CN114106215A - 一种巯基修饰的透明质酸（钠）及其交联产物以及它们的制备方法和应用 - Google Patents
一种巯基修饰的透明质酸（钠）及其交联产物以及它们的制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明以硫辛酸酰肼对透明质酸的羧基进行可控修饰合成巯基官能化透明质酸(钠)为核心，获得了一种生物安全性更高的具有创新结构的巯基修饰的透明质酸(钠)，该巯基修饰的透明质酸(钠)在一般温度下即可自身或者与适宜高分子化合物快速发生自交联(即不使用交联剂)反应。
Description
技术领域
本发明属于生物医药和医学美容领域，具体涉及一种生物安全性更高的巯基修饰的透明质酸(钠)及其交联产物，以及生产该修饰化透明质酸(钠)及其交联产物的方法以及这些产物的用途。
背景技术
透明质酸是一种非硫代线性粘多糖聚合物，分子量范围可高达10000kDa。这种聚阴离子化合物具有很多独特的理化性质以及与众不同的生物活性。近年来，随着对HA功能的深入研究，HA已广泛应用于医药领域，如用于制备药物传递系统以及用于骨科疾病和眼科疾病的治疗、手术后粘连的预防及软组织修复等，对透明质酸在医药领域的应用研究已成为组织工程领域的研究热点。然而，较低的生物机械性能以及体内较短的降解时间阻碍了透明质酸在临床应用中的发展。因此，为了获得机械性能更加优越、化学稳定性显著提高的透明质酸材料，多种透明质酸修饰方法以及交联方法已得到了广泛研究。
透明质酸水凝胶可以通过使用二乙烯基砜、丁二醇二缩水甘油醚、戊二醛、水溶性碳化二亚胺等一系列双官能度交联剂来制备。然而，这些传统交联剂的毒性相对较强，交联水凝胶必须经过一系列清洗纯化过程来去除微量残留交联剂以及副产物，而这些工艺环节的加入，不仅增加生产成本、生产时间等，而且对产物收率、产物的安全性有较大影响。因此，开发具有高生物相容性的、安全可用的、易进行交联反应的新型透明质酸衍生物具有广泛的实用价值和应用前景。
硫辛酸(lipoic acid),为含有二硫五元环的八碳脂肪酸，结构式如下。硫辛酸虽然不是维生素，但由于其结构的特殊性，可作为辅酶参与机体内物质代谢过程(酰基转移，递氢载体)，具有与维生素相似的生理功能。硫辛酸含有的二硫五元环结构具有极高的电子密度，具有显著的自由基捕获能力以及亲电性，因此硫辛酸具有极强的抗氧化性、保健功能和医用价值。此外，硫辛酸的巯基很容易进行氧化还原反应，故可保护巯基酶免受重金属离子的络合毒害作用。硫辛酸，由于其特有的生理活性和抗氧化作用，已有分别作为保健品和药品的产品在中国和欧洲、日本等地上市，比较广泛被熟知的产品是药品硫辛酸注射液，该产品主要用于糖尿病周围神经病变(DPN)引起的感觉异常。
巯基官能化透明质酸是一种易于交联，生物相容性好，有抗氧化能力以及自由基捕获能力的透明质酸衍生物。近年来已有多篇文献报道该类透明质酸衍生物形成的水凝胶在组织工程学和再生医学领域展现出了良好的应用价值。然而现阶段报道的巯基透明质酸修饰方法还存在诸多缺陷，极大地阻碍了该HA衍生物的工业化应用的进程。例如：经典二硫代二酰肼修饰法需要经历凝胶过程，导致反应后期搅拌不充分，反应修饰程度不均一；二硫代二酰肼无商业化产品，需要提前合成，成本大大增加；经典光胺修饰法受限于氨基反应活性低的问题，无法获得较高取代度的巯基修饰透明质酸衍生物。因此，该类材料的应用技术仍然局限于实验室研究领域，并未产生成熟的工业化应用实例。
发明内容
本发明以硫辛酸酰肼对透明质酸的羧基进行可控修饰合成巯基官能化透明质酸(钠)为核心，获得了一种生物安全性更高的具有创新结构的巯基修饰的透明质酸(钠)，该巯基修饰的透明质酸(钠)在一般温度下即可自身或者与适宜高分子化合物快速发生自交联(即不使用交联剂)反应。
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种具有如下式所示结构的巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠：
本领域技术人员可以理解，各种分子量的透明质酸或透明质酸钠均可用于本发明。在优选的实施方案中，被巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠的分子量为200kDa-400kDa。
