CN115703846A - 一种透明质酸衍生物的纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种透明质酸衍生物的纯化方法，将所述透明质酸衍生物的水溶液置于透析容器中，之后分别在低渗透压透析液和高渗透压渗透液中进行交替透析，所述交替透析是指在低渗透压透析液和高渗透压渗透液之间循环交替进行透析，所述循环的循环数为至少三个。本发明提供的纯化方法，具有工艺简单、纯化效率高、杂质残余少、所需纯化时间短、适合大规模批量放大等优点，在透明质酸衍生物的制备纯化中具有积极的应用前景。

Description

一种透明质酸衍生物的纯化方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种透明质酸衍生物的纯化方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic Acid，简称HA)，又名“玻璃酸”，是一种由葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)为双糖单元通过β-1,4和β-1,3糖苷键交替连接而成的一种直链线性阴离子非磺化粘多糖。透明质酸广泛分布于动物和人体的细胞外基质中，是细胞基质和多种组织的重要组成成分，具有多种重要的生理学功能，例如：调节细胞增殖、迁移和分化，天然的保湿作用，润滑关节保护软骨，调节蛋白质合成，调节炎症反应，调节免疫功能，促进伤口愈合等。透明质酸独特的黏弹性、生物相容性和可降解性使其在生物医学领域有广泛的应用，包括作为眼科手术助剂、外科手术后防粘连剂、皮肤创伤愈合再生助剂、药物载体、组织工程支架等。

然而，透明质酸在体内易被降解吸收，滞留时间较短，限制了其在生物医学领域的应用。例如，透明质酸注入关节腔后，其半衰期不超过24h（Brown等，Exp Physiol 1991,76:125-134）。因此，需要对透明质酸进行化学改性及交联，赋予其更为优良的机械强度、流变学特性及抗酶解能力等，扩大其在生物医学领域的应用范围。

透明质酸的侧链上有羧基、羟基两种官能团可供进行偶联交联反应，但这两种官能团的反应活性较低，反应条件苛刻，需要在强碱性或在特定的试剂作用下才具有反应活性，反应局限性很大（刘等，CN106589424A；Gattta等，International Journal ofBiological Macromolecules 2020，144:94-101；Lai JY，Carbohydrate Polymers 201，101:203-212；Choi等，Journal of Biomedical Materials Research Part A 2015，103:3072-3080；Xue等，RSC Advances 2020，10:7206-7213；Jeong等， Toxicology in Vitro2021，70:105034；Nakajima等，Bioconjugate Chem 1995，6：123-130）。对透明质酸的羧基和/或羟基进行化学改性，制备具有更高反应活性官能团的衍生物，可有效拓展其在生物医药领域的应用，具有很多优势。例如，透明质酸巯基化衍生物可以在氧气的作用下形成原位交联水凝胶，具有不需要交联剂、生物相容性好等许多优点（Shu等，Biomacromolecules2002, 3:1304-1311；宋等，CN101200504A；舒，CN101721349A；舒等，CN102399295A;Prestwich等，WO2004037164A2；Prestwich等，WO2005056608A1；普雷斯特维奇等，CN101511875A；邹等，CN103613686A；张等，CN103910886A；孙等，CN104892962A；魏等，CN112842929A；王等，CN114516923A）；同时，透明质酸巯基化衍生物亦可以与聚乙二醇二丙烯酸酯等生物相容交联剂实现快速原位交联，无反应杂质，可用于细胞的原位包埋，在组织再生修复领域具有重要前景（Shu等，Biomaterials 2004, 25:1339-1348；宋等，CN101200504A；Prestwich等，WO2004037164A2；Prestwich等，WO2005056608A1）。

透明质酸的化学改性及交联通常需要活性反应试剂的参与，而活性反应试剂的残余会导致人体炎症反应等毒副作用（Lai JY, Carbohydrate Polymers 2014, 101:203-212; Choi等, Journal of Biomedical Materials Research Part A 2015, 103:3072-3080；Xue等, RSC Advances 2020, 10:7206-7213; Jeong等, Toxicology in Vitro2021, 70:105034），因此需要在反应后纯化去除。

此外，透明质酸的化学改性及交联可能还需要用到大量的助剂，如有机溶剂等，其残余亦会导致人体炎症反应等毒副作用，因此也需要在反应后纯化去除（张等，CN103910886A；魏等，CN112842929A）。

