CN112842929A - 一种巯基化透明质酸及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种巯基化透明质酸及其制备方法和应用，巯基化透明质酸是由透明质酸或其盐羟基位点的巯基化改性而得。本发明透明质酸或其盐与二硫化合物进行反应生成透明质酸二硫化合物，再加入还原剂使二硫键还原为巯基，得到巯基化透明质酸。该巯基化透明质酸具有巯基取代度可控、溶解快、成胶快和生物相容性好的特点，可应用于护肤品、关节注射、组织填充和细胞培养等领域。

Description

一种巯基化透明质酸及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种巯基化透明质酸及其制备方法和应用，为透明质酸衍生物制备技术领域。
背景技术
透明质酸(HA)是存在于人体和动物组织中的一种天然直链多糖，在人体内主要分布在脐带、关节、眼玻璃体、皮肤等部位，发挥重要生理功能。透明质酸具有良好的保水性、润滑性、黏弹性、生物降解性及优异的生物相容性，在化妆品、医药(骨科、眼科、整形外科、皮肤科、胃肠科等)和功能性食品中应用十分广泛，并逐渐扩展至新的应用领域。
为了抵抗透明质酸酶的降解作用和延长透明质酸在体内的生理作用，通常将透明质酸进行交联，如使用BDDE、DVS等交联剂制备交联透明质酸，其凝胶形式常应用于注射美容填充、药物缓释载体和组织工程等领域。形成凝胶后交联剂的去除比较困难，该类交联剂具有较大的毒性，会引起组织发炎等副作用，故交联剂的残留是影响该类交联透明质酸安全性的重要因素。巯基是一种在生物体内天然存在、具有良好生物相容性以及还原能力很强的化学键，可通过简单氧化得到稳定的二硫键。将巯基与透明质酸进行接枝得到生物相容性良好的巯基化透明质酸，在溶液状态下进行纯化，原料的去除相对比较彻底，杂质残留也会更低，配制为合适浓度后经过氧化即可原位交联成胶，无须外加交联剂，避免了目前交联剂残留带来的安全性问题。
目前对巯基化透明质酸的研究主要集中在透明质酸的羧基位进行取代制备巯基化透明质酸，也有一些专利的报道，例如，专利CN101367884A公开了一种半胱胺修饰的巯基化透明质酸(HA-SH)的制备方法，该方法通过半胱氨酸的氨基与透明质酸的羧基形成酰胺键，通过调节反应配比获得不同巯基含量的巯基化透明质酸。专利CN101338036B公开了一种巯基化透明质酸的制备方法，该方法将透明质酸侧链羧基在碳化二亚胺活化下与含有二硫键的二氨或二酰肼反应形成中间产物，使用二硫苏糖醇把二硫键还原为巯基得到巯基化透明质酸。该类巯基化透明质酸都是通过不同的方式在透明质酸的羧基位点上连接上巯基，亲水性的羧基被部分取代后，得到的巯基化透明质酸的水溶性和溶解速度均变差。
专利CN101511875A公开了一种透明质酸羟基位上巯基取代制备巯基化大分子的方法，该方法将透明质酸与硫化乙烯反应生成通过醚键连接的巯基化透明质酸。
CN103910886A公开了一种半胱氨酸功能化的透明质酸结合物及其合成方法以及在可注射原位形成的水凝胶中的应用，该方法通过对氨基进行保护后合成了含硫和环氧乙烷的聚乙二醇类化合物，然后在碱性条件下与透明质酸上的羟基进行反应，最后将氨基去保护后发生开环反应，实现了透明质酸的巯基化改性。该方法存在反应过程复杂、反应路线长、纯化过程使用大量有机试剂的不足。
CN102399295A公开了一种低巯基化改性度生物相容高分子巯基化衍生物及其交联材料和用途，该方法指出可以先对透明质酸侧链上的羟基进行改性，使其在强碱条件下羧基化，然后羧基再与含巯基的化合物反应，实现透明质酸的巯基化修饰。该方法在羟基上修饰上羧基，然后再与含巯基的化合物反应，反应流程繁琐、反应路线长。
发明内容
针对目前外加交联剂得到的交联透明质酸存在的交联剂残留的问题，本发明提供了一种巯基化透明质酸，该产品在透明质酸的羟基位点上直接引入巯基，不会造成亲水性羧基的损失，产品的水溶性和溶解速度不受影响。巯基的引入使巯基化透明质酸的水溶液在氧气环境下可自发交联形成凝胶，也可与双键在紫外光条件下发生巯基-烯的加成反应形成凝胶，无须加入交联剂，具有溶解快、成胶快和生物相容性好、安全性高等特点。
本发明还提供了上述巯基化透明质酸的制备方法，该方法工艺简洁，操作简单，便于生产。
本发明还提供了上述巯基化透明质酸的应用，该产品溶解快、成胶快、生物相容性好，可应用于护肤品、关节注射、组织填充和细胞培养等领域。
本发明巯基化透明质酸是透明质酸的一种衍生物，其是将透明质酸或其盐的部分羟基替换为含有巯基的酯基而得，即透明质酸或其盐中的部分羟基(-OH)变为了酯基(
Figure BDA0002291441080000021
R为含巯基的基团)。
进一步的，所述酯基为任意含巯基的酯基，优选为含巯基的烷基酯，其结构式为
Figure BDA0002291441080000022
M为C1-C6的亚烷基，更优选为
Figure BDA0002291441080000023
Figure BDA0002291441080000024
进一步的，所述巯基化透明质酸中巯基的取代度为10％-40％，所述巯基的取代度指的是巯基摩尔数与透明质酸双糖单元摩尔数的比值。
