CN110903354A - 一种靶向前列腺癌骨转移的肿瘤微环境电荷逆转的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用 - Google Patents

一种靶向前列腺癌骨转移的肿瘤微环境电荷逆转的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体是一种靶向前列腺癌骨转移的肿瘤微环境电荷逆转的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用。本发明的仿生纳米递送体系采用前列腺癌骨转移微环境中成骨细胞膜包裹在纳米载体上，可以赋予所修饰的纳米载药体系靶向骨转移前列腺癌的功能。所包裹的纳米载体为硫辛酸修饰的肿瘤微酸性环境电荷逆转的多肽类纳米载体，可以实现肿瘤微酸性环境下电荷发生逆转，由负电荷变成正电荷，可以有效在胞内促进药物的递送和释放。本发明的成骨细胞膜修饰的仿生纳米递送系统可以递送化疗药，具有靶向性好，稳定性高，免疫原性低的特点，为前列腺癌骨转移治疗中的疏水性治疗药物递送提供一种有效的手段。

Description

一种靶向前列腺癌骨转移的肿瘤微环境电荷逆转的仿生纳米 递送系统及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体地说，是一种靶向前列腺癌骨转移的肿瘤微环境电荷逆转的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用。
背景技术
前列腺癌的发病率不断上升，目前已成为危害男性健康的重要肿瘤之一，据美国CA[Siegel R.L,et al.Cancer statistics,2019.69(1):7-34]报道，前列腺癌在美国男性癌症发病率中位居首位，死亡率位居第二，在中国也是男性中较常见的一种恶性肿瘤。内分泌治疗是晚期前列腺癌的主要治疗方法。大多数患者对内分泌治疗有效，但经过中位时间14-30月后，大部分病变逐渐进展，对内分泌治疗耐受，即转变为激素抵抗性前列腺癌。患者在雄激素去除后肿瘤仍不断增殖，病情进展恶化，最终导致患者死于激素抵抗性肿瘤和肿瘤的远端转移 [Nakazawa M,et al.Curr Oncol Rep,2017.19(2):13]。骨骼是前列腺癌最常见的靶器官，约80％-90％的晚期前列腺癌均会发生不同程度的骨转移，骨转移的发生通常意味着前列腺癌的不可治愈性[Sartor O，N Engl J Med，2018.378(17): 1653-1654]。随着前列腺癌发生发展机制研究的深入，针对靶向前列腺癌骨转移治疗的研究具有重要意义。
如何避免免疫清除有效携带药物靶向至骨转移部位，又可以靶向识别前列腺癌细胞，实现前列腺癌骨转移部位的二级靶向，是靶向治疗前列腺癌骨转移的难点，纳米仿生载体有希望解决难点。体循环及免疫系统的快速清除作用已被证实是纳米药物靶向肿瘤部位递送失败的首要因素[Stewart M.P,et al.Nature,2016.538(7624):183-192]。针对肿瘤转移病造的靶向，由于转移病灶体积小、器官分散程度高、血管化程度低以及脉管系统弯曲且静水压力升高，这些特点使得转移病灶的EPR效应和渗透性有限，是转移性癌症治疗的重要难点。近些年的研究表明，仿生纳米载体不仅可以通过将纳米粒进行伪装避开免疫系统的识别[Green J.J,et al.Nature,2016.540(7633):386-394]，还可以高效靶向肿瘤并渗透到肿瘤组织内部，显著抑制癌症的转移，为抗肿瘤转移提供了一种新策略。在众多仿生材料中，细胞膜是一种可赋予纳米粒独特生物学性质的材料。通过将细胞膜融合于纳米粒表面，可使纳米粒具备原细胞复杂而独特的表面理化性质[Kroll A.V,BioconjugChem.2017.28(1):23-32；Tan S,Theranostics,2015. 5(8):863-81]。根据给药目的及用途，细胞膜仿生纳米粒中的细胞膜可采用红细胞膜[Gao M,Adv Mater.2017.29(35)；RaoL,Acs Nano,2017.11(4):3496-3505]、白细胞膜[Cho N.H,et al.NatNanotechnol.2011.6(10):675-82]、肿瘤细胞膜[Chen Z,et al.ACS Nano.2016.10(11):10049-10057]、血小板膜[Dehaini D,et al.Adv Mater,2017.29(16)]等；而纳米粒内核可采用PLGA[Hu C.M,et al.Proc Natl Acad Sci U S A,2011.108(27):10980-5]、明胶[LiL.L,et al.ACS Nano,2014. 