CN111394392B - 一种脂肪细胞靶向阳离子基因载体、其制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种高效脂肪细胞靶向阳离子基因载体及其制备方法和应用，载体包括线性聚α‑赖氨酸、接枝在所述线性聚α‑赖氨酸上的脂肪细胞靶向肽和对甲苯磺酰基保护的精氨酸；线性聚α‑赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:10～100；所述线性聚α‑赖氨酸与脂肪细胞靶向肽的摩尔比为1:1～30。上述载体具有较高转染效率和较低细胞毒性。ATS‑PLL‑RT阳离子载体在基因载体设计和抗肥胖症领域具有广泛的应用前景。ATS‑PLL‑RT基因载体在前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞中的最佳转染效率是阳离子基因载体黄金标准“PEI25k”的最佳转染效率的十多倍，且在最佳转染效率的比例时细胞存活率均在90％以上。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，尤其涉及一种脂肪靶向阳离子基因载体、其制备方法及其应用。
背景技术
肥胖是由于脂肪在体内过度积累所致的一种疾病状态。近年来，由于饮食结构和生活方式的改变，肥胖的发病率在世界范围内急剧上升。[参见Rosen ED,SpiegelmanBM.Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis,Nature.2006,444:847-853.]。肥胖能够引发胰岛素抵抗、高血糖、高血压、高血脂等一系列代谢综合征，成为导致II型糖尿病以及心血管疾病发病的重要独立风险因素。因此，肥胖已成为危害人类健康并亟待解决的重要公共问题。然而，大部分市售的减肥药效果甚微，且伴随着出现中风和心脏病等疾病发生。[参见Cooke D,Bloom S.The obesity pipeline:current strategies in the development of anti-obesity drugs,Nature ReviewsDrug Discovery.2006,5:919-931.]。因此，寻找高效安全的减肥方法已成为医学上重要的研究课题。
随着对肥胖发生发展分子机制认识的不断深入，科研人员发现肥胖患者脂肪细胞内许多基因的表达过度或受抑制。因此脂肪细胞的基因治疗已经成为攻克和治愈肥胖最具有希望和挑战的研究领域。[参见Matharu N,Rattanasopha S,Tamura S,Maliskova L,Wang Y,Bernard A,Hardin A,Eckalbar WL,Vaisse C,Ahituv N.CRISPR-mediatedactivation of a promoter or enhancer rescues obesity caused byhaploinsufficiency,Science.2019,363:eaau0629.]。肥胖的基因治疗指将具有正常功能的基因或者治疗作用的基因通过特定的方式导入脂肪细胞，从而达到肥胖治疗的目的。由于载体的局限性使得目前对肥胖的基因治疗无法完美实现。因此，研究和开发新型的基因载体是众多研究人员及临床医生关注的热点。
目前，氨基酸改性基因载体越来越引起人们的关注，氨基酸是组成生物蛋白质的基本组成单位，安全性好，可生物降解，是一类具有广阔应用前景的新型生物医用材料。[参见Tian HY,Tang ZH,Zhuang XL,Chen XS,Jing XB.Biodegradable synthetic polymers:preparation,functionalization and biomedical application,Progress in PolymerScience.2012,37:237-280.]。此外，具有脂肪细胞靶向的多肽材料已成为如今基因载体研究的重要方向。[参见Won YW,Adhikary PP,Lim KS,Kim HJ,Kim JK,Kim YH.Oligopeptidecomplex for targeted non-viral gene delivery to adipocytes,NatureMaterials.2014,13:1157-1164.]。因此，开发适合脂肪细胞靶向基因载体体系意义重大，它可针对高脂饮食导致的肥胖进行精准治疗，有望成为临床基因治疗肥胖的新策略。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种脂肪靶向阳离子基因载体、其制备方法及其应用，该基因载体转染效率较高。
本发明提供了一种脂肪细胞靶向阳离子基因载体，包括线性聚α-赖氨酸、接枝在所述线性聚α-赖氨酸上的脂肪细胞靶向肽和对甲苯磺酰基保护的精氨酸；
