CN115252888B - 一种胶原蛋白凝胶敷料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶原蛋白凝胶敷料及其制备方法和应用,按质量百分比计算,包括以下组分:氨基酸改性透明质酸,0.1~1%;重组人源胶原蛋白,0.05~0.1%;磷钨酸,0.01~0.02%;苯氧乙醇,0.1~0.2%;三乙醇胺,0.02~0.04%;余量为水。本发明利用氨基酸改性透明质酸与磷钨酸的相互作用力形成在湿性环境下具有粘性的凝胶敷料,同时发挥了季铵盐与磷钨酸的协同抗菌作用,并利用磷钨酸与重组人源III型胶原蛋白的相互作用,达到缓释蛋白的作用。
Description
技术领域
本发明属于合成生物医学材料技术领域,具体涉及一种胶原蛋白凝胶敷料及其制备方法和应用。
背景技术
重组人源III型胶原蛋白是利用基因工程技术以人胶原III型原始基因序列经过优化重组表达得到的,与人体天然胶原氨基酸序列高度一致。将重组人源III型胶原蛋白用于创伤愈合,一方面其具有丰富的亲水基团,可以增加成纤维细胞的粘附和增殖,另一方面可以直接补充创面的III型胶原蛋白,降低瘢痕的发生几率。现有技术中,利用重组人源胶原蛋白制备的敷料中绝大部分为凝胶敷料,常用的水性凝胶基质有卡波姆、HPMC、CMC-Na和PVA等。该类凝胶敷料含有大量的羟基、羧基等氢键作用基团,在皮肤表面干燥成膜后,重新吸收伤口渗出液会使得敷料粘度下降,从而脱落,作用于伤口的时间较短,一方面是药物的浪费,一方面是使用感受不佳,未及时补充容易造成伤口干燥、感染、二次伤害等问题。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种胶原蛋白凝胶敷料,按质量百分比计算,包括以下组分:
氨基酸改性透明质酸,0.1~1%;
重组人源胶原蛋白,0.05~0.1%;
磷钨酸,0.01~0.02%;
苯氧乙醇,0.1~0.2%;
三乙醇胺,0.02~0.04%;
余量为水。
所述氨基酸改性透明质酸制备方法如下:
透明质酸在碱性条件下与氨基酸环氧化合物加热搅拌反应得到。
所述氨基酸环氧化合物的制备方法如下:
根据文献记载的方法(T Brown,JH Jones,JD Richards. Further studies onthe protection of histidine side chains in peptide synthesis: The use of theπ-benzyloxymethyl group. J.Chem.Soc.PerkinTrans.I. 1982)制备N-Boc-L-组氨酸甲酯,记为化合物A;
在二氯甲烷中,在三乙胺的存在下,化合物A经三苯甲基氯处理,得化合物B;
在二氯甲烷中,化合物B和(碘甲基)环氧乙烷加热回流反应,得铵盐C;
铵盐C在80%乙酸中,用乙酸银处理,转化为化合物D;
化合物D碱皂化除去酯基,进一步酸化,后以三氟乙酸脱去Boc保护基得到氨基酸环氧化合物E。
反应流程如下:
透明质酸是一种葡聚糖醛酸,具有优异的保湿型、吸湿性,广泛应用于化妆品、医疗中;另外其还具有成膜性,能够在皮肤表面形成一层透气的薄膜,隔外来细菌、粉尘等侵入。本发明对其进行改性,使其吸湿性、保湿性进一步提高,同时赋予其抗菌性能。
纳米磷钨酸(HPW)是一类具有亚纳米结构的金属氧化物团簇,HPW能够与氨基酸分子中的氨基通过静电作用力结合,从而形成以下结构:
研究表明,磷钨酸及其盐也是一种很好的抑菌剂,HPW的阴离子与季铵阳离子通过静电作用力结合可以发挥协同增效的抗菌性能,是一种新型的抗菌剂。本发明利用氨基酸改性透明质酸与杂多酸磷钨酸的协同抗菌作用,防止伤口细菌、真菌感染。另一方面,氨基酸改性透明质酸同时含有大量的醇羟基,磷钨酸具有超高的比表面积和高密度的表面氢键位点,两者能够形成氢键交联,一方面利用羟基、季铵阳离子与磷钨酸阴离子的结合力的不同,赋予凝胶敷料膜稳定的交联结构以及柔韧性,另一方面,同时赋予凝胶具有湿性环境下的粘结性。