进一步的，所述巯基化透明质酸中，每个重复单元最多只有一个羟基被取代，被取代的羟基位于N-乙酰葡糖胺上。
进一步的，所述巯基化透明质酸是将平均分子量为200～2000kDa的透明质酸或其盐的部分羟基替换为含有巯基的酯基而得。
在本发明某一具体实施方式中，当酯基为优选的
Figure BDA0002291441080000031
Figure BDA0002291441080000032
时，所述巯基化透明质酸的结构式可以参考下述理论结构式：
Figure BDA0002291441080000033
进一步的，本发明巯基化透明质酸在羟基位点上连接巯基基团，在氧气环境下其水溶液可发生自交联形成凝胶，巯基化透明质酸也可与双键在紫外光条件下发生巯基-烯加成反应形成凝胶，该巯基化透明质酸经过改性后，交联更为快速，无须交联剂的加入，提高了产品的安全性，具有巯基取代度可控、溶解快、成胶快和生物相容性好的特点，在护肤品、关节注射产品、组织填充剂和细胞培养剂中有广泛的应用。
本发明提供了一种工艺流程短、便于操作的巯基化透明质酸(HA-SH)的制备方法，该方法包括a)将透明质酸或其盐中的羟基与含羧基的二硫化合物中的羧基进行酯化反应，以及b)将连接到透明质酸或其盐上的二硫键还原为巯基这两个步骤。
本发明在透明质酸或其盐的羟基位点进行反应，先选择具有羧基的二硫化合物与透明质酸上的羟基反应，将二硫化合物连接到透明质酸上，然后再通过还原将二硫键还原为巯基，形成巯基化透明质酸。因为透明质酸或其盐上的羟基与含羧基的二硫化合物的羧基的酯化反应需要在非质子溶剂中进行，而透明质酸或其盐在非质子溶剂中溶解性不佳，导致酯化效率低。因此在酯化反应前优选先对透明质酸或其盐进行处理，以增加其在非质子溶剂中的溶解性，提高酯化效率。预处理的过程是：先将透明质酸或其盐与四丁基氢氧化铵反应形成透明质酸四丁基铵盐，然后将透明质酸四丁基铵盐与含羧基的二硫化合物进行酯化反应。
进一步的，所述透明质酸或其盐可以是任意分子量的透明质酸或其盐，常用的平均分子量为200～2000kDa。透明质酸盐可以是透明质酸的钠盐、钾盐、钙盐等，常用的为钠盐。
进一步的，透明质酸或其盐与四丁基氢氧化铵的具体反应步骤包括：将透明质酸或其盐悬浮于有机溶剂水溶液中，加酸调整pH至酸性，使透明质酸或其盐转化为酸型透明质酸，过滤，将滤饼用水溶解，然后加入四丁基氢氧化铵(TBA-OH)进行反应，反应后冷冻干燥，得透明质酸四丁基铵盐(HA-TBA)。
进一步的，制备透明质酸四丁基铵盐时，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或多种，有机溶剂水溶液的浓度为60-90wt％。
进一步的，制备透明质酸四丁基铵盐时，透明质酸或其盐与有机溶剂水溶液的用量无特殊要求，在本发明某一具体实施方式中透明质酸或其盐与有机溶剂水溶液的比值为1g:10～50mL。
进一步的，制备透明质酸四丁基铵盐时，加入酸调整溶液pH＜7，优选调整pH至≤4，更优选调整pH至2-4。为了使透明质酸充分的酸化，可以多次重复透明质酸或其盐悬浮于酸性有机溶剂水溶液中的步骤。
进一步的，制备透明质酸四丁基铵盐时，酸型透明质酸用水溶解后，在水中的浓度无特别要求，将酸型透明质酸充分溶解并便于形成透明质酸四丁基铵盐即可。向该水溶液中加入四丁基氢氧化铵至pH为6.5～8.0，优选至pH为7.0-8.0，充分反应得到透明质酸四丁基铵盐。整个反应在常温下进行。
将透明质酸或其盐或将上述经过预处理得到的透明质酸四丁基铵盐与含羧基的二硫化合物进行酯化反应，可以得到透明质酸二硫化合物。所述含羧基的二硫化合物优选为3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)、2,2’-二硫代二乙酸或4,4’-二硫代二丁酸，进一步优选为3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)，但也不排除其他二硫化合物。
进一步的，酯化反应在催化剂和非质子溶剂中进行，步骤为：将透明质酸或其盐或透明质酸四丁基铵盐分散到非质子溶剂中，然后加入催化剂和含羧基的二硫化合物，充分反应得到酯化产物——透明质酸或其盐的二硫化合物(简称透明质酸二硫化合物，下同)。当使用透明质酸四丁基铵盐时，收率更高。
进一步的，酯化反应时，透明质酸或其盐或者透明质酸四丁基铵盐与含羧基的二硫化合物的质量比以及催化剂的用量对巯基的取代度有影响，通过控制这两个条件可以调整巯基的取代度。在本发明某一实施方式中，当巯基的取代度为10％-40％时，透明质酸或其盐或者透明质酸四丁基铵盐与含羧基的二硫化合物的质量比为1:1.6～5.0。
进一步的，酯化反应时，所用催化剂为二碳酸二叔丁酯(Boc2O)和成分A的混合物，所述成分A为4-二甲氨基吡啶(DMAP)、四甲基乙二胺(TMEDA)或N,N’-羰基二咪唑(CDI)。成分A与二碳酸二叔丁酯可以以任意比例混合，当成分A与二碳酸二叔丁酯比值为0.15～1.5g:1mL时效果更佳。催化剂与透明质酸或其盐或透明质酸四丁基铵盐的质量比为0.5～1.5:1。
