CN113101376A - 一种可用于基因治疗的复合基因载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种可用于基因治疗的聚合物基因载体及其制备方法和应用，聚合物基因载体包括苯硼酸分子修饰的超支化聚乙烯亚胺和聚谷氨酸；所述PEI与PBA的摩尔比为1:(2～20)；所述PEI‑PBA与PLG的摩尔比为1:(0.3～3)。本发明提供的聚合物基因载体转染效率高，在HeLa细胞中的最佳转染效率比阳离子基因载体黄金标准“PEI25k”的最佳转染效率高将近两个数量级，且在最佳转染效率的比例时细胞存活率均在90％以上，细胞毒性低，具有较高的基因编辑效率。制备的PEI‑PBA阳离子聚合物载体在基因载体设计和基因治疗领域具有广泛的应用前景。

Description

一种可用于基因治疗的复合基因载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，尤其涉及一种可用于基因治疗的复合基因载体及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，分子靶向疗法和免疫疗法极大地丰富了临床对抗癌症的策略，然而，大多数抗癌疗法需要重复给药，且具有高复发率和耐药性，这增加了治疗相关的毒性和治疗成本，并严重降低了患者的生活质量。[参见J.Foo,F.Michor.Evolution of acquiredresistance to anti-cancer therapy,Journal of Theoretical Biology.2014,355:10–20.]。以CRISPR-Cas9基因编辑技术所代表的基因疗法具有永久破坏肿瘤生存基因的潜力，它可以克服传统癌症疗法的重复剂量限制，提高治疗效果并需要较少次数的治疗。[参见P.D.Hsu,E.S.Lander.Development and applications of CRISPR-Cas9for genomeengineering,Cell.2014,157:1262–1278.]。因此，通过肿瘤基因疗法实现抑制肿瘤生长的新策略成为最具有希望和挑战的研究领域。
大多数关于基因编辑的研究都依赖于腺相关病毒(AAV)，然而，AAV的应用受到其携带能力小，具有潜在的免疫原性，高剂量时的肝毒性和缺乏细胞靶向性的限制。[参见H.Yin,W.Xue.Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a diseasemutationand phenotype,Nature Biotechnology.2014,32:551–553.]。近年来，使用非病毒递送系统递送CRISPR-Cas9基因编辑系统已经取得了较大进展，但Cas9(160kDa，4300碱基)和sgRNA(～31kDa，130碱基)的大尺寸以及较低的递送和基因编辑效率依然是限制将基因编辑技术推向临床的重大障碍。[参见Q.Cheng,T.Wei.Selective organtargeting(SORT)nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR–Cas geneediting,Nature Nanotechnology.2020,15:313–320.]。聚合物基因载体除了具有传输大尺寸质粒DNA的潜在优势，还具有抵抗血清诱导的质粒DNA的聚集以及针对特定组织或器官的靶向性能，可实现有效的核酸封装，细胞递送和内体释放，是递送基因编辑系统优异的备选材料。[参见L.M.Zhang,P.Wang.Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery ofCRISPR/Cas9 for tumor therapy,NPG Asia Materials.2017,9,e441.]。因此，研究和开发高性能聚合物基因载体用于基因编辑等基因治疗系统的递送是众多研究人员关注的热点。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种可用于基因治疗的复合基因载体及其制备方法和应用，该聚合物基因载体转染效率高。
本发明提供了一种可用于基因治疗的复合基因载体，其特征在于，包括苯硼酸分子修饰的超支化聚乙烯亚胺；
和聚谷氨酸；
所述苯硼酸分子修饰的超支化聚乙烯亚胺与聚谷氨酸的摩尔比为1:(0.3～3)；
所述苯硼酸分子修饰的超支化聚乙烯亚胺中超支化聚乙烯亚胺和苯硼酸的摩尔比为1:(2～20)。