在透明质酸衍生物的制备中，通常采用纯化工艺以去除残余的活性反应试剂和各种助剂。为了提高纯度，当前透明质酸衍生物的纯化通常采用透析工艺，但其纯化效率较低、所需纯化时间长，制约了透明质酸衍生物的规模化制备及其应用。例如，在先专利CN112842929A公开的巯基化透明质酸采用0.1~0.5wt%的氯化钠水溶液进行多次透析；另一份在先专利CN103910886A公开的巯基化透明质酸采用了含有0.1~1.5%（质量分数）氯化钠和30~80%乙醇（体积分数）的混合水溶液进行透析至少48小时；魏等公开的巯基化透明质酸采用含有0.3mM盐酸和0.1M氯化钠的混合溶液透析3天，然后再用0.3mM盐酸水溶液透析2天（中国骨与关节杂志 2015, 4:850-855）；在先专利WO2004037164A2公开的巯基化透明质酸采用含有0.3mM盐酸和0.1M氯化钠的混合溶液进行彻底透析，然后再用0.3mM盐酸水溶液进行透析；以上的现有技术中，对透明质酸衍生物的纯化工艺，均存在纯化时间较长，纯化工艺相对复杂、不利于大规模批量放大生产，从而导致纯化效率降低、纯化不彻底的问题。

因此，本领域亟需一种新的透明质酸衍生物的纯化方法，以提高纯化效率、缩短纯化时间、降低杂质的残余量，对于透明质酸衍生物的制备及其应用具有积极的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于，提供一种透明质酸衍生物的纯化方法，具有工艺简单、纯化效率高、杂质残余少、所需纯化时间短、适合大规模批量放大等优点，对于透明质酸衍生物的制备及其应用具有积极的意义。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种透明质酸衍生物的纯化方法，将所述透明质酸衍生物的水溶液置于透析容器中，之后分别在低渗透压透析液和高渗透压渗透液中进行交替透析，所述交替透析是指在低渗透压透析液和高渗透压渗透液之间循环交替进行透析，所述循环的循环数为至少三个。

本发明中，透明质酸衍生物是指透明质酸的侧链基团（羟基、羧基）通过一种或多种化学反应所制备的衍生物，包括羧甲基改性透明质酸衍生物、巯基化改性透明质酸衍生物、氨基改性透明质酸衍生物等。其中，透明质酸巯基化衍生物是指通过透明质酸侧链羟基和/或羧基的化学反应在侧链引入巯基的衍生物。

透明质酸巯基化衍生物优选半胱胺透明质酸衍生物（I）、半胱胺酸乙酯透明质酸衍生物（II）、3-巯基丙酰肼透明质酸衍生物（III），其结构式如下（其中，HA为透明质酸残基）：

在本发明中，透明质酸衍生物的水溶液置于透析容器中，由于分子尺寸的差异，小分子杂质通过半透膜扩散到透析液，透明质酸衍生物截留在透析容器中，从而达到分离纯化的目的。

具体地，所述透析容器为透析袋或透析管膜。

具体地，所述方法包括以下步骤：

A1、透明质酸衍生物的水溶液置于透析容器中；

A2、透析容器置于低渗透压透析液中透析，所述低渗透压透析液的渗透压低于透明质酸衍生物的水溶液的渗透压；

A3、取出透析容器，置于高渗透压透析液中透析，所述高渗透压透析液的渗透压高于透明质酸衍生物的水溶液的渗透压；

A4、重复步骤A2至A3的操作，至少执行三次，且步骤A2和A3的次序可更换。

在另一具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：

B1、透明质酸衍生物的水溶液置于透析容器中；

B2、透析容器置于低渗透压透析液中透析，所述低渗透压透析液的渗透压低于透明质酸衍生物的水溶液的渗透压；

B3、在低渗透压透析液中加入渗透压调节剂，调节低渗透压透析液的渗透压高于透析容器中透明质酸衍生物水溶液的渗透压，继续透析；

B4、重复步骤B2至B3的操作，至少执行三次。

采用低、高渗透压的透析液进行交替循环透析，更有利于实现小分子杂质的扩散，从而提高纯化效率。透明质酸衍生物水溶液的渗透压通常较低，当其浓度为0.5~2.0%（w/v）时，其相应的渗透压通常为10~40 mOsoml/L；与透明质酸衍生物水溶液相类似，聚乙二醇/聚环氧乙烷水溶液的渗透压通常也较低，高浓度时才具有较高的渗透压。氯化钠溶液则具有很强的渗透压调节能力，当其浓度为0~2.0%时，其相应的渗透压通常为0~620 mOsoml/L。