所述线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(10～100)；
所述线性聚α-赖氨酸与脂肪细胞靶向肽的摩尔比为1:(1～30)。
优选地，所述线性聚α-赖氨酸的数均分子量为3000～30000。
优选地，所述脂肪细胞靶向肽是一个多肽分子ATS-SH，其序列为GKGGEAKDGGC。
本发明提供了一种上述技术方案所述高效脂肪细胞靶向阳离子基因载体的制备方法，包括以下步骤：
a)将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸进行活化，再加入线性聚-α-赖氨酸的水溶液进行反应；所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的摩尔比为1：(10～100)；
b)将所述步骤a)反应后的溶液透析、冻干，得到冻干产物；
c)将所述冻干产物与三氟乙酸反应，沉降产物，真空抽干、透析和冻干后，得到阳离子聚合物PLL-RT；
d)将所述阳离子聚合物PLL-RT溶解在水中，搅拌，加入BMPS溶液反应；
e)再加入脂肪细胞靶向肽水溶液进行反应，所述聚α-赖氨酸与脂肪细胞靶向肽的摩尔比为1:(1～30)；
f)将所述步骤e)的反应产物透析、冻干，得到脂肪细胞靶向阳离子基因载体。
优选地，所述步骤a)中反应温度为20～37℃，反应的时间为24～96小时。
优选地，所述步骤a)中对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸以溶液的形式进行活化；
对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液中的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；
所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液的浓度为0.02～0.5mg/mL。
优选地，所述步骤b)中透析的时间为2～5天；冻干的温度为-30℃～-80℃；
所述步骤f)中透析的时间为2～5天，冻干的温度为-30～-80℃。
优选地，所述步骤c)中反应的时间为0.5～24h；
所述步骤d)中反应的温度为15～37℃，反应的时间为0.5～24小时。
优选地，所述步骤e)反应的温度为15～37℃，反应的时间为12～72h。
本发明提供了一种脂肪细胞靶向基因载体复合物颗粒，包括上述技术方案所述的脂肪细胞靶向阳离子基因载体和质粒DNA；
所述脂肪细胞靶向阳离子基因载体和质粒DNA的质量比为10～1：1。
本发明提供了一种脂肪细胞靶向阳离子基因载体，包括线性聚α-赖氨酸、接枝在所述线性聚α-赖氨酸上的脂肪细胞靶向肽和对甲苯磺酰基保护的精氨酸；所述线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(10～100)；所述线性聚α-赖氨酸与脂肪细胞靶向肽的摩尔比为1:(1～30)。本发明提供的上述脂肪细胞靶向阳离子基因载体具有较高的转染效率。还具有较低的细胞毒性。制备的ATS-PLL-RT阳离子载体在基因载体设计和抗肥胖症领域具有广泛的应用前景。实验结果表明：ATS-PLL-RT基因载体在前体脂肪细胞和成熟脂肪细胞中的最佳转染效率是阳离子基因载体黄金标准“PEI25k”的最佳转染效率的十多倍，且在最佳转染效率的比例时细胞存活率均在90％以上。
具体实施方式
本发明提供了一种脂肪细胞靶向阳离子基因载体，包括线性聚α-赖氨酸、接枝在所述线性聚α-赖氨酸上的脂肪细胞靶向肽和对甲苯磺酰基保护的精氨酸；
所述线性聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(10～100)；
所述线性聚α-赖氨酸与脂肪细胞靶向肽的摩尔比为1:(1～30)。
本发明提供的脂肪细胞靶向阳离子基因载体包括线性聚α-赖氨酸；所述线性聚α-赖氨酸的数均分子量优选为3000～30000，更优选10000～20000；在具体实施例中，线性聚α-赖氨酸的数均分子量为15000Da。
本发明提供的脂肪细胞靶向阳离子基因载体包括接枝在所述线性聚α-赖氨酸上的脂肪细胞靶向肽和对甲苯磺酰基保护的精氨酸；所述聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1：(10～100)，优选为1：(40～80)，更优选为1:(50～70)；具体实施例中，所述聚α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1：90。
