料选自胶原、甲壳素、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、藻酸钙、纤维蛋白、弹性蛋白的一种或多种。本发明骨修复材料具有明显的引导骨愈合的作用及较好的生物相容性，且具有一定的硬度和强度、易于塑形且来源丰富，解决了人工合成材料在孔隙率、孔隙交通、孔隙大小等方面的制作题难。
公开号为CN1944495的中国专利公开了一种含天然高分子的水凝胶及其辐射制备方法，该水凝胶交联度为70～95%，吸水率为500～80000%倍，所含有的天然高分子或其衍生物选自：甲壳素及甲壳素衍生物、壳聚糖及壳聚糖衍生物、卡拉胶及羧甲基卡拉胶、纤维素衍生物、淀粉及淀粉衍生物、海藻酸钠、瓜胶及羧甲基瓜胶、胶原蛋白、透明质酸等。根据需要还可以添加合成高分子、无机填料、交联敏化剂、及药物等其它助剂。该水凝胶经辐射交联制得，剂量为10～40kGy。本发明的水凝胶具有较高的吸水性、较好的柔韧性、对药物有较好的缓释性能、根据配方不同还可具有抗菌性与pH、温度敏感性等，可用作创伤敷料等多种用途。
公开号为CN101020082的中国专利公开了一种骨修复材料及其制备方法和用途，该材料为不同粒径的煅烧骨粉与生物可吸收高分子材料的组合物，其中煅烧骨粉的颗粒大小范围为0.05-2.5mm；生物可吸收高分子材料是胶原、聚酯、壳聚糖或硫酸软骨素等；骨修复材料的制备方法为：根据不同骨缺损的特点，选取不同粒径范围的骨粉颗粒与生物可吸收高分子材料在乙酸、NaHCO2溶液中混合，之后将骨粉与生物可吸收高分子材料的组合物进行紫外线照射、环氧乙烷熏蒸消毒。此种骨修复材料具有明显的引导骨愈合的作用及较好的生物相容性，且具有一定的硬度和强度、易于塑形且来源丰富，解决了人工合成材料在孔隙率、孔隙交通、孔隙大小等方面的制作难题。
公开号为CN102391391A的中国专利公开了一种天然高分子丙烯酸酯及其制备方法，将取自壳聚糖、透明质酸或α、β、γ-环糊精中的一种多糖加入到体积比为1～2∶1的缚酸剂和氯代烷烃的混合溶液中，室温下搅拌放置48小时；0～5℃的冰浴下冷却搅拌2小时；冰浴下滴加20～40wt%不饱和酰氯的氯代烷烃溶液，滴加时间为2～4小时，滴加的不饱和酰氯是多糖重量的2～4倍；升温25～30℃下反应8小时，过滤后的沉淀用丙酮洗涤三次即为天然生物多糖衍生物。本发明方法的天然生物材料丙烯酸酯类产品可以用于组织工程支架材料，药物控释缓释材料，UV固化涂料材料。
公开号为CN101367884的中国专利公开了一种半胱胺修饰的巯基化透明质酸偶合物及其制备方法和应用，具体涉及一种半胱胺修饰的巯基化透明质酸偶合物及其制备方法和应用。透明质酸溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDAC)及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化其羧基，加入半胱胺盐酸盐，使其氨基与透明质酸的羧基形成酰胺键，调节各物质的配比及反应条件，获得不同巯基含量的巯基化透明质酸偶合物。该发明扩展了该巯基化反应的应用范围，偶合物黏膜黏附性及生物相容性较好，具有较强的原位凝胶性质，为非注射制剂及组织工程等提供优良的生物黏附性材料。
巯基化聚合物具有的原位凝胶性质，其分子内可形成二硫键，以致流变学性质改变。本发明通过使用不同于半胱氨酸的巯基化试剂，并且优化反应条件，大大提高透明质酸的巯基化率。高巯基化率使透明质酸的交联速度及凝胶生物力学性能大大提高。经体外细胞毒性试验证明，该水凝胶生物相容性良好，毒性低，可直接用于体内，或进行体外细胞三维培养。该凝胶反应可在常温进行，所形成的凝胶具有一定的生物力学性能，可应用于组织工程领域，作为可注射的，原位交联的植入假体，实现无创植入。