在本发明中，所述苯硼酸分子修饰的超支化聚乙烯亚胺与聚谷氨酸的摩尔比为1:0.7。所述苯硼酸分子修饰的超支化聚乙烯亚胺中超支化聚乙烯亚胺和苯硼酸的摩尔比为1:5。所述超支化聚乙烯亚胺的分子量为25000。
超支化聚乙烯亚胺的分子量为10000～80000；
所述聚谷氨酸的聚合度为10～70。具体实施例中，所述聚谷氨酸的聚合度为15～50。
本发明提供了一种上述技术方案所述复合基因载体的制备方法，包括以下步骤：
将苯硼酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺分别溶于二甲基甲酰胺中，室温搅拌1～4h，加入超支化聚乙烯亚胺水溶液，反应，得到的反应产物透析，冻干，得到阳离子聚合物PEI-PBA；
将所述阳离子聚合物PEI-PBA和聚谷氨酸复合，得到复合基因载体。
在本发明中，所述反应的时间为48～96h，优选为65～85h，更优选为72h。
在本发明中，所述透析的时间为2～4天；
所述冻干的温度为-30～-80℃。
在本发明中，所述阳离子聚合物PEI-PBA和聚谷氨酸复合的温度为室温；时间优选为13～16min，更优选为15min。
在本发明中，所述苯硼酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺分别溶于二甲基甲酰胺后的浓度均为5～30mg/mL；
所述超支化聚乙烯亚胺水溶液的浓度为10～100mg/mL。
本发明提供了一种可用于基因编辑的复合物纳米颗粒，由上述技术方案所述复合基因载体或上述技术方案所述制备方法制备的复合基因载体和质粒DNA复合制得。
复合基因载体和质粒DNA复合的温度为室温；时间为13～16min，更优选为15min。
在本发明中，所述复合基因载体和质粒DNA的质量比为10～1:1；具体实施例中，所述复合基因载体和质粒DNA的质粒比为10:1、5:1、2.5:1和1:1。
本发明提供了一种可用于基因治疗的聚合物基因载体，包括苯硼酸分子修饰的超支化聚乙烯亚胺和聚谷氨酸；所述PEI与PBA的摩尔比为1:(2～20)；所述PEI-PBA与PLG的摩尔比为1:(0.3～3)。本发明提供的聚合物基因载体转染效率高，在HeLa细胞中的最佳转染效率比阳离子基因载体黄金标准“PEI25k”的最佳转染效率高将近两个数量级，且在最佳转染效率的比例时细胞存活率均在90％以上，细胞毒性低，具有较高的基因编辑效率。制备的PEI-PBA阳离子聚合物载体在基因载体设计和基因治疗领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例5中PEI-PBA/PLG体外敲除GFP基因性能的研究结果。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种可用于基因治疗的复合基因载体及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1PEI-PBA的制备
取一定量PBA，EDC·HCl和NHS分别溶于DMF中(浓度均为20mg/mL)，将其依次滴加至圆底烧瓶中，室温下活化反应1小时。然后，缓慢加入配制好的PEI25k水溶液(浓度为50mg/mL)，室温搅拌反应72h，期间若有沉淀析出，应补充少量水，使其继续进行反应。反应完成后，进行透析72h和-80℃下冻干，得到白色固体产物PEI-PBA。
所述超支化聚乙烯亚胺和苯硼酸分子的接枝摩尔比为1:5。
当作为用于基因编辑的聚合物基因载体使用时，将PEI-PBA与PLG和质粒DNA复合，以便实现高效的基因传输。
PEI25k-PBA与PLG的摩尔比为1:0.7。
实施例2可用于基因编辑复合物纳米颗粒的制备
将阳离子聚合物基因载体PEI-PBA和PLG分别溶于去离子水中，形成水溶液，初始浓度均为1mg/mL。将一体化绿色荧光蛋白(GFP)基因敲除质粒配制成0.1mg/mL的水溶液备用。先将PEI-PBA与PLG复合，涡旋30s混匀后，室温下孵育15min，再将载体与质粒DNA复合，涡旋30s混匀后，室温下孵育15min，得到可用于敲除GFP的聚合物基因载体复合物纳米颗粒。复合比例为载体：质粒DNA的质量比为10:1、5:1、2.5:1和1:1，其中质粒DNA的终浓度为1ng/μL。
实施例3基因载体复合物纳米颗粒的表征
对不同基因载体复合物颗粒进行粒径和电位测试，结果参见表1。
表1实施例2的电位粒径测试结果
样品 平均粒径(nm) 电位(mV)
PEI/pDNA 206.1 24.3
PEI-PBA/pDNA 217.5 24.6