进一步的，酯化反应时，非质子溶剂的作用是为反应的进行提供环境，并保证酯化反应的正常进行。所用非质子溶剂为二甲基亚砜(DMSO)或N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。为了使反应可控性好，透明质酸或其盐，或者是透明质酸四丁基铵盐在非质子溶剂中的浓度为0.5～2.0wt％。
进一步的，酯化反应时，反应温度为40-50℃，反应时间根据具体反应条件调整。
进一步的，酯化反应后，对反应液进行后处理，得到透明质酸二硫化合物固体，再将得到的透明质酸二硫化合物固体进行下一步的反应。后处理包括对反应液进行纯化、干燥等步骤，可以采用透析、浓缩、有机溶剂沉淀、水溶解、冻干的流程，或者采用透析、浓缩、有机溶剂沉淀、有机溶剂洗涤、真空干燥的流程。为了提高产品纯度，可以进行多次透析。透析可以采用氯化钠水溶液进行，在本发明某一具体实施方式中，透析采用0.1-0.5wt％的氯化钠水溶液进行。浓缩后的浓缩液可以加入甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等有机溶剂中的一种或多种进行沉淀。
进一步的，将透明质酸二硫化合物上的二硫键还原为巯基，即可得到巯基化透明质酸。还原在还原剂的存在下进行，所述还原剂为二硫代苏糖醇(DTT)、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)、还原型谷胱甘肽(GSH)和2-巯基乙醇中的一种或多种。还原剂与透明质酸或其盐或者透明质酸四丁基铵盐的摩尔比为1.2～2.5:1，透明质酸或其盐或者透明质酸四丁基铵盐的摩尔数以透明质酸双糖单元的摩尔数计。
进一步的，二硫键的还原反应在碱性环境下进行，所述碱性环境的pH值为7.0～9.0，碱性环境由氢氧化钠、氢氧化钾等碱提供。
进一步的，二硫键的还原反应可以在水中进行，水为反应的介质，其用量可以根据实际情况进行调整。一般的，加入的水量为透明质酸二硫化合物质量的50～70倍。反应在常温下进行，反应至所有二硫键转变为巯基结束。
进一步的，将透明质酸二硫化合物的二硫键还原为巯基后，还包括将反应液调节pH至酸性，然后纯化、干燥得到最终的巯基化透明质酸产品的步骤。优选的，将反应液pH用酸调节pH至2-5，然后进行纯化、干燥。纯化可以采用加入氯化钠、有机溶剂沉淀、有机溶剂洗涤、水溶解、压滤的流程，干燥可以采用冷冻干燥。纯化所用的有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇中的一种或多种。在使用时，优选将有机溶剂进行脱氧和预冷处理，压滤采用氮气或惰性气体保护，以减少巯基的氧化。纯化时加入适量的氯化钠有助于产物更多的沉淀出来，氯化钠的用量一般为反应液质量的1-5％。
本发明对透明质酸或其盐的羟基进行改性，在该位点上连接上巯基，得到了巯基取代度可控、可自行交联、溶解快、成胶快、生物相容性好的巯基化透明质酸。该产品制备工艺流程短、工艺简洁，所得产品保留了游离的羧基，保留了良好的水溶性，交联可自行进行，避免了交联剂的使用，可应用于护肤品、关节注射、组织填充和细胞培养等领域。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面结合具体实施例进一步说明，实施例的描述旨在揭示本发明的原理、主要特征和优势，但不用来限制本发明的范围。
如无特别说明，下述浓度均为质量浓度。
实施例1
称取分子量为250kDa的透明质酸钠21g，加入800mL质量分数为75％的乙醇，搅拌均匀，溶胀1h，过滤，向滤饼中加入800mL质量分数为75％的乙醇，并用盐酸调节溶液pH值为3.0，搅拌，过滤，重复使用pH值为3.0的75％的乙醇搅拌置换5次，过滤，加入300mL水溶解后，用四丁基氢氧化铵(TBA-OH)调节溶液pH值为7.0，冻干得透明质酸四丁基铵盐(HA-TBA)26g。
称取HA-TBA 3.0g，溶解于300mL DMSO中，依次加入6.67g 3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)、1.93g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和2.0mL二碳酸二叔丁酯(Boc2O)，45℃下搅拌反应30h，反应液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，用0.2wt％的氯化钠溶液进行透析，8h更换一次透析液，透析操作5次，透析袋内溶液使用旋转蒸发仪减压浓缩至约200mL，加入400mL丙酮进行沉淀，沉淀继续用100mL丙酮洗涤2次，40℃真空干燥，得到3.0g透明质酸二硫化合物。
将上述3.0g透明质酸二硫化合物加入150mL水溶解后，继续加入1.5g二硫代苏糖醇(DTT)，搅拌均匀后，碱液调节反应液pH值为8.5，搅拌反应3h后停止，用酸调反应液pH值为2.5，加入1.5g氯化钠搅拌均匀后，加入冷乙醇150mL沉淀，过滤后，滤饼继续用100mL冷乙醇洗涤两次，加入200mL经过脱氧处理的水并在氮气保护下搅拌溶解，液氮预冻后进行冻干，得巯基化透明质酸(HA-SH)0.86g，重量收率(以HA-TBA投料量计算)为28.6％。