在优选的实施方案中，巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠的修饰率(或取代度)为50％-70％，优选为60％-70％，更优选约65％。在本发明中，修饰率或取代度表示被修饰的透明质酸(钠)单元占全部透明质酸(钠)单元的百分比。
本领域技术人员可以理解，在本发明中，可以使用各种来源的透明质酸(钠)，可以市售，也可以自制，可以是提取物，也可以通过生物发酵等方式制备得到。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及上述巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠的制备方法，包括如下步骤：将透明质酸(钠)溶解于水中，并调节所得溶液的pH至4.5-5.0，优选 4.7-4.8，加入EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)搅拌使之溶解，随后加入硫辛酸酰肼，于0℃-90℃，优选20℃-50℃，最优选室温下搅拌反应0.1-4h，优选0.5-2h，最优选约1h，优选反应过程中控制反应液的pH为4.5-5.0，优选4.7-4.8，随后调节反应液 pH至7.0-9.0，优选8.4-8.6以终止反应，加入二硫苏糖醇，于0℃-90℃，优选20℃-50℃，最优选室温下搅拌反应12-36h，优选18-30h，最优选约24h，调节反应液pH至6.5-7.5，优选6.9-7.1，将反应液透析并冻干得巯基修饰的透明质酸(钠)。
优选地，透明质酸(钠)的分子量为200kDa-400kDa；
优选地，透明质酸(钠)水溶液的质量/体积浓度为0.1％-2.5％，更优选为0.5-1.5％，最优选为约1.0％；
优选地，EDCI的摩尔和透明质酸(钠)的单元摩尔比为1:2-4:1，更优选1:1-3:1，最优选为约2:1；
优选地，加入EDCI搅拌使之溶解后继续搅拌2-60分钟后，更优选5-30分钟，最优选约 15分钟后再加入硫辛酸酰肼，以活化拟修饰的反应位点；
优选地，硫辛酸酰肼的摩尔和透明质酸(钠)的单元摩尔比为1:2-4:1，更优选1:1-3:1，最优选为约2:1；
优选地，二硫苏糖醇和透明质酸(钠)的质量比为2-20:1，更优选5-15:1，最优选为约 10:1；
本领域技术人员可以理解，透析以去除反应残留物及杂质。优选地，使用透析袋。
本领域技术人员可以理解，各种本领域常用的pH调节剂均可用于本发明。优选地，使用盐酸水溶液和/或氢氧化钠水溶液调节pH，更优选，盐酸水溶液的浓度为约1mol/L，氢氧化钠水溶液的浓度为约1mol/L。
上述反应的具体反应路线如下：
本发明的巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠在一般温度下即可自身或者与适宜高分子化合物快速发生自交联(即不使用交联剂)反应。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种水凝胶，其由上述巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠交联得到。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及上述水凝胶的制备方法，包括如下步骤：制备含有上述巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠的水溶液，于0℃-90℃，优选20℃-50℃，最优选 37℃下反应2-20h，优选4-12h。
根据本发明，水溶液中巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠的质量/体积浓度为0.1％-5.0％，更优选为1-3％，最优选为约2.0％。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及一种水凝胶，其由上述巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠与含双键的聚合物交联得到。
根据本发明，巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠与含双键的聚合物的质量比为1:10-10:1，优选为1:5-5:1，最优选约1:1。