发明内容
为了克服现有技术中对透明质酸的巯基化不足，本发明提供一种巯基化透明质酸及其制备方法，并且在骨科、眼科等临床上使用，也在除皱和细胞培养方面使用，还能作为原位交联水凝胶合成使用，基本流程如下：
本发明以透明质酸为原料，加入带二硫键的化合物，以1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)活化羧基，使其与透明质酸的羧基反应，再用二硫苏糖醇（DTT）或β-巯基乙醇还原二硫键成巯基，离心，干燥，制得巯基化透明质酸。
制备巯基化透明质酸的过程如下：
1、巯基化试剂为2，2‘-二硫代二酰胺，3,3’-二硫代二丙酰胺，4,4’-二硫代二丁酰胺：
2、巯基化试剂为2，2‘-二硫代二乙酰肼，3,3’-二硫代二丙酰肼，4,4’-二硫代二丁酰肼：
本发明所使用的透明质酸分子量在1万-200万道尔顿左右。
本发明所采用的含二硫键化合物为2，2‘-二硫代二酰胺，3,3’-二硫代二丙酰胺，4,4’-二硫代二丁酰胺，2，2‘-二硫代二乙酰肼，3,3’-二硫代二丙酰肼，4,4’-二硫代二丁酰肼。
本发明的巯基化透明质酸的具体制备方法如下：
将2g透明质酸溶解于水中，加入带有二硫键的化合物，温度在15-45度，用HCl将pH至3-6，加入0.5-10克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺（EDC），搅拌至少2h，用NaOH调节pH至5-9，加入0.6-1.5kg的含二硫键化合物，用NaOH调节pH至6-10，搅拌12-72h，用HCl调节pH至2-5，装入透析袋中进行透析或直接超滤，离心，取上清液冷冻干燥，得巯基化透明质酸。
本发明所述的搅拌速度为100-2000rpm。
本发明所述加入水量（kg）为透明质酸（kg）重量的50-250倍。
本发明所述加入带有二硫键的化合物的量（kg）为透明质酸（kg）重量的1-5倍。
本发明所用盐酸（HCl）的浓度为1mol/L；所用氢氧化钠（NaOH）的浓度为1mol/L。
本发明所述透析方法为在含有2.5-15克NaCl（pH2-5）的盐酸溶液中透析1-3天，在HCl（pH,2-5）中透析1-3天。
本发明所述超滤方法为用含有2.5-15克NaCl（pH2-5）的盐酸溶液进行超滤，再用HCl（pH,2-5）中进行超滤。
本发明所述的透析袋的截留分子量为2000-10000Da。
本发明所述的超滤膜的截留分子量为1000-2000Da。
本发明所述的离心的温度为2-8℃，速度为3000-10000rpm。
本发明所述的冷冻干燥的冷肼温度为-40-60℃，真空度为<20Pa。
本发明所得到的巯基化透明质酸可以用于植入假体材料，也可以作为合成水凝胶的原料，也可直接于化妆品中保水材料和除皱等方面的应用。
Ellman法定性定量：Ellman法可测定游离巯基的量，而HA为重复的二糖结构，其羧基的数量基本固定，因此，通过测定巯基化透明质酸所含的巯基的量，即可求算出羧基覆盖率即产率（SD%）。
Ellman法原理：游离巯基与过量DTNB常温孵育，生成有色物质，在412nm紫外光处有吸收，Emol=13600，根据Lambert-Beer定律，A=EmolCL（L=1），可通过测定吸光度（A），求得实际巯基浓度。
巯基化产率计算方法：巯基化HA由重复二糖结构组成，每个二糖单元分子量为388，含有一个可反应的羧基，接上巯基后的分子量为491，本实验称取HA-SH0.005g，配制成0.05L溶液（浓度为0.1g/L），使其与过量DTNB常温孵育，生成有色物质，在412nm测定其吸光度（A）。则：1g产物含巯基数量为N=A/EmolL/0.1。本发明所合成巯基化透明质酸的A值均在1.7以上，则巯基产率在1250μmol/g以上。