实施例2
称取分子量为1200kDa的透明质酸钠21g，加入1000mL质量分数为70％的丙酮，搅拌均匀，溶胀1h，过滤，向滤饼中加入1000mL质量分数为70％的丙酮，并用盐酸调节溶液pH值为2.5，搅拌，过滤，重复使用pH值为2.5的70％的丙酮搅拌置换5次，过滤，加入300mL水溶解后，用四丁基氢氧化铵(TBA-OH)调节溶液pH值为7.5，冻干得HA-TBA 28.2g。
称取HA-TBA 3.0g，溶解于600mL DMSO中，依次加入6.67g 3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)、1.93g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和2.0mL二碳酸二叔丁酯(Boc2O)，45℃下搅拌反应30h，反应液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，用0.2wt％的氯化钠溶液进行透析，8h更换一次透析液，透析操作5次，透析袋内溶液使用旋转蒸发仪减压浓缩至约200mL，加入400mL丙酮进行沉淀，沉淀继续用100mL丙酮洗涤2次，40℃真空干燥，得到3.3g透明质酸二硫化合物。
将上述3.3g透明质酸二硫化合物加入165mL水溶解后，继续加入1.0g二硫代苏糖醇(DTT)，搅拌均匀后，碱液调节反应液pH值为7.0，搅拌反应3h后停止，用酸调反应液pH值为2.5，加入2g氯化钠搅拌均匀后，加入冷丙酮150mL沉淀，过滤后，滤饼继续用100mL冷丙酮洗涤两次，加入200mL经过脱氧处理的水并在氮气保护下搅拌溶解，液氮预冻后进行冻干，得巯基化透明质酸(HA-SH)0.89g，重量收率(以HA-TBA投料量计算)为29.7％。
实施例3
称取分子量为2000kDa的透明质酸钠21g，加入1000mL质量分数为90％的乙醇，搅拌均匀，溶胀1h，过滤，向滤饼中加入300mL质量分数为90％的乙醇，并用盐酸调节溶液pH值为3.5，搅拌，过滤，重复使用pH值为3.5的90％的乙醇搅拌置换5次，过滤，加入300mL水溶解后，用四丁基氢氧化铵(TBA-OH)调节溶液pH值为6.5，冻干得HA-TBA 28.7g。
称取HA-TBA 12.0g，溶解于600mL DMF中，依次加入25g 3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)、7.72g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和8.0mL二碳酸二叔丁酯(Boc2O)，45℃下搅拌反应30h，反应液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，用0.2wt％的氯化钠溶液进行透析，8h更换一次透析液，透析操作5次，透析袋内溶液使用旋转蒸发仪减压浓缩至约300mL，加入300mL丙酮进行沉淀，沉淀继续用100mL丙酮洗涤2次，40℃真空干燥，得到12.8g透明质酸二硫化合物。
取3.0g透明质酸二硫化合物，加入210mL水溶解，继续加入1.65g二硫代苏糖醇(DTT)，搅拌均匀后，碱液调节反应液pH值为7.5，搅拌反应3h后停止，用酸调反应液pH值为3.0，加入1.5g氯化钠搅拌均匀后，加入冷乙醇150mL沉淀，过滤后，滤饼继续用100mL冷乙醇洗涤两次，加入200mL经过脱氧处理的水并在氮气保护下搅拌溶解，液氮预冻后进行冻干，得巯基化透明质酸(HA-SH)0.92g，重量收率(以HA-TBA投料量计算)为32.7％。
实施例4
称取分子量为500kDa的透明质酸钠21g，加入500mL质量分数为65％的异丙醇，搅拌均匀，溶胀1h，过滤，向滤饼中加入300mL质量分数为65％的异丙醇，并用盐酸调节溶液pH值为2.5，搅拌，过滤，重复使用pH值为3.5的65％的异丙醇搅拌置换5次，过滤，加入300mL水溶解后，用四丁基氢氧化铵(TBA-OH)调节溶液pH值为6.5，冻干得HA-TBA 28.7g。
称取HA-TBA 3.0g，溶解于300mL DMSO中，依次加入14.5g 4,4’-二硫代二丁酸、2.7g4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1.8mL二碳酸二叔丁酯(Boc2O)，45℃下搅拌反应30h，反应液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，用0.2wt％的氯化钠溶液进行透析，8h更换一次透析液，透析操作5次，透析袋内溶液使用旋转蒸发仪减压浓缩至约100mL，加入200mL丙酮进行沉淀，沉淀继续用100mL丙酮洗涤2次，40℃真空干燥，得到3.3g透明质酸二硫化合物。