PEI-PBA/PLG/pDNA 271.1 14.0
由以上测试结果可知，该聚合物基因载体PEI-PBA在与PLG复合后能够和质粒DNA通过静电复合作用形成带正电的纳米颗粒，这有利于细胞对纳米颗粒的内吞作用。
实施例4基因载体复合物纳米颗粒在HeLa细胞内的转染性能研究
(1)HeLa细胞的培养
将HeLa培养在含10％体积分数的新生牛血清的DMEM培养基中，细胞在设定温度为37℃、体积分数为5％的CO2的恒温培养箱中培养。
(2)细胞转染
在转染前24h，取对数生长期的HeLa细胞，用质量分数为0.25％的胰酶消化后用含体积分数10％新生牛血清的DMEM培养液稀释，按照1×104细胞/孔的密度铺板于96孔细胞培养板中，置于培养温度为37℃、体积分数5％的CO2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达70～80％。转染时，配置不同质量比的载体/质粒DNA复合物，在更换新的DMEM培养基后，按照0.2μg质粒DNA/孔的用量加入到96孔细胞板中，继续培养48小时。
(3)细胞转染效率的测定
从培养箱中取出96孔细胞培养板，移除细胞培养液，用PBS洗涤2次，每孔加入50μL细胞裂解液后放入-80℃中冷冻1小时。充分吹匀后，每孔取出25μL细胞裂解物至1.5mL离心管中，然后每孔加入100μL的荧光素酶底物，通过光度计定量测定细胞转染效率。再用BCA蛋白定量的方法对裂解物内总蛋白量进行检测。基因载体的转染效率可表示为：转染效率＝荧光素酶表达量/mg蛋白。表2给出了不同基因载体材料的最优转染效率。
表2不同基因载体介导荧光素酶质粒在HeLa细胞中转染效率
不同载体材料 转染效率，LUC/mg蛋白 载体与DNA的质量比
PEI25k 1.59×10<sup>6</sup> 2.5:1
PEI-PBA 1.69×10<sup>6</sup> 2.5:1
PEI-PBA/PLG 1.08×10<sup>8</sup> 5:1
结果表明，本发明的聚合物基因载体担载质粒DNA后，在HeLa细胞中显示出最佳的基因转染效率，比商品化的PEI25k将近高出2个数量级。
实施例5基因载体复合物纳米颗粒用于敲除GFP性能研究
(1)HeLa-GFP细胞(恒表达绿色荧光蛋白的HeLa细胞)的培养
将HeLa-GFP培养在含10％体积分数的新生牛血清的DMEM培养基中，细胞在设定温度为37℃、体积分数为5％的CO2的恒温培养箱中培养。
(2)基因敲除实验
在加入敲除材料前24h，取对数生长期的HeLa-GFP细胞，用质量分数为0.25％的胰酶消化后用含体积分数10％新生牛血清的DMEM培养液稀释，按照8×104细胞/孔的密度铺板于12孔细胞培养板中，置于培养温度为37℃、体积分数5％的CO2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达70～80％。配置不同质量比的载体/一体化敲除质粒DNA复合物，在更换新的DMEM培养基后，按照3.3μg质粒DNA/孔的用量加入到12孔细胞板中，继续培养48小时。
(3)基因编辑效率的测定
从培养箱中取出12孔细胞培养板，移除细胞培养液，用PBS洗涤2次，用质量分数为0.25％的胰酶消化后用含体积分数10％新生牛血清的DMEM培养液悬起细胞，将细胞转移到1.5mL离心管中，离心(1000转，5min)，倒掉废液，加入1mL PBS重悬，离心(1000转，5min)，再次倒掉废液后，加入250μL PBS悬起细胞，作为流式细胞术的样品。
通过流式细胞术的FITC通道，对GFP表达对阴性的细胞群进行区分，进而确定该聚合物基因载体材料的基因编辑效率，表3给出了不同基因载体材料的基因编辑效率测定结果。
表3不同基因载体的基因编辑效率测定
不同载体材料 GFP阴性的细胞(％)
PEI25k 10.3
PEI-PBA 17.4
PEI-PBA/PLG 34.9
(4)激光共聚焦显微镜表征GFP的敲除情况
在加入敲除材料前24h，取对数生长期的HeLa-GFP细胞，用质量分数为0.25％的胰酶消化后用含体积分数10％新生牛血清的DMEM培养液稀释，按照2×105细胞/孔的密度铺板于放入玻片的6孔细胞培养板中，置于培养温度为37℃、体积分数5％的CO2的恒温培养箱中培养直至细胞汇合度达70～80％。配置一体化敲除质粒DNA复合物PEI-PBA/PLG/DNA，在更换新的DMEM培养基后，按照6.6μg质粒DNA/孔的用量加入到6孔细胞板中，继续培养48小时。用4％多聚甲醛固定18min后，用DAPI染料染色5min，制片后用激光共聚焦显微镜拍摄GFP的表达情况，结果如图1所示。未添加基因敲除复合物的PBS组中接近100％的细胞均表达GFP，加入基因敲除复合物后，GFP的表达大大降低，表明发生了成功的GFP基因敲除。