技术效果
1、本发明的巯基化透明质酸可应用于组织工程领域，作为可注射的，原位交联的植入假体，实现无创植入。
2、活化羧基只需使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)，而无需合用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。
3、用化合物2，2’-二硫代二酰胺，3,3’-二硫代二丙酰胺，4,4’-二硫代二丁酰胺，2，2’-二硫代二乙酰肼，3,3’-二硫代二丙酰肼，4,4’-二硫代二丁酰肼作为巯基化试剂替代半胱氨酸，上述化合物使反应更易于进行，产率更高，本发明巯基的产率提高到大于1000μmol/g(专利CN101367884中只有200μmol/g)。
具体实施例
通过下面的具体实施例可进一步了解本发明。但他们不是对本发明的限定。
实施例1
称取2.0g透明质酸（10万，注射级，生物发酵，货号为sigma E7750）加入到200mL灭菌三蒸水，搅拌至溶解，加入4.0g2，2’-二硫代二酰胺，再用1.0mol/L HCl调节pH至3.0，加入1.5gEDC搅拌2h，再用1.0mol/L NaOH调节pH至7.0，加入β-巯基乙醇5g，用1.0mol/L NaOH调节pH至8.0，搅拌,12h，用1.0mol/L HCl调节pH至2.0，装入Mw3500Da的透析袋在5gNaCl的0.01mol/L HCl（pH,2.0）中透析1天，在0.01mol/L HCl（pH,2.0）溶液中透析1天，离心，上清液冷冻干燥，得到1.85g巯基化透明质酸，采用Ellman法定性定量测定所得巯基的产率达到1661μmol/g。
对照实例1
按公开号CN101367884的中国专利所介绍的方法,称取2.0g透明质酸钠（10万，注射级）加入到250mL灭菌三蒸水，得0.8%透明质酸溶液,分别加入终浓度为0.48%的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDAC），和0.29%的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解后调pH5.5，搅拌40min；加入1g半光胺盐酸盐，调节反应液pH4，避光反应5h。反应结束后，反应混合物置截留分子量3500Da的透析袋，依次以HCl溶液（pH4）、含1%NaCl的HCl溶液（pH4）、HCl溶液（pH4）透析，冷冻干燥，得半光胺修饰的巯基化透明质酸偶合物1.32g，采用Ellman法定性定量测定所得巯基的产率达到200μmol/g。
实施例2
称取2.0g透明质酸（50万，注射级，生物发酵）加入到250mL灭菌三蒸水，搅拌至溶解，加入2.5g4，4’-二硫代二乙酰胺，再用1.0N HCl调节pH至4.0，加入2.5g EDC搅拌2h，再用1.0mol/L NaOH调节pH至7.0，加入β-巯基乙醇15g，用1.0mol/L NaOH调节pH至8.5，搅拌,12h，用1.0mol/L HCl调节pH至3.0，用超滤(宁波宏耀电泳科技有限公司，截留分子量为1500Da)进行超滤，在含有10g NaCl的0.001mol/L HCl（pH,3.0）中超滤，再在含有0.001mol/L HCl（pH,3.0）中超滤2天，离心，上清液冷冻干燥，得到1.78g巯基化透明质酸，采用Ellman法定性定量测定所得巯基的产率达到1692μmol/g。
实施例3