将上述3.3g透明质酸二硫化合物加入165mL水溶解后，继续加入2.48g二硫代苏糖醇(DTT)，搅拌均匀后，碱液调节反应液pH值为8.5，搅拌反应3h后停止，用酸调反应液pH值为3.0，加入1.5g氯化钠搅拌均匀后，加入冷乙醇150mL沉淀，过滤后，滤饼继续用100mL冷乙醇洗涤两次，加入200mL经过脱氧处理的水并在氮气保护下搅拌溶解，液氮预冻后进行冻干，得巯基化透明质酸(HA-SH)0.98g，重量收率(以HA-TBA投料量计算)为32.7％。
实施例5
称取实施例1所得的HA-TBA 3.0g，溶解于600mL DMSO中，依次加入4.8g 3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)、0.3g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1.3mL二碳酸二叔丁酯(Boc2O)，45℃下搅拌反应30h，反应液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，用0.2wt％的氯化钠溶液进行透析，8h更换一次透析液，透析操作5次，透析袋内溶液使用旋转蒸发仪减压浓缩至约200mL，加入200mL丙酮进行沉淀，沉淀继续用100mL丙酮洗涤2次，40℃真空干燥，得到2.9g透明质酸二硫化合物。
将上述2.9g透明质酸二硫化合物加入165mL水溶解后，继续加入2.48g二硫代苏糖醇(DTT)，搅拌均匀后，碱液调节反应液pH值为8.5，搅拌反应3h后停止，用酸调反应液pH值为2.5，加入1.5g氯化钠搅拌均匀后，加入冷乙醇150mL沉淀，过滤后，滤饼继续用100mL冷乙醇洗涤两次，加入200mL经过脱氧处理的水并在氮气保护下搅拌溶解，液氮预冻后进行冻干，得巯基化透明质酸(HA-SH)1.02g，重量收率(以HA-TBA投料量计算)为34％。
实施例6
称取实施例1所得的HA-TBA 3.0g，溶解于300mL DMF中，依次加入6.67g 3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)、1.83g四甲基乙二胺(TMEDA)和2mL二碳酸二叔丁酯(Boc2O)，45℃下搅拌反应30h，反应液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，用0.2wt％的氯化钠溶液进行透析，8h更换一次透析液，透析操作5次，透析袋内溶液使用旋转蒸发仪减压浓缩至约200mL，加入200mL丙酮进行沉淀，沉淀继续用100mL丙酮洗涤2次，40℃真空干燥，得到3.2g透明质酸二硫化合物。
将上述3.2g透明质酸二硫化合物加入150mL水溶解后，继续加入1.8g二硫代苏糖醇(DTT)，搅拌均匀后，碱液调节反应液pH值为8.5，搅拌反应3h后停止，用酸调反应液pH值为3.5，加入5g氯化钠搅拌均匀后，加入冷乙醇150mL沉淀，过滤后，滤饼继续用150mL冷乙醇搅拌洗涤两次，加入200mL经过脱氧处理的水并在氮气保护下搅拌溶解，液氮预冻后进行冻干，得巯基化透明质酸(HA-SH)0.95g，重量收率(以HA-TBA投料量计算)为31.7％。
实施例7
称取实施例1所得的HA-TBA 3.0g，溶解于300mL DMF中，依次加入6.67g 3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)、2.15g N,N’-羰基二咪唑(CDI)和2mL二碳酸二叔丁酯(Boc2O)，45℃下搅拌反应30h，反应液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，用0.2wt％的氯化钠溶液进行透析，8h更换一次透析液，透析操作5次，透析袋内溶液使用旋转蒸发仪减压浓缩至约200mL，加入200mL丙酮进行沉淀，沉淀继续用100mL丙酮洗涤2次，40℃真空干燥，得到3.1g透明质酸二硫化合物。
将上述3.1g透明质酸二硫化合物加入200mL水溶解后，继续加入1.7g二硫代苏糖醇(DTT)，搅拌均匀后，碱液调节反应液pH值为8.5，搅拌反应3h后停止，用酸调反应液pH值为3.0，加入2g氯化钠搅拌均匀后，加入冷乙醇150mL沉淀，过滤后，滤饼继续用100mL冷乙醇洗涤两次，加入200mL经过脱氧处理的水并在氮气保护下搅拌溶解，液氮预冻后进行冻干，得巯基化透明质酸(HA-SH)0.8g，重量收率(以HA-TBA投料量计算)为26.7％。
实施例8
称取实施例1所得的HA-TBA 3.0g，溶解于300mL DMSO中，依次加入6.67g 3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)、1.93g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和2.0mL二碳酸二叔丁酯(Boc2O)，45℃下搅拌反应30h，反应液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，用0.2wt％的氯化钠溶液进行透析，8h更换一次透析液，透析操作5次，透析袋内溶液使用旋转蒸发仪减压浓缩至约200mL，加入400mL丙酮进行沉淀，沉淀继续用100mL丙酮洗涤2次，40℃真空干燥，得到3.0g透明质酸二硫化合物。