重组人源III型胶原蛋白中同样具有大量的氢键结构,从而形成稳定的构像,蛋白所处的液体环境的改变对蛋白的构像具有重大的影响,本发明研究过程中发现磷钨酸与胶原蛋白存在相互作用力,在一定的添加范围内,能够使得蛋白保持生物活性的同时利用磷钨酸对其进行锚定,起到缓释的作用。
有益效果:
本发明利用氨基酸改性透明质酸与磷钨酸的相互作用力形成在湿性环境下具有粘性的凝胶敷料,同时发挥了季铵盐与磷钨酸的协同抗菌作用。利用磷钨酸与重组人源III型胶原蛋白的相互作用,达到缓释蛋白的作用。实验表明,本发明提供的凝胶敷料薄膜在饱和湿度下静置12h后仍有较高的粘合力,对大肠杆菌具有优异的抑菌活性,生物安全性实验表明,本发明的凝胶敷料皮肤刺激性和细胞毒性较小,优异的湿粘合性和机械强度大大延长了敷料的使用寿命。
附图说明
图1为透明质酸、氨基酸改性透明质酸及其与磷钨酸的混合液的红外光谱图。
图2为圆二色谱图。
图3为胶原蛋白释放度随时间的变化关系。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明,但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明,本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
制备氨基酸改性透明质酸。
(1)制备氨基酸环氧单体;
在二氯甲烷(500mL)中溶解N-Boc-L-组氨酸甲酯(A)(85.8g、0.32mol) 和三乙胺(32g),置于冰水浴中并滴加三苯甲基氯(105g)的二氯甲烷(300mL)溶液。保温搅拌30min后转移至常温继续反应20h,反应液浓缩后用饱和食盐水洗5遍后,用无水硫酸钠干燥有机层,减压蒸馏除溶,获得(B)。
在二氯甲烷(1000mL)中溶解(B)(155.3g),加入(碘甲基)环氧乙烷(158.4g),加热至60℃回流反应20h,追加(碘甲基)环氧乙烷(120.6)继续反应48h,减压蒸馏除溶,重新用去离子水(800mL)溶解,充分搅拌过滤后,取滤液旋蒸得到油状物,往油状物中加入石油醚,进行3次倾析,得到固体(C)。
在80%乙酸(500mL)中加入固体(C) (186g)和乙酸银(52g),在室温下搅拌20h,过滤除去不溶物后,在减压下蒸馏除去溶剂。加入水(400mL)重新溶解,加入无水碳酸钾调至弱碱性,油状物析出,用乙酸乙酯萃取后,取有机相减压蒸馏,获得固体(D)。
在二甲基亚砜DMSO(200mL)中溶解固体(D)(82.4g)和NaOH(25g)的水溶液(200mL),常温下搅拌30min,然后加入36wt%盐酸调节至PH=2~3,搅拌1h后减压除溶,重新以二氯甲烷(300mL)溶解,加入三氟乙酸(100mL)室温搅拌1h,减压蒸馏,即得到氨基酸环氧单体,也即氨基酸环氧化合物。
1H-NMR(CDCl3):2.32(dd,1H),2.61(dd,1H),3.95(dd,1H),3.75(dd,1H),2.82(dd,1H),3.11(dd,1H),4.22(t,1H),6.65(s,1H),7.42(s,1H),8.75(s,2H)。
(2)制备氨基酸改性透明质酸;
透明质酸溶于异丙醇溶液中,并加入20%的NaOH溶液,然后放入室温的水浴锅中磁力搅拌2h,加入氨基酸环氧单体搅拌均匀,调节pH=8,50~80℃下继续搅拌6~10h,反应结束后将得到的溶液倒入HCl质量浓度为20%的甲醇溶液中沉淀析出,抽滤得到沉淀物,用乙醇洗涤沉淀物并过滤,减压下干燥得到氨基酸改性透明质酸。