称取2.0g透明质酸（80万，注射级，生物发酵）加入到300mL灭菌三蒸水，搅拌至溶解，加入3.0g2，2’-二硫代二乙酰肼，再用1.0mol/L HCl调节pH至4.5，加入3.0g EDC搅拌2h，再用1.0mol/L NaOH调节pH至7.4，加入β-巯基乙醇20g，用1.0mol/L NaOH调节pH至8.5，搅拌,24h，用1.0mol/L HCl调节pH至3.5，装入Mw3500Da的透析袋在15gNaCl（pH,3.5）中透析2天，在HCl（pH,3.5）中透析2天，离心，上清液冷冻干燥，得到1.85g巯基化透明质酸，采用Ellman法定性定量测定所得巯基的产率达到1762μmol/g。
实施例4
称取2.0g透明质酸（120万，注射级，生物发酵）加入到300mL灭菌三蒸水，搅拌至溶解，加入3.0g2，2’-二硫代二乙酰肼，再用1.0mol/L HCl调节pH至4.5，加入3.0g EDC搅拌2h，再用1.0mol/L NaOH调节pH至7.4，加入β-巯基乙醇20g，用1.0mol/L NaOH调节pH至8.5，搅拌,24h，用1.0mol/L HCl调节pH至3.5，装入Mw3500Da的透析袋在15gNaCl（pH,3.5）中透析3天，在HCl（pH,3.5）中透析2天，离心，上清液冷冻干燥，得到1.87g巯基化透明质酸，采用Ellman法定性定量测定所得巯基的产率达到1787μmol/g。
Claims (12)
1.巯基化透明质酸的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
将2g透明质酸溶解于水中，加入带有二硫键的化合物，温度在15-45度，用HCl将pH至3-6，加入0.5-10克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺(EDC)，搅拌至少2h，用NaOH调节pH至5-9，加入0.6-1.5kg的二硫苏糖醇或β-巯基乙醇，用1mol/L NaOH调节pH至6-10，搅拌12-72h，搅拌速度为100-2000rpm，用1mol/L HCl调节pH至2-5，装入透析袋中进行透析或直接超滤，离心，取上清液冷冻干燥，得巯基化透明质酸。
2.权利要求1所述制备方法，其特征在于所述透明质酸的分子量为1万-200万道尔顿。
3.权利要求1所述制备方法，其特征在于所述带有二硫健的化合物为2，2‘-二硫代二酰胺，3,3’-二硫代二丙酰胺，4,4’-二硫代二丁酰胺，2，2‘-二硫代二乙酰肼，3,3’-二硫代二丙酰肼，4,4’-二硫代二丁酰肼。
4.权利要求1所述制备方法，其特征在于所述加入水量kg为透明质酸kg重量的50-250倍。
5.权利要求1所述制备方法，其特征在于所述加入带有二硫键的化合物的重量kg为透明质酸重量kg的1-5倍。
6.权利要求1所述制备方法，其特征在于所述透析方法为在含有2.5-15克NaCl的pH为2-5的盐酸水溶液中透析1-3天，在pH为2-5的盐酸水溶液中透析1-3天。
7.权利要求1所述制备方法，其特征在于所述超滤方法为用含有2.5-15克NaCl的pH为2-5的盐酸水溶液中进行超滤，再用pH为2-5的盐酸水溶液中进行超滤。
8.权利要求1所述制备方法，其特征在于所述透析袋的截留分子量为2000-10000Da。
9.权利要求1所述制备方法，其特征在于所述超滤膜的截留分子量为1000-2000Da。
10.权利要求1所述制备方法，其特征在于所述离心的温度为2-8℃，速度为3000-10000rpm。
11.权利要求1所述制备方法，其特征在于所述冷冻干燥的冷肼温度为-40-60℃，真空度为<20Pa。
12.权利要求1所述制备方法，其特征在于所制得的巯基化透明质酸直接用于植入假体材料，直接用于合成水凝胶的原料，直接用于化妆品中保水材料。
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