将上述3.0g透明质酸二硫化合物加入150mL水溶解后，继续加入3.1g三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(TCEP)，搅拌均匀后，碱液调节反应液pH值为8.5，搅拌反应3h后停止，用酸调反应液pH值为3.0，加入1.5g氯化钠搅拌均匀后，加入冷丙酮150mL沉淀，过滤后，滤饼继续用100mL冷丙酮洗涤两次，加入200mL经过脱氧处理的水并在氮气保护下搅拌溶解，液氮预冻后进行冻干，得巯基化透明质酸(HA-SH)0.78g，重量收率(以HA-TBA投料量计算)为26％。
实施例9
称取实施例1所得的HA-TBA 3.0g，溶解于300mL DMSO中，依次加入6.67g 3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)、1.93g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和2.0mL二碳酸二叔丁酯(Boc2O)，45℃下搅拌反应30h，反应液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，用0.2wt％的氯化钠溶液进行透析，8h更换一次透析液，透析操作5次，透析袋内溶液使用旋转蒸发仪减压浓缩至约200mL，加入400mL丙酮进行沉淀，沉淀继续用100mL丙酮洗涤2次，40℃真空干燥，得到3.0g透明质酸二硫化合物。
将上述3.0g透明质酸二硫化合物加入150mL水溶解后，继续加入3.4g还原型谷胱甘肽(GSH)，搅拌均匀后，碱液调节反应液pH值为8.5，搅拌反应3h后停止，用酸调反应液pH值为3.0，加入1.5g氯化钠搅拌均匀后，加入冷丙酮150mL沉淀，过滤后，滤饼继续用100mL冷丙酮洗涤两次，加入200mL经过脱氧处理的水并在氮气保护下搅拌溶解，液氮预冻后进行冻干，得巯基化透明质酸(HA-SH)0.92g，重量收率(以HA-TBA投料量计算)为30.7％。
实施例10
称取实施例1所得的HA-TBA 3.0g，溶解于300mL DMSO中，依次加入6.67g 3,3’-二硫代二丙酸(DTDP)、1.93g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和2.0mL二碳酸二叔丁酯(Boc2O)，45℃下搅拌反应30h，反应液装入透析袋(截留分子量为3500Da)，用0.2wt％的氯化钠溶液进行透析，8h更换一次透析液，透析操作5次，透析袋内溶液使用旋转蒸发仪减压浓缩至约200mL，加入400mL丙酮进行沉淀，沉淀继续用100mL丙酮洗涤2次，40℃真空干燥，得到3.0g透明质酸二硫化合物。
将上述3.0g透明质酸二硫化合物加入150mL水溶解后，继续加入0.86g 2-巯基乙醇，搅拌均匀后，碱液调节反应液pH值为8.5，搅拌反应3h后停止，用酸调反应液pH值为3.0，加入3g氯化钠搅拌均匀后，加入冷丙酮150mL沉淀，过滤后，滤饼继续用100mL冷丙酮洗涤两次，加入200mL经过脱氧处理的水并在氮气保护下搅拌溶解，液氮预冻后进行冻干，得巯基化透明质酸(HA-SH)0.98g，重量收率(以HA-TBA投料量计算)为32.7％。
对比例1
称取分子量为500kDa的透明质酸钠3g，溶解于300mL水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)0.72g和3,3’-二硫代丙二酰肼(DTP)0.89g，用1mol/L盐酸调节反应液pH值为4.75，25℃搅拌反应2h，用1mol/L氢氧化钠溶液调节反应液pH8.6，搅拌均匀后加入二硫代苏糖醇(DTT)6.25g，25℃搅拌反应18h，用1mol/L盐酸调节反应液pH值为3.5，加入10g氯化钠，搅拌溶解后，用300mL乙醇沉淀，并用200mL乙醇洗涤4次，抽滤得滤饼，滤饼用300mL水溶解后倒入透析袋(截留分子量为3500Da)，用pH值为3.5的0.9％氯化钠溶液进行透析，8h更换一次透析液，透析操作5次，透析液使用液氮预冻后进行冻干，得巯基化透明质酸(HA-SH)0.62g，重量收率(以HA投料量计算)为20.7％。
对比例2
称取分子量为250kDa的透明质酸钠3g，溶解于300mL水中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)0.38g和3,3’-二硫代丙二酰肼(DTP)0.54g，用1mol/L盐酸调节反应液pH值为4.75，25℃搅拌反应2h，用1mol/L氢氧化钠溶液调节反应液pH8.6，搅拌均匀后加入二硫代苏糖醇(DTT)6.25g，25℃搅拌反应18h，用1mol/L盐酸调节反应液pH值为3.5，加入10g氯化钠，搅拌溶解后，用300mL乙醇沉淀，并用200mL乙醇洗涤4次，抽滤得滤饼，滤饼用300mL水溶解后倒入透析袋(截留分子量为3500Da)，用pH值为3.5的0.9％氯化钠溶液进行透析，8h更换一次透析液，透析操作5次，透析液使用液氮预冻后进行冻干，得巯基化透明质酸(HA-SH)0.67g，重量收率(以HA投料量计算)为22.3％。