透明质酸购于上海麦克林,分子量为10~20万。
透明质酸、异丙醇、氨基酸改性透明质酸的用量的重量比为100:500:55。
测试例1
对透明质酸、氨基酸改性透明质酸及其与磷钨酸的混合液进行红外表征,采用KBr压片法,参阅附图1。
氨基酸改性透明质酸相对于透明质酸出现了1562cm-1、1384cm-1的新峰,分别对应NH3 +伸缩振动和COO-不对称伸缩振动峰。说明氨基酸环氧单体成功接枝至透明质酸链上。
加入了HPW后,在曲线上可以看见磷钨酸的特征峰,分别为987cm-1、888cm-1和804cm-1。另外还观察到1733cm-1处出现了COOH的伸缩振动特征峰,且NH3 +伸缩振动发生了轻微位移,说明HPW与氨基酸改性透明质酸发生了静电作用。
实施例2
一种胶原蛋白凝胶敷料,按质量分数计算,包括以下组分:
氨基酸改性透明质酸,0.1%;
重组人源胶原蛋白,0.05%;
磷钨酸,0.02%;
苯氧乙醇,0.2%;
三乙醇胺,0.4%;
余量为水。
重组人源III型胶原蛋白购于华北生物制药有限公司。
纳米磷钨酸购于国药集团。
实施例3
一种胶原蛋白凝胶敷料,按质量分数计算,包括以下组分:
氨基酸改性透明质酸,0.5%;
重组人源胶原蛋白,0.05%;
磷钨酸,0.02%;
苯氧乙醇,0.2%;
三乙醇胺,0.4%;
余量为水。
实施例4
一种胶原蛋白凝胶敷料,按质量分数计算,包括以下组分:
氨基酸改性透明质酸,1%;
重组人源胶原蛋白,0.05%;
磷钨酸,0.02%;
苯氧乙醇,0.2%;
三乙醇胺,0.4%;
余量为水。
实施例5
一种胶原蛋白凝胶敷料,按质量分数计算,包括以下组分:
氨基酸改性透明质酸,0.5%;
重组人源胶原蛋白,0.1%;
磷钨酸,0.02%;
苯氧乙醇,0.2%;
三乙醇胺,0.4%;
余量为水。
实施例6
一种胶原蛋白凝胶敷料,按质量分数计算,包括以下组分:
氨基酸改性透明质酸,0.5%;
重组人源胶原蛋白,0.1%;
磷钨酸,0.01%;
苯氧乙醇,0.2%;
三乙醇胺,0.3%;
余量为水。
对比例1
一种胶原蛋白凝胶敷料,按质量分数计算,包括以下组分:
透明质酸,0.5%;
重组人源胶原蛋白,0.1%;
磷钨酸,0.02%;
苯氧乙醇,0.2%;
三乙醇胺,0.4%;
余量为水。
对比例2
透明质酸钠(150~250万,购于上海阿拉丁),0.5%;
重组人源胶原蛋白,0.1%;
苯氧乙醇,0.2%;
余量为水。
上述实施例2~6敷料制备方法如下:
(1)配置重组人源胶原蛋白溶液,浓度为0.2~0.3wt%,处于35℃下保温。
(2)在水中混合氨基酸改性透明质酸、苯氧乙醇,在转速80r/min下搅拌20min后,加入磷钨酸,继续搅拌20~40min得到成膜溶液,处于35℃下保温。
(3)向第二溶液中边搅拌边加入第一溶液,此时,容器内的温度不超过35℃,加完后,在转速为60r/min,持续搅拌至混合均匀,加入三乙醇胺调节pH至6~8,搅拌时间控制在3min,得到本成品凝胶敷料。
(4)将半成品凝胶敷料在环境温度为25℃下放置2h,然后通过灌装机将其灌装入无菌储藏瓶中,最后在-20℃、电子束灭菌辐照的剂量为8kGy下,进行电子束灭菌辐照3s,完成灭菌后,即得成品的凝胶敷料。
测试例2
对实施例2~6制备的凝胶敷料进项如下测试:
(1)pH值。
(2)黏度:采用旋转黏度计测定法,四号转子,转速为3rpm。
结果如下:
表1
样品 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 |
pH | 6.32 | 6.48 | 6.55 | 6.62 | 7.08 |
黏度Pa s | 146.55 | 135.62 | 139.84 | 136.17 | 129.85 |