根据本发明，含双键的聚合物优选丙烯酰化透明质酸或透明质酸钠、非硫辛酸巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠，优选低取代的非硫辛酸巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠、低取代的丙烯酰化透明质酸或透明质酸钠。此处的低取代一般是指修饰率在5％-30％之间。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及上述水凝胶的制备方法，包括如下步骤：制备含有上述巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠和上述含双键的聚合物的水溶液，于0℃-90℃，优选20℃-50℃，最优选37℃下反应0.1-10h，优选10min-1h。
根据本发明，水溶液中巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠的质量/体积浓度为0.1％-5.0％，更优选为1-3％，最优选为约2.0％；含双键的聚合物的质量/体积浓度为0.1％-5.0％，更优选为1-3％，最优选为约2.0％。
本发明的水凝胶可用于生物医药和医学美容领域的应用，例如制成外用伤口敷料、医学美容领域的塑型、整型或面部填充，例如医学美容的鼻唇部填充、替代现有医美中的玻尿酸针剂、中度至深度静脉性溃疡伤口敷料的骨架材料等。
本发明的有益效果在于：
1.本发明的修饰反应第一步涉及到EDCI对酰肼和羧基的偶联反应，可以在比较高的效率下将硫辛酸酰肼共价键合到透明质酸(钠)主链当中。第二步反应涉及到二硫苏糖醇(DTT) 对硫辛酸二硫键的还原切断反应，反应效率高，副产物易于去除。
2.本方法为一锅两步法合成得到巯基修饰的透明质酸(钠)衍生物，巯基接枝率可精确调节，并且每个接枝位点含有两个巯基官能团，在不增加修饰单元百分比的情况下理论巯基含量是传统巯基修饰透明质酸(钠)的两倍。
3.本发明的巯基官能化透明质酸(钠)既可以通过巯基氧化反应交联形成凝胶支架，又可以通过巯基与乙烯基双键的化学反应交联形成水凝胶网格结构。与传统方法合成的巯基化透明质酸(钠)相比，巯基理论接枝率提高为原来的二倍。因此，本产品形成的凝胶支架拥有更高的交联密度以及机械强度，在体内的维持时间要明显高于传统方法合成巯基透明质酸 (钠)在体内的代谢时间，在填充塑型美容产品领域拥有更诱人的应用前景。另外，改巯基化改性透明质酸(钠)所使用的改性试剂为硫辛酸衍生物。该物质生物相容性好，修饰反应产物不会产生过敏反应。
4.开创性地使用硫辛酸酰肼衍生物结合到透明质酸(钠)骨架当中，大大降低了传统巯基透明质酸(钠)合成方法中所使用二硫代二酰肼的毒性影响。
5.反应过程中由于二硫键以五元环形式存在，因此不存在反应过程发生凝胶的不利因素影响，修饰反应均一度比较高。
6.巯基连接单元长度比传统方法修饰试剂大，提高了巯基的活动范围，增强反应活性。
7.避免了有机溶剂的使用，从根本上排除了产品中有机溶剂的残留问题，生物相容性更好，植入人体的排异反应及炎症反应发生概率可以大大降低。
8.本发明中所述的巯基化透明质酸(钠)及其交联产物，在生物医药或医学美容领域的优势点在于，更好的物理化学性能，并且优于现有市售产品的安全性。但其用途可以不限于生物医药或医学美容领域。
附图说明
图1巯基修饰的透明质酸钠的结构特征1H-NMR谱图
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明所记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明所限定的范围。
制备例1硫辛酸酰肼的制备
称取硫辛酸10g溶解于200mL乙醇中，滴加50μL浓硫酸(98％)于溶液中。反应体系回流8 小时，冷却至室温。旋转蒸发除去溶剂，所得粗产品加入200mL乙醚溶解，100mL水萃取有机相三次，分液所得有机相使用硫酸钠干燥后，旋转蒸发除去溶剂，得到8.9g硫辛酸乙酯。