实施例6基因载体复合物纳米颗粒的细胞毒性实验
(1)HeLa细胞的培养
细胞培养方法同实施例4和实施例5。
(2)基因载体复合物与细胞共孵育
将培养好的HeLa细胞进行消化并计数，按照5×103细胞/孔的密度种在96孔板中，放入细胞培养箱中过夜培养。按照实施例4和实施例5的最佳转染比例配置载体/DNA复合物，加入96孔板中，继续培养48h。
(3)细胞存活率的检测
基因载体复合物颗粒与细胞共孵育48h后，96孔板每孔加入20μL的cck-8溶液，放入37℃、体积分数5％的CO2的恒温培养箱中继续培养1h，在450nm震荡2 min检测吸光值。未加材料组作为对照组，看作细胞存活率100％。计算各实验组的细胞毒性，实验结果如表4所示：
表4基因载体复合物的细胞存活率实验
基因载体复合物 HeLa细胞(％)
PEI25k/pDNA 81.4
PEI-PBA/pDNA 97.8
PEI-PBA/PLG/pDNA 98.9
实验结果表明，相比商品化的基因载体材料PEI25k组，本发明提供的聚合物基因载体组细胞存活率更高，达到95％以上，进一步验证了，本发明所制备的基因载体材料不仅具有优异的基因转染性能，且对细胞的生存状态没有影响。
由以上实施例的测试结果可知，本发明提供的聚合物基因载体能够有效担载质粒DNA。与商品化的转染试剂PEI25k相比，具有更高的转染效率和优异的基因编辑性能且无明显细胞毒性，在基因转染以及基因编辑领域具有光明的应用前景。
由以上实施例可知，本发明提供了一种可用于基因治疗的聚合物基因载体，包括苯硼酸分子修饰的超支化聚乙烯亚胺和聚谷氨酸；所述PEI与PBA的摩尔比为1:(2～20)；所述PEI-PBA与PLG的摩尔比为1:(0.3～3)。本发明提供的聚合物基因载体转染效率高，在HeLa细胞中的最佳转染效率比阳离子基因载体黄金标准“PEI25k”的最佳转染效率高将近两个数量级，且在最佳转染效率的比例时细胞存活率均在90％以上，细胞毒性低，具有较高的基因编辑效率。制备的PEI-PBA阳离子聚合物载体在基因载体设计和基因治疗领域具有广泛的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种可用于基因治疗的复合基因载体，其特征在于，包括苯硼酸分子修饰的超支化聚乙烯亚胺；
和聚谷氨酸；
所述苯硼酸分子修饰的超支化聚乙烯亚胺与聚谷氨酸的摩尔比为1:(0.3～3)；
所述苯硼酸分子修饰的超支化聚乙烯亚胺中超支化聚乙烯亚胺和苯硼酸的摩尔比为1:(2～20)。
2.根据权利要求1所述的复合基因载体，其特征在于，超支化聚乙烯亚胺的分子量为10000～80000；
所述聚谷氨酸的聚合度为10～70。
3.一种权利要求1～2任一项所述复合基因载体的制备方法，包括以下步骤：
将苯硼酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺分别溶于二甲基甲酰胺中，室温搅拌1～4h，加入超支化聚乙烯亚胺水溶液，反应，得到的反应产物透析，冻干，得到阳离子聚合物PEI-PBA；
将所述阳离子聚合物PEI-PBA和聚谷氨酸复合，得到复合基因载体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为48～96h。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述透析的时间为2～4天；
所述冻干的温度为-30～-80℃。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述苯硼酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺分别溶于二甲基甲酰胺后的浓度均为5～30mg/mL；
所述超支化聚乙烯亚胺水溶液的浓度为10～100mg/mL。
7.一种可用于基因编辑的复合物纳米颗粒，由权利要求1～2任一项所述复合基因载体或权利要求3～6任一项所述制备方法制备的复合基因载体和质粒DNA复合制得。
8.根据权利要求7所述的可用于基因编辑的复合物纳米颗粒，其特征在于，所述复合基因载体和质粒DNA的质量比为10～1:1。
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