从表1中可知,随着氨基酸改性透明质酸的含量增大,凝胶敷料的黏度呈现先减少后增加的趋势,实施例2粘度较大是由于氨基酸改性透明质酸/杂多酸的比例小,使得交联密度过大造成的;而实施例4黏度增大是由于成膜基质太多导致凝胶黏度增长。应用在皮肤上的凝胶敷料应当具有适当的粘度以保证注射性、易铺展性和机械强度。皮肤表面的正常pH值为4.5~6.5,弱酸性条件下对伤口愈合有促进作用,由表1结果可知,实施例2~5均具有弱酸性。
测试例3
采用圆二色谱对实施例制备的凝胶敷料中的胶原蛋白进行活性分析,应用dicroprot软件对色谱图进行分析得到二级结构的信息,并通过对不同样品中重组胶原蛋白二级结构含量判断其活性,以浓度为0.5mg/mL的重组胶原蛋白的PBS溶液(7.4)作为对照组。
圆二色谱图参阅附图2。
各样品二级结构含量结果如下:
表2
样品 | α-螺旋 | β-折叠 | β-转角+无规则卷曲 |
重组胶原蛋白 | 0.71 | 0.03 | 0.26 |
实施例2 | 0.65 | 0.15 | 0.2 |
实施例3 | 0.55 | 0.22 | 0.23 |
实施例4 | 0.47 | 0.28 | 0.25 |
实施例5 | 0.57 | 0.11 | 0.32 |
实施例6 | 0.68 | 0.13 | 0.19 |
在192nm、208对应的是α-螺旋片段的构像,在195、216对应β-折叠片段的构像。在200nm有较弱负吸收峰为无规则卷曲片段;205nm 为β-转角片段的构像。胶原蛋白在变性过程中会伴随着各个构像的含量变化,未变性胶原蛋白多肽链中α-螺旋结构含量在50%以上。
从表中数据可以看出,除实施例4的敷料外α-螺旋结构含量均在50%以上,仍具有较高活性。
测试例4
粘性和机械强度测试。
通过测试凝胶薄膜与光滑玻璃片(硫酸表面处理)间粘结后的剥离力来表征薄膜的粘性。将凝胶浇注的方式在光滑玻璃片上成膜,重复多次,使得干燥凝胶(在37℃烘箱中干燥)的厚度为0.3mm左右,用拉力机测试180℃剥离薄膜所需的力,剥离速率为50mm/min。测试样品吸水后的粘性时预先将载有干燥薄膜的光滑玻璃片在37℃饱和湿度下静置12h。
拉伸性能:将干燥薄膜裁成尺寸为50 mm×10 mm的待测试样。在KJ-2091拉力试验机上观察并记录系列弹性体试样在50 mm/min的拉伸速率下的应力-应变曲线。
表3
测试例5
抑菌活性测试:以大肠杆菌作为测试菌种,菌液为用PBS缓冲溶液分别稀释到1.4×104CFU/mL(大肠杆菌)。干燥凝胶薄膜在玻璃片表面成膜后撕下,加入到75mL细菌溶液中,于恒温振荡器中振荡接触12h,然后取出适量菌液涂板培养,根据生长的菌落个数计算菌液浓度并计算抑菌率,抑菌率计算公式如下:
其中Wt是空白对照组菌液的浓度;Qt是样品与菌液接触之后菌液的浓度。
表4
样品 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 对比例1 | 对比例2 |
抑菌率,% | 97.23 | 98.02 | 98.24 | 97.88 | 94.26 | 84.34 | 48.3 |
测试例6
生物相容性测试:包括皮肤刺激性实验和细胞毒性实验。
皮肤刺激性实验:按GB/T16886.10-2005规定的方法进行检测,测试时间为48h,受试动物为新西兰兔,平均体重为2.3kg±0.3,每个样品重复6次。