称取6g硫辛酸乙酯溶解于50mL乙醇中，取酰肼(40-60％溶液，4倍硫辛酸乙酯摩尔当量) 溶解于50mL乙醇中。将硫辛酸乙酯溶液滴加入酰肼溶液中，室温搅拌，滴加完成后升温至50℃反应2小时，冷却至室温，过滤得到晶状硫辛酸酰肼产物。真空干燥后得到4.5g硫辛酸酰肼。
实施例1以硫辛酸酰肼为起始原料合成巯基修饰的透明质酸钠
取分子量为300kDa的透明质酸钠10.0g溶解于超纯水中，配制成1％(w/v)的澄清透明溶液，用1mol/L盐酸水溶液调节其pH在4.7-4.8之间；加入相当于透明质酸钠单元摩尔量2倍量的EDCI，搅拌使之溶解，继续搅拌15分钟；加入相当于透明质酸钠单元摩尔量2倍量的硫辛酸酰肼，室温搅拌反应1小时，反应过程中用1mol/L盐酸水溶液将反应液pH维持在4.7-4.8之间；用1mol/L NaOH水溶液调节反应液pH至8.5，以终止偶联反应；加入二硫苏糖醇100.0g，室温搅拌24h以还原硫辛酸二硫键；调节反应液pH至7.0，将反应液转入透析袋(仕必纯，截留分子量为8千道尔顿)透析3天，将透析后所得的纯化溶液经冷冻干燥后得巯基修饰的透明质酸钠，收率为76％。充氩气避光保存于-20℃备用。
该巯基修饰的透明质酸钠的结构特征谱图见图1。
实施例2以Ellman法定量测定实施例1巯基化透明质酸钠的修饰率
透明质酸钠是重复的二糖结构，其中所含游离羧基的数量是基本固定的，因此，通过测定巯基化透明质酸钠中巯基的量，即可测算出该透明质酸钠衍生物的巯基化修饰程度。可以用Ellman法对游离巯基进行定量。在本发明中，修饰率或取代度表示被修饰的透明质酸(钠) 单元占全部透明质酸(钠)单元的百分比。
Ellman法原理：游离巯基与过量DNTB在常温下反应，生成有色物质，在412nm的紫外光处有吸收，Emol＝13600，根据Lamber-Beer定律，A＝Emol·C·L，L＝1，可通过测定吸收度(A)，求得实际巯基的浓度。
巯基化修饰程度的计算方法：巯基化透明质酸钠由重复的二糖单元组成，每个二糖单元的分子量为388，含有1个可反应的羧基，接上巯基后的分子量为491，本实验称取实施例1制备得到的HA-SH 10mg，配制成100mL溶液，该溶液浓度为0.1g/L，使其与过量DTNB常温反应，生成有色物质，在412nm处测定其吸收度(A)。则可得：1g巯基化透明质酸钠含巯基数量为 N＝A/Emol/0.2。实施例1的巯基化透明质酸钠的修饰率为65％。实施例1的巯基化透明质酸钠的修饰率也可以由NMR法进行测定，两种方法测定结果是一致的。
实施例3以实施例1巯基化透明质酸钠的自交联反应制备水凝胶
取实施例1的巯基修饰的透明质酸钠2.0g，在烧杯中配制成浓度为2％(w/v)的溶液，将该溶液置于37℃水浴之中交联8小时得交联产物，该交联产物相比于交联前，在储能模量、降解时间等指标方面均有显著提升，具体见表1。
实施例4实施例1巯基化透明质酸钠与丙烯酰化透明质酸钠的自交联反应制备水凝胶
取实施例1的巯基修饰的透明质酸钠2.0g，在烧杯中配制成浓度为2％(w/v)的溶液，另取丙烯酰化透明质酸钠2.0g，在另一烧杯中配制成浓度为2％(w/v)的溶液，将上述两种溶液以等体积混合于同一容器内，置于37℃水浴之中交联30min得交联产物，该交联产物相比于交联前，在储能模量、降解时间等指标方面均有显著提升，具体见表1。
实施例5巯基修饰的透明质酸钠及其自交联产物与市售透明质酸钠、市售交联透明质酸钠的理化性质对比
储能模量检测方法：取实施例3或4制备的水凝胶样品，或者市售交联透明质酸钠样品各 0.2克，置于TA-DHR2流变仪检测台上。测试参数如下：测试时间：1min，测试温度：25度，探头测试间距：3000微米，测试频率：1Hz。记录所得储能模量数值于表1。
降解时间检测：取实施例1制备的透明质酸钠样品、实施例3或4制备的水凝胶样品、市售透明质酸钠或市售交联透明质酸钠样品各0.5克，浸泡于5毫升PBS缓冲液中。将样品置于37 度摇床中培养，每两周取出样品并称量重量(每时间点三组平行样品)，完全溶解时间点即为降解时间。
表1巯基修饰的透明质酸钠及其自交联产物与市售品的理化性质对比
| 样品 | 储能模量(Pa) | 降解时间(months) |
| 实施例1巯基修饰的透明质酸钠 | - | 2 |
| 实施例3巯基修饰的透明质酸钠的交联产物 | 270±15 | 13 |
| 实施例4巯基修饰的透明质酸钠的交联产物 | 260±20 | 15 |
| 市售透明质酸钠 | - | 1 |