所述线性聚α-赖氨酸与脂肪细胞靶向肽的摩尔比为1:(1～30)，优选为1：5～20，更优选为1：5～15；具体实施例中，所述线性聚α-赖氨酸与脂肪细胞靶向肽的摩尔比为1：3、1：5或1：10。所述脂肪细胞靶向肽优选是一个多肽分子ATS-SH，其序列为GKGGEAKDGGC。所述ATS-SH可以购买，也可以根据现有的技术自行合成。本发明优选参考文献Won YW,AdhikaryPP,Lim KS,KimHJ,Kim JK,Kim YH.Oligopeptide complex for targeted non-viralgene delivery to adipocytes,Nature Materials.2014,13:1157-1164中报道的靶向肽序列购自多肽合成公司。
本发明提供了一种上述技术方案所述脂肪细胞靶向阳离子基因载体的制备方法，包括以下步骤：
a)将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸进行活化，再加入线性聚-α-赖氨酸的水溶液进行反应；所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的摩尔比为1：(10～100)；
b)将所述步骤a)反应后的溶液透析、冻干，得到冻干产物；
c)将所述冻干产物与三氟乙酸反应，沉降产物，真空抽干、透析和冻干后，得到阳离子聚合物PLL-RT；
d)将所述阳离子聚合物PLL-RT溶解在水中，搅拌，加入BMPS溶液反应；
e)再加入脂肪细胞靶向肽水溶液进行反应，所述聚α-赖氨酸与脂肪细胞靶向肽的摩尔比为1:(1～30)；
f)将所述步骤e)的反应产物透析、冻干，得到脂肪细胞靶向阳离子基因载体。
本发明将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸进行活化，再加入线性聚-α-赖氨酸的水溶液进行反应；所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的摩尔比为1：(10～100)。
本发明优选将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸以溶液的形式进行活化；对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液中的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液的浓度为0.02～0.5mg/mL。本发明优选采用EDC·HCl和HOBT进行活化；所述活化的温度为室温；所述活化的时间为1h。本发明将线性聚-α-赖氨酸的水溶液缓慢加入到活化后的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸中。在本发明中，所述线性聚-α-赖氨酸水溶液的浓度为0.05～0.5mg/mL，更优选为0.06～0.5mg/mL，最优选为0.08～0.2mg/mL。在本发明中，活化的对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸和所述线性聚-α-赖氨酸的水溶液进行反应的温度优选为20～37℃，优选为22～34℃，更优选为25～30℃；反应的时间为24～96小时，优选为48～84小时，更优选为68～72小时。
本发明将所述步骤a)反应后的溶液透析、冻干，得到冻干产物。本发明优选采用透析袋进行透析；具体实施例中，所述透析袋的分子量为3500，适用于均分子量为15000的线性聚-α-赖氨酸。本发明优选每隔6h换一次透析水，所述透析的时间2～5天，更优选为48～96h，最优选为70～75h。本发明优选采用冷冻干燥机进行冻干；所述冻干的温度优选为-30℃～-80℃，更优选为-50～-80℃，最优选为-60～-70℃。
本发明将所述冻干产物与三氟乙酸反应，沉降产物，真空抽干、透析和冻干后，得到阳离子聚合物PLL-RT。所述冻干产物与三氟乙酸反应的时间为0.5～24h，更优选为2～12h，最优选为4～5h。本发明优选采用乙醚进行沉降产物。所述透析和冻干的范围与上述范围一致，在此不再赘述。
本发明将所述阳离子聚合物PLL-RT溶解在水中，搅拌，加入BMPS(N-β-maleimidopropyl-oxysuccinimide ester)溶液反应。在本发明中，所述BMPS溶液中的溶剂优选为DMSO。所述阳离子聚合物PLL-RT溶解在水中得到的PLL-RT水溶液的浓度优选为0.5～10mg/mL，更优选为1～5mg/mL；BMPS的浓度优选为1～20mg/mL，更优选为2～10mg/mL；BMPS的物质的量优选为PLL-RT的0.5～10倍，更优选为1～5倍。PLL-RT和BMPS反应的温度优选为15～37℃，更优选为20～30℃，更优选为23～25℃；反应的时间为0.5～24h，优选为1～12h，更优选为2～3h。
再加入脂肪细胞靶向肽水溶液进行反应，所述聚α-赖氨酸与脂肪细胞靶向肽的摩尔比为1:(1～30)。在本发明中，加入脂肪细胞靶向肽水溶液进行反应的温度优选为15～37℃，反应的时间优选为12～72h。具体实施例中，所述聚α-赖氨酸与脂肪细胞靶向肽的摩尔比为1:3、1：5或1：10。