具体地，所述低渗透压透析液为氯化钠水溶液或纯水，优选地，所述低渗透压透析液为纯水，所述高渗透压透析液选自氯化钠水溶液、聚乙二醇水溶液或聚环氧乙烷水溶液中的一种。

聚乙二醇和聚环氧乙烷含有相同的重复链段，其区别仅在于分子量的不同，聚乙二醇小于20 KDa，聚环氧乙烷大于20 KDa，两者均具有良好的生物相容性，且分别有多种分子量可供选择。

具体地，所述高渗透压透析液中含有聚乙二醇或聚环氧乙烷时，聚乙二醇或聚环氧乙烷的分子量大于透析容器的截留分子量，优选不小于透析容器截留分子量的5倍，更优选不小于10倍。

具体地，所述低渗透压透析液的氯化钠的质量分数为小于0.01%，所述高渗透压透析液为氯化钠水溶液时，所述高渗透压透析液的氯化钠的质量分数为大于2.0%。

优选地，所述高渗透压透析液为氯化钠水溶液时，所述高渗透压透析液的氯化钠的质量分数为大于3.0%。

优选地，所述高渗透压透析液为氯化钠水溶液时，所述高渗透压透析液的氯化钠的质量分数为大于5.0%。

优选地，所述高渗透压透析液为聚乙二醇水溶液或聚环氧乙烷水溶液时，所述高渗透压透析液的聚乙二醇或聚环氧乙烷的质量分数为大于10.0%。

优选地，所述高渗透压透析液为聚乙二醇水溶液或聚环氧乙烷水溶液时，所述高渗透压透析液的聚乙二醇或聚环氧乙烷的质量分数为大于15.0%。

优选地，所述低渗透压渗透液和高渗透压渗透液为中性或弱酸性，所述低渗透压渗透液和高渗透压渗透液的pH值为3-7.4。

具体地，所述渗透压调节剂为氯化钠、聚乙二醇或聚环氧乙烷。

具体地，采用聚乙二醇或聚环氧乙烷作为渗透压调节剂时，聚乙二醇或聚环氧乙烷的分子量大于透析容器的截留分子量，优选不小于透析容器截留分子量的5倍，更优选不小于10倍。

具体地，所述透明质酸衍生物是巯基化改性透明质酸衍生物。

本发明还提供了一种采用前述的方法制备的纯化的透明质酸衍生物及其在医学中的应用。

本发明的透明质酸衍生物的纯化方法具有以下有益效果：

1、本发明提供的透明质酸衍生物的纯化方法，采用纯水或不同浓度的氯化钠溶液作为低渗透压透析液，采用不同浓度的氯化钠溶液、聚乙二醇或聚环氧乙烷溶液作为高渗透压渗透液，通过高低渗透压透析液之间的多次循环透析，更有利于实现小分子杂质的扩散，显著提升了纯化效率。

2、本发明提供的透明质酸衍生物的纯化方法，工艺设计合理，操作步骤简单，缩短了操作时间，整体实用性强，更适合大规模工业化生产。

附图说明

图1为本发明实施例1中，透明质酸衍生物水溶液中乙醇的残余量的检测结果图；

图2为本发明实施例2中，透明质酸衍生物水溶液中胱胺的残余量的检测结果图；

图3为本发明实施例3中，透明质酸衍生物水溶液中乙醇的残余量的检测结果图；

图4为本发明实施例4中，透明质酸衍生物水溶液中胱胺的残余量的检测结果图；

图5为本发明实施例5中，透明质酸衍生物水溶液中乙醇的残余量的检测结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

设置试验组：将含有约5000 ppm乙醇残余的3-巯基丙酰肼透明质酸衍生物（MW200 KDa）水溶液（2% w/v，pH 4.0）置入透析管（截留分子量3500 Da）（Spectrum Labs，美国），用10倍体积的低渗透压透析液（纯水或0.01% w/v氯化钠溶液）透析2.5小时，然后更换为10倍体积的高渗透压透析液（2%、3%或5% w/v氯化钠溶液）透析2.5小时，重复上述过程3次。