验证例1
对上述实施例和对比例制得的巯基化透明质酸产品进行巯基取代度检测，方法如下：
(1)缓冲液的配制
称取0.254g NaH2PO4与10.162g Na2HPO4于500ml容量瓶中，用超纯水溶解，加入148.896mg的EDTA(乙二胺四乙酸)，使其完全溶解，定容成500ml。
(2)Ellman试剂的配制
称取4mg DTNB(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸))溶解在1ml上述缓冲液中。
(3)半胱氨酸标准溶液的配制
Figure BDA0002291441080000111
Figure BDA0002291441080000121
(4)配制样品溶液
称取10.5mg各实施例和对比例的巯基化透明质酸，用缓冲液溶解并定容至5mL。
(5)配制空白对照溶液
称取10.5mg透明质酸，用缓冲液溶解并定容至5mL。
(6)方法：
取7支试管，分别在每支试管内加入50μL Ellman试剂与2.5mL缓冲液，混匀后，然后在各试管内分别加入50μL标准试剂A-G，混合均匀，在室温放置15min，以试剂G为空白，于波长412nm处测定半胱氨酸标准液的吸光度值(A)，制作标准曲线。待测样品做两组平行试验，取2只试管，分别在每支试管内加入50μL Ellman试剂与2.5mL缓冲液，混匀后，再在各试管内分别加入50μL待测样品，混合均匀，室温放置15min，同时以透明质酸溶液做空白，于波长412nm处测定待测样品的吸光度值(A)，利用标准曲线和测得的样品溶液吸光度，计算样品中巯基浓度C(mmol/L)。
巯基取代度计算公式为：
Figure BDA0002291441080000122
其中：401为透明质酸双糖单元分子量，mg/mmol
0.005为样品溶液的体积，L
C为样品中巯基浓度，mmol/L
m为样品称样量，mg
h为样品干燥失重
M为透明质酸连接巯基基团与透明质酸双糖单元增加的分子量，mg/mmol
3,3’-二硫代二丙酸参与反应，M值为88
2,2’-二硫代二乙酸参与反应，M值为74
4,4’-二硫代二丁酸参与反应，M值为102
3,3’-二硫代丙二酰肼参与反应，M值为102
(7)测试结果
各实施例和对比例产品的巯基取代度如下表1所示：
表1
Figure BDA0002291441080000131
验证例2巯基化透明质酸溶液空气氧化成胶后细胞毒性试验
(1)样品准备
将各实施例和对比例得到的样品用1640无血清培养基配制为1％浓度的溶液，样品溶液在空气中氧化可以形成凝胶，成胶后用等体积的1640无血清培养基浸提12h，取浸提液进行细胞毒性试验。
MTT：用PBS配制浓度为5mg/mL的MTT作用液，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃冰箱保存备用。
(2)加药处理及检测
将L929细胞以2×104/mL密度接种于96孔板，每孔100uL，在37℃、5％CO2条件下培养24h，弃去旧培养液，加入样品，每孔100uL，继续培养24h，每孔加入MTT作用液15uL，酶标仪在490nm下检测吸光度，按下式计算相对增殖率(RGR)。
RGR＝A/A0×100％
式中：
RGR——相对增殖率，％；
A——样品组吸光度，扣除空白；
A0——阴性对照组吸光度，扣除空白。
根据GB/T 16886.5-2017《医疗器械生物学评价》中体外细胞毒性试验的要求，细胞相对增殖率小于70％被认为有细胞毒性反应。
(3)测试结果
测试结果如下表2所示：
表2细胞毒性测试结果
Figure BDA0002291441080000141
验证例3巯基化透明质酸溶解和成胶试验
分别称取各实施例和对比例的冻干样品0.05g于7mL西林瓶中，加入验证例2中的1640无血清培养基5mL，放入搅拌转子，密封后抽真空-充氮气置换3次，开启磁力搅拌，观察溶解情况，记录全部溶解所需时间。待样品全部溶解后将瓶内氮气置换为空气，并打开密封塞，在磁力搅拌下观察样品成胶情况，记录成胶所需时间。
各样品溶解时间和成胶时间如下表3所示：
表3
样品 取代度 全部溶解时间 成胶时间
实施例1 26.8％ 19min 1.5h
实施例2 21.6％ 33min 0.45h
实施例3 25.3％ 40min 0.45h
实施例4 37.2％ 20min 1.5h
实施例5 12％ 14min 1h
实施例6 22.3％ 16min 1.25h
实施例7 18.6％ 14min 1h
实施例8 23.4％ 16min 1.25h
实施例9 17.6％ 14min 1h
实施例10 15.3％ 13min 1h
对比例1 32％ 50min 10h
对比例2 18.4％ 32min 16h
从上表可以看出，透明质酸羟基位点改性的巯基化透明质酸与羧基位点改性的巯基化透明质酸相比，前者溶解速度和成胶时间更快。

Claims (10)

1.一种巯基化透明质酸，其特征是：其是将透明质酸或其盐的部分羟基替换为含有巯基的酯基而得；优选的，巯基的取代度为10%-40%，所述巯基的取代度指的是巯基摩尔数与透明质酸双糖单元摩尔数的比值。