本发明将所述步骤e)的反应产物透析、冻干，得到脂肪细胞靶向阳离子基因载体。在本发明中，所述透析的时间为2～5天，冻干的温度为-30～-80℃。
本发明提供了一种脂肪细胞靶向基因载体复合物颗粒，包括上述技术方案所述的脂肪细胞靶向阳离子基因载体和质粒DNA；
所述脂肪细胞靶向阳离子基因载体和质粒DNA的质量比为10～1：1。
在本发明中，所述脂肪细胞靶向基因载体复合物颗粒优选按照以下方法制得：
将脂肪细胞靶向阳离子基因载体ATS-PLL-RT和荧光素酶表达质粒pGL3-Control分别溶于水中，得到水溶液，再与质粒DNA复合，孵育，得到脂肪细胞靶向基因载体复合物颗粒。
在本发明具体实施例中，脂肪细胞靶向阳离子基因载体ATS-PLL-RT溶液的浓度为1mg/mL，荧光素酶表达质粒pGL3-Control水溶液的浓度为0.5mg/mL。脂肪细胞靶向阳离子基因载体与质粒DNA的质量比具体为10：1、8:1、6:1、4:1、2:1和1:1。
所述孵育的温度为室温；孵育的时间为18～23min。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种脂肪细胞靶向阳离子基因载体、其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
将线性聚-α-赖氨酸(分子量15000Da)溶解于去离子水中，对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶解于DMF中。然后，加入EDC·HCl和HOBT，室温下活化反应1小时，再缓慢加入PLL的水溶液，室温反应72小时。透析和冻干后，将产物在三氟乙酸的条件下反应4小时，加无水乙醚沉降，真空抽干，透析，冻干得到白色固体产物PLL-RT。
聚-α-赖氨酸接枝对甲苯磺酰基保护的精氨酸(Arg(Tos))的接枝摩尔比为1:90。
实施例2脂肪细胞靶向阳离子基因载体ATS-PLL-RT的制备
将100mg的PLL-RT溶解在去离子水中，搅拌30分钟；BMPS(N-β-maleimidopropyl-oxysuccinimide ester)溶解在DMSO中；再将不同量的BMPS的DMSO溶液加入到PLL-RT溶液中，室温反应2小时。再将ATS-SH水溶液加入到上述溶液，室温下继续反应24小时，透析和冻干后得到脂肪细胞靶向阳离子基因载体Man-PLL-RT。
PLL-RT对ATS-SH靶向分子的接枝摩尔比分别为1:3、1:5和1:10。
实施例3脂肪细胞靶向基因载体复合物颗粒的制备
将脂肪细胞靶向阳离子基因载体ATS-PLL-RT和荧光素酶表达质粒pGL3-Control分别溶于去离子水中，形成水溶液，初始浓度分别为1mg/mL和0.5mg/mL。再将载体与质粒DNA复合，复合比例为载体：质粒DNA的质量比为10:1、8:1、6:1、4:1、2:1和1:1，其中质粒DNA的终浓度为0.01mg/mL。涡旋30s混匀后，室温下孵育20分钟，得到脂肪细胞靶向阳离子基因载体复合物颗粒。
实施例4基因载体复合物颗粒的表征
对上述载体：质粒DNA的质量比为2：1的复合物颗粒进行粒径和电位测试，结果参见表1。
表1实施例3的电位粒径测试结果
| 样品 | 平均直径(nm) | 电位(mV) |
| pGL3-Control | - | -11.8 |
| PLL-RT/pGL3-Control | 127.3 | 12.3 |
| ATS-PLL-RT/pGL3-Control | 118.2 | 14.8 |
注：-表示未得到有效数据。
由以上测试结果可知，脂肪细胞靶向阳离子基因载体ATS-PLL-RT能够和质粒DNA通过静电复合作用形成带正电的纳米颗粒，这有利于细胞对纳米颗粒的内吞作用。
实施例5基因载体复合物颗粒在脂肪前体细胞内的转染性能研究
(1)3T3-L1细胞的培养
将3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞(前脂肪细胞)培养在含10％体积分数的胎牛血清DMEM培养基中，细胞在设定温度为37℃、体积分数为5％的CO2的恒温培养箱中培养。
(2)细胞转染
在转染前24h，取对数生长期的3T3-L1细胞，质量分数为0.25％的胰酶消化后用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养液稀释，按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中，置于培养温度为37℃、体积分数5％的CO2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达80～90％。转染时，配置不同质量比的载体/pGL3-Control复合物，室温孵育20min，更换新的DMEM培养基后，按照0.2μg质粒DNA/孔的用量加入到96孔细胞板中，继续培养48小时。