设置对照组：对照组仅以单一的纯水和0.01% w/v的氯化钠溶液作为透析液，其余过程与试验组相同。

上述低和高渗透压透析液中均加入了适量稀盐酸，调节其pH为4.0。采用气相色谱仪测定上述透明质酸巯基化衍生物水溶液中乙醇的残余量。

如图1所示，在低渗透压透析液为纯水的试验组中，当高渗透压透析液分别为2%、3%或5% w/v氯化钠溶液，其乙醇残余量分别约为60~130 ppm，相比于对照组的乙醇参与量，实验组的结果显著降低了58~80%。低渗透压透析液为0.01% w/v氯化钠溶液的试验组亦得到类似的结果。

实施例2

设置试验组：将含有胱胺残余（5000 ppm）的半胱胺透明质酸衍生物（MW 1000KDa）水溶液（1% w/v，pH 3.5）置入透析管（截留分子量3500 Da）（Spectrum Labs，美国），用10倍体积的低渗透压透析液（纯水或0.01% w/v氯化钠溶液）透析2.5小时，然后更换为10倍体积的高渗透压透析液（2%、3%或5% w/v氯化钠溶液）透析2.5小时，重复上述过程3次。上述低和高渗透压透析液中加入适量稀盐酸，调节其pH为3.5。

设置对照组：仅以单一的纯水或不同浓度的氯化钠溶液（0.01%、2%、3%、5% w/v）作为透析液，其余与试验组相同。

如图2所示，采用Shu等报道的改进Ellman方法（Biomacromolecules 2002, 3:1304-1311）检测上述巯基化透明质酸衍生物水溶液中杂质的残余量。在低渗透压透析液为纯水的试验组中，当高渗透压透析液分别为2%、3%或5% w/v氯化钠溶液，其胱胺残余量分别约为80~140 ppm，显著低于对照组的胱胺残余量（降低了81-94%）。低渗透压透析液为0.01%w/v氯化钠溶液的试验组亦得到类似的结果。

实施例3

设置试验组：将含有约5000 ppm乙醇残余的3-巯基丙酰肼透明质酸衍生物（MW200 KDa）水溶液（2% w/v，pH 3.5）置入透析管（截留分子量3500 Da）（Spectrum Labs，美国），用5倍体积的低渗透压透析液（纯水或0.01% w/v氯化钠溶液）透析2.5小时，然后在透析液种加入固体氯化钠（2%、3%或5% w/v）调节为高渗透压，搅拌溶解后继续透析2.5小时，重复上述过程4次。上述透析液中加入了适量稀盐酸，调节其pH为3.5。

设置对照组：不额外加入固体氯化钠，其余过程与试验组相同。

如图3所示，采用气相色谱仪测定上述透明质酸巯基化衍生物水溶液中乙醇的残余量。在低渗透压透析液为纯水的试验组中，当高渗透压透析液分别为2%、3%或5% w/v氯化钠溶液，其乙醇残余量分别约为48~112 ppm，显著低于对照组的乙醇残余量，降低了63~84%。低渗透压透析液为0.01% w/v氯化钠溶液的试验组亦得到类似的结果。

实施例4

设置试验组：将含有胱胺残余（5000 ppm）的半胱胺透明质酸衍生物（MW 1000KDa）水溶液（1% w/v，pH 3.0）置入透析管（截留分子量3500 Da）（Spectrum Labs，美国），用10倍体积的低渗透压透析液（纯水或0.01% w/v氯化钠溶液）透析2.5小时，然后在透析液种加入固体氯化钠（2%、3%或5% w/v）调节为高渗透压，搅拌溶解后继续透析2.5小时，重复上述过程4次。上述透析液中加入了适量稀盐酸，调节其pH为3.0。

设置对照组：不额外加入固体氯化钠，其余过程与试验组相同。

如图4所示，采用Shu等报道的改进Ellman方法（Biomacromolecules 2002, 3:1304-1311）检测上述巯基化透明质酸衍生物水溶液中杂质的残余量。在低渗透压透析液为纯水的试验组中，当高渗透压透析液分别为2%、3%或5% w/v氯化钠溶液，其胱胺残余量分别约为65~120 ppm，显著低于对照组的胱胺残余量（降低了86-92%）。低渗透压透析液为0.01%w/v氯化钠溶液的试验组亦得到类似的结果。