2.根据权利要求1所述的巯基化透明质酸，其特征是：所述含有巯基的酯基的结构式为
Figure 153266DEST_PATH_IMAGE001
，M为C1-C6的亚烷基，优选的，所述含有巯基的酯基为
Figure 834783DEST_PATH_IMAGE002
、
Figure 570658DEST_PATH_IMAGE003
或
Figure 615231DEST_PATH_IMAGE004
；优选的，所述巯基化透明质酸是将平均分子量为200 ~2000 kDa的透明质酸或其盐的部分羟基替换为含有巯基的酯基而得；优选的，每个重复单元最多只有一个羟基被取代，被取代的羟基位于N-乙酰葡糖胺上。
3.一种巯基化透明质酸的制备方法，其特征是：包括a）将透明质酸或其盐中的羟基与含羧基的二硫化合物中的羧基进行酯化反应，以及b）将连接到透明质酸或其盐上的二硫键还原为巯基的步骤；优选的，在透明质酸或其盐与含羧基的二硫化合物反应前，还包括将透明质酸或其盐与四丁基氢氧化铵反应形成透明质酸四丁基铵盐的步骤，然后将透明质酸四丁基铵盐与含羧基的二硫化合物进行反应。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：透明质酸或其盐的平均分子量为200 ~2000 kDa；优选的，所述含羧基的二硫化合物为3,3’-二硫代二丙酸、2,2’-二硫代二乙酸或4,4’-二硫代二丁酸。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：透明质酸或其盐与四丁基氢氧化铵反应的步骤为：将透明质酸或其盐悬浮于有机溶剂水溶液中，加酸调整pH至酸性，使透明质酸或其盐转化为酸型透明质酸，过滤，将滤饼用水溶解，然后加入四丁基氢氧化铵进行反应，反应后冷冻干燥，得透明质酸四丁基铵盐。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是：透明质酸或其盐与四丁基氢氧化铵反应时，加酸至pH≤4，优选pH为2-4；
优选的，透明质酸或其盐与四丁基氢氧化铵反应时，所述有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇和丙酮中的一种或多种，有机溶剂水溶液的浓度为60-90wt%；
优选的，透明质酸或其盐与四丁基氢氧化铵反应时，透明质酸或其盐与有机溶剂水溶液的用量关系为1g:10~50mL；
优选的，透明质酸或其盐与四丁基氢氧化铵反应时，加入四丁基氢氧化铵至溶液pH为6.5~8.0。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：透明质酸或其盐或者透明质酸四丁基铵盐与含羧基的二硫化合物的酯化反应在催化剂存在下进行，所述催化剂为二碳酸二叔丁酯和成分A的混合物，所述成分A为4-二甲氨基吡啶、四甲基乙二胺或N,N’-羰基二咪唑，优选的，成分A与二碳酸二叔丁酯比值为0.15~1.5g:1mL；
优选的，透明质酸或其盐或者透明质酸四丁基铵盐与含羧基的二硫化合物的酯化反应在非质子溶剂存在下进行，更优选的，所述非质子溶剂为二甲基亚砜或N,N-二甲基甲酰胺；
优选的，透明质酸或其盐或者透明质酸四丁基铵盐与含羧基的二硫化合物的质量比为1:1.6~5.0；
优选的，透明质酸或其盐或者透明质酸四丁基铵盐在非质子溶剂中的浓度为0.5~2.0wt%；
优选的，催化剂与透明质酸或其盐或透明质酸四丁基铵盐的质量比为0.5～1.5:1；
优选的，酯化反应的温度为40-50℃。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：连接到透明质酸或其盐上的二硫键在还原剂存在下还原为巯基；
优选的，所述还原剂为二硫代苏糖醇、三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、还原型谷胱甘肽和2-巯基乙醇中的一种或多种；
优选的，还原反应的反应体系的pH为7.0-9.0；
优选的，还原剂与透明质酸或其盐或者透明质酸四丁基铵盐的摩尔比为1.2～2.5:1，透明质酸或其盐或者透明质酸四丁基铵盐的摩尔数以透明质酸双糖单元的摩尔数计；
优选的，还原反应在水中进行，水的用量为透明质酸或其盐的二硫化合物的质量的50~70倍。
9.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是：酯化反应后，还包括将反应液进行后处理得到酯化产物的步骤，后处理包括对反应液进行透析、浓缩、有机溶剂沉淀、有机溶剂洗涤、水溶解、冻干的步骤，或者包括透析、浓缩、有机溶剂沉淀、有机溶剂洗涤、真空干燥的步骤；优选的，将二硫键还原为巯基后，还包括将反应液调节pH至2.0~5.0，然后加入氯化钠、进行有机溶剂沉淀、洗涤、水溶解、压滤的步骤。
10.权利要求1～4中任一项所述的巯基化透明质酸在护肤品、关节注射产品、组织填充剂和细胞培养剂中的应用。
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