(3)细胞转染效率的测定
从培养箱中取出96孔细胞培养板，移除细胞培养液，用PBS洗涤2次，每孔加入50μL细胞裂解液后放入-80℃中冷冻1小时。充分吹匀后，每孔取出25μL细胞裂解物至1.5mL离心管中，然后每孔加入100μL的荧光素酶底物，通过光度计定量测定细胞转染效率。再用BCA蛋白定量的方法对裂解物内总蛋白量进行检测。基因载体的转染效率可表示为：转染效率＝荧光素酶表达量/mg蛋白。表2给出了不同基因载体材料的转染效率：
表2不同基因载体介导荧光素酶质粒在3T3-L1细胞中转染效率
| 不同载体材料 | 转染效率，LUC/mg蛋白 | 载体与DNA的质量比 |
| PEI25k | 1.5×10<sup>4</sup> | 4:1 |
| PEI25k | 5.8×10<sup>4</sup> | 2:1 |
| PEI25k | 9.6×10<sup>3</sup> | 1:1 |
| PLL-RT | 3.4×10<sup>6</sup> | 4:1 |
| PLL-RT | 4.8×10<sup>6</sup> | 2:1 |
| PLL-RT | 1.5×10<sup>6</sup> | 1:1 |
| ATS-PLL-RT | 9.4×10<sup>6</sup> | 4:1 |
| ATS-PLL-RT | 1.2×10<sup>7</sup> | 2:1 |
| ATS-PLL-RT | 7.9×10<sup>6</sup> | 1:1 |
结果表明，本发明的脂肪细胞靶向阳离子基因载体材料担载质粒DNA后，在脂肪前体细胞中显示出最佳的基因转染效率，比商品化的PEI25k高出2个数量级，是非靶向载体材料转染效率的2.5倍。
实施例6基因载体复合物颗粒在成熟脂肪细胞内的转染性能研究
(1)成熟脂肪细胞的诱导培养
1)配置100mL脂肪细胞分化培养液，其配方如表3所示：
表3脂肪细胞分化培养液的配制
| 试剂 | 试剂浓度 | 加入体积 | 终浓度 |
| Dexamethasone | 1mM | 100μL | 1μM |
| IBMX | 50mM | 1mL | 0.5mM |
| Insulin | 10mg/ml | 100μL | 10μg/ml |
| DMEM(10％FBS) | - | 98.8mL | - |
2)配制100mL成熟脂肪细胞培养液，其配方如表4所示：
表4成熟脂肪细胞培养液的配制
| 试剂 | 试剂浓度 | 加入体积 | 终浓度 |
| Insulin | 10mg/ml | 100μL | 10μg/ml |
| DMEM(10％FBS) | - | 99.9mL | - |
3)成熟脂肪细胞诱导方法如表5所示：
表5成熟脂肪细胞诱导方法
注：脂肪细胞的分化和成熟培养时需要每两天进行半数换液；
(2)成熟脂肪细胞的转染实验
加入复合物颗粒前，对成熟脂肪细胞进行换液(成熟脂肪细胞培养液)。然后配置不同质量比(4:1，2:1和1:1)的载体/pGL3-Control复合物，室温孵育20min，按照0.5μg质粒DNA/孔的用量加入到24孔细胞板中，继续培养48小时。
(3)细胞转染效率的测定
从培养箱中取出24孔细胞培养板，移除细胞培养液，用PBS轻轻洗涤2次，每孔加入100μL细胞裂解液后放入-80℃中冷冻1小时。充分吹匀后，每孔取出25μL细胞裂解物至1.5mL离心管中，然后每孔加入100μL的荧光素酶底物，通过光度计定量测定细胞转染效率。再用BCA蛋白定量的方法对裂解物内总蛋白量进行检测。基因载体的转染效率可表示为：转染效率＝荧光素酶表达量/mg蛋白。表6给出了不同基因载体材料的最优转染效率。
表6不同基因载体介导荧光素酶质粒在成熟脂肪细胞中转染效率
| 不同载体材料 | 转染效率，LUC/mg蛋白 | 载体与DNA的质量比 |
| PEI25k | 6.1×10<sup>5</sup> | 4:1 |
| PEI25k | 1.3×10<sup>6</sup> | 2:1 |
| PEI25k | 9.5×10<sup>5</sup> | 1:1 |
| PLL-RT | 1.1×10<sup>5</sup> | 4:1 |
| PLL-RT | 1.5×10<sup>5</sup> | 2:1 |
| PLL-RT | 9.3×10<sup>4</sup> | 1:1 |
| ATS-PLL-RT | 1.5×10<sup>7</sup> | 4:1 |
| ATS-PLL-RT | 1.8×10<sup>7</sup> | 2:1 |
| ATS-PLL-RT | 8.9×10<sup>6</sup> | 1:1 |
结果表明，本发明的脂肪细胞靶向阳离子基因载体材料ATS-PLL-RT担载质粒DNA后，在成熟脂肪细胞中显示出最佳的基因转染效率，是商品化的PEI25k的10多倍。
实施例7基因载体复合物颗粒的细胞毒性实验