| 市售交联透明质酸钠 | 210±10 | 6 |
实施例6巯基修饰的透明质酸钠及其自交联产物的生物安全性对比
参考GB/T16886.5中的方法测定体外细胞毒性，样品与实施例5中的样品一致，分别为实施例1巯基修饰的透明质酸钠、实施例3巯基修饰的透明质酸钠的交联产物、实施例4巯基修饰的透明质酸钠的交联产物、市售透明质酸钠、市售交联透明质酸钠。供试品经对比研究后选用：材料浸提液。浸提介质为两种，分别为生理盐水溶液、聚氧乙烯蓖麻油，浸提使用无菌技术，在无菌、化学惰性的封闭容器中进行，浸提条件为37℃振摇浸提24h，浸提前以培养基对样品进行充分浸润。所用细胞系为3T3细胞系，所用培养基为添加新生小牛血清(10％)和青霉素/链霉素(1％)的改良杜氏依格尔培养液(DMEM)。
采用三个平行试验样品数和对照数。本试验是为细胞毒性定性和定量评价所设计。从持续搅拌的细胞悬浮液中吸取等量的悬浮液，注入浸提液接触的每只培养器皿内，轻轻转动培养器皿使细胞均匀地分散在器皿的表面。根据培养基选择含或不含5％(体积分数)二氧化碳的空气作为缓冲系统，在37℃士2℃温度下进行培养。试验是在近汇合单层细胞或新鲜悬浮细胞上进行。试验前用显微镜检查培养细胞的近汇和形态。试验是在选用浸提原液进行，用悬浮细胞进行试验。同时，加等量的空白试剂和阴性及阳性对照液至其他平行器血中。经过至少24h的培养后。选用直接接触试验和间接接触试验。
细胞毒性判定：可来用定性或定量方法检测细胞毒性。定性评价：用显微镜检查细胞，评价诸如一般形态、空泡形成、脱落、细胞溶解和膜完整性等方面的变化，一般形态的改变可描述性地在试验报告中记录或以数字记录，以下是给试验材料计分的有效方法。
根据以上方法，可明确得出本发明中的巯基修饰的透明质酸钠，其安全性优于市售的透明质酸钠，本发明中的巯基修饰透明质酸钠的交联产物，其安全性优于市售的交联透明质酸钠。具体结果见下表2。
表2巯基修饰的透明质酸钠及其自交联产物与市售品的安全性对比
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，或在本发明的思路与框架之下，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种具有如下式所示结构的巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠：
优选地，被巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠的分子量为200kDa-400kDa。
优选地，巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠的修饰率(或取代度)为50％-70％，优选为60％-70％，更优选约65％。
2.如权利要求1所述巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将透明质酸(钠)溶解于水中，并调节所得溶液的pH至4.5-5.0，优选4.7-4.8，加入EDCI(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐)搅拌使之溶解，随后加入硫辛酸酰肼，于0℃-90℃，优选20℃-50℃，最优选室温下搅拌反应0.1-4h，优选0.5-2h，最优选约1h，优选反应过程中控制反应液的pH为4.5-5.0，优选4.7-4.8，随后调节反应液pH至7.0-9.0，优选8.4-8.6以终止反应，加入二硫苏糖醇，于0℃-90℃，优选20℃-50℃，最优选室温下搅拌反应12-36h，优选18-30h，最优选约24h，调节反应液pH至6.5-7.5，优选6.9-7.1，将反应液透析并冻干得巯基修饰的透明质酸(钠)。
优选地，透明质酸(钠)的分子量为200kDa-400kDa；
优选地，透明质酸(钠)水溶液的质量/体积浓度为0.1％-2.5％，更优选为0.5-1.5％，最优选为约1.0％；
优选地，EDCI的摩尔和透明质酸(钠)的单元摩尔比为1:2-4:1，更优选1:1-3:1，最优选为约2:1；
优选地，加入EDCI搅拌使之溶解后继续搅拌2-60分钟后，更优选5-30分钟，最优选约15分钟后再加入硫辛酸酰肼，以活化拟修饰的反应位点；