细胞毒性测试:将干燥薄膜(1g)放置在紫外光下3 h以上进行消毒。然后将其浸入10mLRPMI 1640培养基中24 h,并用RPMI 1640培养基稀释至原始浓度的50%。将L929细胞(鼠非整倍体纤维肉瘤细胞)在96孔培养板上以1.0×105细胞/mL的密度用上述RPMI 1640培养基进行培养。将细胞在37℃、CO2浓度为5 %的培养箱中培养过夜。细胞培养24h后,向孔中加入5.0 mg/mL浓度的MTT(PBS溶液),再在37℃下培养4 h。随后去除培养基,加入150μL二甲基亚砜DMSO,然后剧烈震动以溶解形成的紫色甲瓒晶体。用Wellscan Mk 3酶标仪在570 nm的波长下测量吸光度。
表5
样品 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 对比例1 | 对比例2 |
皮肤刺激性评价,总积分平均分 | 0.5 | 0.17 | 0.17 | 0.17 | 0.5 | 0.5 | 0 |
细胞存活率,% | 96.45 | 98.81 | 98.63 | 99.37 | 99.52 | 99.75 | 99.86 |
测试例7
体外释放度测定:首先采用BCA法建立胶原蛋白含量标准曲线(pH7.4)。采用TPY-2透皮扩散仪进行测试,透析膜规格为1000kDa,温度为36℃,转速为300rpm。
具体做法:称取透析膜干重,然后将凝胶敷料样品均匀的涂抹在透析膜上,静置干燥后称取湿重,通过凝胶敷料组分百分比计算负载的蛋白含量,然后进行测试,隔一段时间取出1mL接收液采用BCA法测定其吸光度,通过比照标准曲线计算蛋白的释放率。
胶原蛋白释放度随时间的变化关系,参阅附图3。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种胶原蛋白凝胶敷料,其特征在于,按质量百分比计算,包括以下组分:
氨基酸改性透明质酸,0.1~1%;
重组人源胶原蛋白,0.05~0.1%;
磷钨酸,0.01~0.02%;
苯氧乙醇,0.1~0.2%;
三乙醇胺,0.02~0.04%;
余量为水;
所述氨基酸改性透明质酸由透明质酸在碱性条件下与氨基酸环氧化合物加热搅拌反应得到;制备所述氨基酸改性透明质酸的方法为;透明质酸溶于异丙醇溶液中,并加入20%的NaOH溶液,然后放入室温的水浴锅中磁力搅拌2h,加入氨基酸环氧单体搅拌均匀,调节pH=8,50~80℃下继续搅拌6~10h,反应结束后将得到的溶液倒入HCl质量浓度为20%的甲醇溶液中沉淀析出,抽滤得到沉淀物,用乙醇洗涤沉淀物并过滤,减压下干燥得到氨基酸改性透明质酸;
透明质酸购于上海麦克林,分子量为10~20万;
透明质酸、异丙醇、氨基酸改性透明质酸的用量的重量比为100:500:55;
所述氨基酸环氧化合物具有如下式I结构:
3.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白凝胶敷料的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)配置重组人源胶原蛋白溶液,浓度为0.2~0.3wt%,处于35℃下保温;
(2)在水中混合氨基酸改性透明质酸、苯氧乙醇,在转速80r/min下搅拌20min后,加入磷钨酸,继续搅拌20~40min得到成膜溶液,处于35℃下保温;
(3)向第二溶液中边搅拌边加入第一溶液,此时,容器内的温度不超过35℃,加完后,在转速为60r/min,持续搅拌至混合均匀,加入三乙醇胺调节pH至6~8,继续搅拌3min,得到本成品凝胶敷料;
(4)将半成品凝胶敷料在环境温度为25℃下放置2h,然后通过灌装机将其灌装入无菌储藏瓶中,最后在-20℃、电子束灭菌辐照的剂量为8kGy下,进行电子束灭菌辐照3s,完成灭菌后,即得成品的凝胶敷料。
4.根据权利要求1所述的一种胶原蛋白凝胶敷料的应用,其特征在于,所述胶原蛋白凝胶敷料采用喷雾或涂抹的方式应用于人体伤口表面。
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