(1)脂肪前体细胞和成熟脂肪细胞的培养
细胞培养方法同实施例5和6。
(2)基因载体复合物与细胞共培养
将培养好的脂肪细胞进行消化并计数，按照5×103细胞/孔的密度种在96孔板中，放入细胞培养箱中过夜培养。按照实施例5和6的最佳转染比例(质量比为2:1)配置载体/DNA复合物(DNA的终浓度为0.02mg/mL)，加入96孔板中，继续培养48h。
(3)细胞存活率的检测
基因载体复合物颗粒与细胞共孵育48h后，96孔板每孔加入20μL的MTT溶液(5mg/mL，pH7.4，PBS缓冲液)，培养箱中继续培养4h。轻轻吸掉培养基后，每孔加入150μL的DMSO溶液。在490nm震荡5min检测吸光值。未加材料组作为对照组，看作细胞存活率100％。计算各实验组的细胞毒性，实验结果如表7所示：
表7基因载体复合物的细胞存活率实验
| 基因载体复合物 | 脂肪前体细胞(％) | 成熟脂肪细胞(％) |
| PEI25k/pDNA | 78.5 | 75.4 |
| PLL-RT/pDNA | 93.5 | 91.0 |
| ATS-PLL-RT/pDNA | 93.8 | 92.8 |
实验结果表明，相比商品化的基因载体材料PEI25k组，脂肪细胞靶向基因载体组细胞存活率更高，达到90％以上，进一步验证了，本申请所制备的基因载体材料不仅具有优异的基因转染性能，且对细胞的生长状态没有影响。
由以上实施例的测试结果可知，本发明提供的脂肪细胞靶向阳离子基因载体能够有效担载质粒DNA。与商品化的转染试剂PEI25k相比，具有更高的转染效率且无明显细胞毒性，在肥胖基因治疗领域具有光明的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种脂肪细胞靶向阳离子基因载体，包括线性聚-α-赖氨酸、接枝在所述线性聚-α-赖氨酸上的脂肪细胞靶向肽和对甲苯磺酰基保护的精氨酸；
所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基保护的精氨酸的摩尔比为1:(10～100)；
所述线性聚-α-赖氨酸与脂肪细胞靶向肽的摩尔比为1:(1～30)；
所述线性聚-α-赖氨酸的数均分子量为3000～30000Da；
所述脂肪细胞靶向肽是一个多肽分子ATS-SH，ATS的氨基酸序列为GKGGEAKDGGC。
2.一种权利要求1所述脂肪细胞靶向阳离子基因载体的制备方法，包括以下步骤：
a)将对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸进行活化，再加入线性聚-α-赖氨酸的水溶液进行反应；所述线性聚-α-赖氨酸与对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸的摩尔比为1：(10～100)；
b)将所述步骤a)反应后的溶液透析、冻干，得到冻干产物；
c)将所述冻干产物与三氟乙酸反应，沉降产物，真空抽干、透析和冻干后，得到阳离子聚合物；
d)将所述阳离子聚合物溶解在水中，搅拌，加入BMPS溶液反应；
e)再加入脂肪细胞靶向肽水溶液进行反应，所述聚-α-赖氨酸与脂肪细胞靶向肽的摩尔比为1:(1～30)；
f)将所述步骤e)的反应产物透析、冻干，得到脂肪细胞靶向阳离子基因载体。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中反应温度为20～37℃，反应的时间为24～96小时。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸以溶液的形式进行活化；
对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液中的溶剂为N,N-二甲基甲酰胺；
所述对甲苯磺酰基和叔丁氧羰基双保护的精氨酸溶液的浓度为0.02～0.5mg/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤b)中透析的时间为2～5天；冻干的温度为-30℃～-80℃；
所述步骤f)中透析的时间为2～5天，冻干的温度为-30～-80℃。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤c)中反应的时间为0.5～24h；
所述步骤d)中反应的温度为15～37℃，反应的时间为0.5～24小时。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤e)反应的温度为15～37℃，反应的时间为12～72h。
8.一种脂肪细胞靶向基因载体复合物颗粒，包括权利要求1～7任一项所述的脂肪细胞靶向阳离子基因载体和质粒DNA；
所述脂肪细胞靶向阳离子基因载体和质粒DNA的质量比为10～1：1。
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