实施例5

设置试验组：将含有乙醇残余（2000 ppm）的3-巯基丙酰肼透明质酸衍生物（MW200 KDa）水溶液（1% w/v，pH 3.0）置入透析管（截留分子量3500 Da）（Spectrum Labs，美国），用3倍体积的低渗透压透析液（纯水）透析2.5小时，然后在透析液中加入固体聚环氧乙烷（PEO）（MW 35000）（10%、或15% w/v），搅拌溶解后继续透析2.5小时，重复上述过程3次。上述透析液中加入了适量稀盐酸，调节其pH为3.0。

设置对照组：不额外加入聚环氧乙烷，其余过程与试验组相同。

采用气相色谱仪测定上述透明质酸巯基化衍生物水溶液中乙醇的残余量，如图5所示，试验组的乙醇残余量比对照组降低90%以上。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (15)

1.一种透明质酸衍生物的纯化方法，其特征在于，将所述透明质酸衍生物的水溶液置于透析容器中，之后分别在低渗透压透析液和高渗透压渗透液中进行交替透析，所述交替透析是指在低渗透压透析液和高渗透压渗透液之间循环交替进行透析，所述循环的循环数为至少三个。

2.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物的纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

A1、透明质酸衍生物的水溶液置于透析容器中；

A2、透析容器置于低渗透压透析液中透析，所述低渗透压透析液的渗透压低于透明质酸衍生物的水溶液的渗透压；

A3、取出透析容器，置于高渗透压透析液中透析，所述高渗透压透析液的渗透压高于透明质酸衍生物的水溶液的渗透压；

A4、重复步骤A2至A3的操作，至少执行三次，且步骤A2和A3的次序可更换。

3.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物的纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

B1、透明质酸衍生物的水溶液置于透析容器中；

B2、透析容器置于低渗透压透析液中透析，所述低渗透压透析液的渗透压低于透明质酸衍生物的水溶液的渗透压；

B3、在低渗透压透析液中加入渗透压调节剂，调节低渗透压透析液的渗透压高于透析容器中透明质酸衍生物水溶液的渗透压，继续透析；

B4、重复步骤B2至B3的操作，至少执行三次。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的透明质酸衍生物的纯化方法，其特征在于，所述低渗透压透析液为氯化钠水溶液或纯水，所述高渗透压透析液选自氯化钠水溶液、聚乙二醇水溶液或聚环氧乙烷水溶液中的一种。

5.根据权利要求4所述的透明质酸衍生物的纯化方法，其特征在于，所述低渗透压透析液的氯化钠的质量分数为小于0.01%，所述高渗透压透析液为氯化钠水溶液时，所述高渗透压透析液的氯化钠的质量分数为大于2.0%。

6.根据权利要求4所述的透明质酸衍生物的纯化方法，其特征在于，所述高渗透压透析液为氯化钠水溶液时，所述高渗透压透析液的氯化钠的质量分数为大于3.0%。

7.根据权利要求4所述的透明质酸衍生物的纯化方法，其特征在于，所述高渗透压透析液为氯化钠水溶液时，所述高渗透压透析液的氯化钠的质量分数为大于5.0%。

8.根据权利要求4所述的透明质酸衍生物的纯化方法，其特征在于，所述高渗透压透析液为聚乙二醇水溶液或聚环氧乙烷水溶液时，所述高渗透压透析液的聚乙二醇或聚环氧乙烷的质量分数为大于10.0%。

9.根据权利要求1所述的透明质酸衍生物的纯化方法，其特征在于，所述高渗透压透析液为聚乙二醇水溶液或聚环氧乙烷水溶液时，所述高渗透压透析液的聚乙二醇或聚环氧乙烷的质量分数为大于15.0%。

10.根据权利要求3所述的透明质酸衍生物的纯化方法，其特征在于，所述渗透压调节剂为氯化钠、聚乙二醇或聚环氧乙烷。

11.根据权利要求1-3、5-10中任一项所述的透明质酸衍生物的纯化方法，其特征在于，所述透明质酸衍生物是巯基化改性透明质酸衍生物。

12.根据权利要求4所述的透明质酸衍生物的纯化方法，其特征在于，所述透明质酸衍生物是巯基化改性透明质酸衍生物。

13.一种采用如权利要求1-3、5-10和12中任一项所述的透明质酸衍生物的纯化方法制备的纯化的透明质酸衍生物及其在医学中的应用。

14.一种采用如权利要求4所述的透明质酸衍生物的纯化方法制备的纯化的透明质酸衍生物及其在医学中的应用。

15.一种采用如权利要求11所述的透明质酸衍生物的纯化方法制备的纯化的透明质酸衍生物及其在医学中的应用。

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