优选地，硫辛酸酰肼的摩尔和透明质酸(钠)的单元摩尔比为1:2-4:1，更优选1:1-3:1，最优选为约2:1；
优选地，二硫苏糖醇和透明质酸(钠)的质量比为2-20:1，更优选5-15:1，最优选为约10:1。
3.一种水凝胶，其特征在于，由如权利要求1所述的巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠交联得到。
4.如权利要求3所述的水凝胶的准备方法，其特征在于，包括如下步骤：制备含有上述巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠的水溶液，于0℃-90℃，优选20℃-50℃，最优选37℃下反应2-20h，优选4-12h。
优选地，所述水溶液中巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠的质量/体积浓度为0.1％-5.0％，更优选为1-3％，最优选为约2.0％。
5.一种水凝胶，其特征在于，由如权利要求1所述的巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠与含双键的聚合物交联得到。
优选地，巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠与含双键的聚合物的质量比为1:10-10:1，优选为1:5-5:1，最优选约1:1。
6.如权利要求5所述的水凝胶，其特征在于，含双键的聚合物优选丙烯酰化透明质酸或透明质酸钠、非硫辛酸巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠，优选低取代的非硫辛酸巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠、低取代的丙烯酰化透明质酸或透明质酸钠。
7.如权利要求5或6所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：制备含有上述巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠和上述含双键的聚合物的水溶液，于0℃-90℃，优选20℃-50℃，最优选37℃下反应0.1-10h，优选10min-1h。
优选地，所述水溶液中巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠的质量/体积浓度为0.1％-5.0％，更优选为1-3％，最优选为约2.0％；含双键的聚合物的质量/体积浓度为0.1％-5.0％，更优选为1-3％，最优选为约2.0％。
8.如权利要求1所述的巯基修饰的透明质酸或透明质酸钠或如权利要求3或5所述的水凝胶在生物医药和医学美容领域中的应用。
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| CN115364044A (zh) * | 2022-06-17 | 2022-11-22 | 浙江大学医学院附属第一医院 | 一种药物组合物及其制备方法和用途 |
Citations (3)
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| US20090017091A1 (en) * | 2007-06-29 | 2009-01-15 | Daniloff George Y | Sterile hyaluronic acid polymer compositions and related methods |
| CN103613686A (zh) * | 2013-11-12 | 2014-03-05 | 广州市一杰医药科技有限公司 | 巯基化透明质酸的制备方法及其应用 |
| CN111588913A (zh) * | 2020-05-15 | 2020-08-28 | 四川大学 | 一种自交联透明质酸及其复合胶原蛋白类的水凝胶注射剂及其应用 |
-
2020
- 2020-08-31 CN CN202010900710.5A patent/CN114106215A/zh active Pending
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