8(5):4975-83]等。通过这一策略，细胞膜的结构与功能，尤其是细胞膜表面的特异性功能蛋白得以保留；而合成的纳米粒作为核心，不但可以起到支撑作用，还可以荷载药物或进行结构修饰。这些细胞膜仿生纳米粒在纳米医学和药学领域表现出极大的发展潜力，拥有着广阔的应用空间。
前列腺癌骨转移的器官特异性机制尚不清楚，但与其他恶性肿瘤一样，前列腺癌的侵袭转移过程也包括一系列密切相关的步骤。每一个步骤对于整个转移过程来说都是必不可少的。根据“种子与土壤”学说的观点，转移性癌细胞和骨之间的相互作用在骨转移发生发展过程中至关重要。在骨的微环境中，丰富的细胞因子促进了前列腺癌细胞的生长和向激素非依赖性前列腺癌转变，而前列腺癌细胞也通过分泌细胞因子影响骨的重塑，彼此之间相互作用，促进骨转移的发生发展。有研究[Chang A.C,et al.Cancer Lett,2018.426:47-56]表明，前列腺癌细胞与成骨细胞的黏附和识别是通过VCAM-1/整合素α4β1相互作用，其中成骨细胞通过分泌Wnt-1诱导分泌蛋白-1(Wnt-1-induced secretedprotein-1， WISP-1)可以使得前列腺癌细胞VCAM-1表达水平升高，而前列腺癌细胞通过分泌内皮素-1(endothelin-1，ET-1)因子使得成骨细胞高表达整合素α4β1。研究提示，前列腺癌骨转移微环境中转移性癌细胞可以通过VCAM-1/整合素α4β1 可以靶向黏附识别成骨细胞。那么如果将前列腺癌骨转移微环境中成骨细胞对纳米材料进行伪装包裹，也许可以实现转移性前列腺癌细胞的精准靶向。
硫辛酸是一种具有分子内五元环二硫键结构，末端羧基的两亲性物质，与细胞膜具有脂质双分子层具有较好的亲和力，具有较好的包载化疗药物的作用，且二硫键可在细胞还原性条件下裂解，为药物在肿瘤部位的有效释放提供条件。
基于上述理论，本发明提供了一种硫辛酸修饰的肿瘤微环境电荷逆转多肽作为纳米仿生载药体系的纳米内核，利用电荷逆转和硫辛酸的谷胱甘肽敏感的特点，实现仿生纳米递送系统到达肿瘤部位之后，成功的从纳米多肽载体中释放出来，以及进一步从仿生膜中释放出来。
中国专利文献CN107129522A公开了一种硫辛酸修饰的固有无序蛋白的多肽纳米载体，由赖氨酸、缬氨酸、精氨酸、脯氨酸、苏氨酸、谷氨酸组成的多肽，采用硫辛酸自带的二硫键进行交联，所形成的多肽聚合物可在细胞内迅速被降解，具有很低的细胞毒性，同时又有较好的共载基因与化疗药的能力，能在乳腺癌耐药治疗中能特异性增强耐药细胞对化疗药的敏感性，促进乳腺癌细胞的凋亡。
目前尚无一种将可以靶向骨转移性前列腺癌细胞的肿瘤微环境敏感的仿生纳米载药体系，并且能够通过多肽的电荷逆转实现肿瘤微环境触发敏感释放治疗药物的靶向递送。
发明内容
本发明的目的在于提供一种靶向性好、免疫原性低、生物相容性好、肿瘤微环境敏感释放的可包载疏水治疗药物的仿生纳米递送系统，通过将疏水性治疗药物包载在中性条件下带负电的硫辛酸修饰的纳米多肽载体内，然后将上述负电内核用功能化可以靶向骨转移性前列腺癌细胞的成骨细胞膜进行包裹。本发明的第二个目的是提供有靶向功能的成骨细胞膜包裹仿生纳米递送系统的制备方法。本发明的第三个目的是提供该肿瘤微环境敏感的仿生纳米递送系统在制备能够靶向递送疏水性治疗药物至肿瘤部位的抗肿瘤药物中的应用。
本发明所要解决的主要技术问题是：如何通过得到具有靶向功能的成骨细胞膜，然后将所递送疏水性药物包裹在带负电的肿瘤微环境电荷逆转的纳米多肽内核内，通过仿生膜对负电内核进行包裹，制备仿生纳米递送体系，实现肿瘤治疗药物的靶向递送和药物释放。
本发明设计了一种由具有靶向功能的成骨细胞膜包裹带负电的纳米多肽内核组合构建的仿生纳米递送体系。本发明的创造性在于以下几点：1)高表达整合素α4β1的成骨细胞膜可以实现骨转移前列腺癌细胞的靶向，以及其它表面表达VCAM-1的肿瘤细胞的靶向。细胞膜包裹的纳米递送体系赋予纳米粒的生物靶向性可以使得纳米递送体系免疫原性低，生物相容比较好，不易于被机体的网状内皮系统清除。2)该仿生纳米递送体系所包裹的纳米内核为一种肿瘤微环境敏感的纳米载药递送系统，具备以下两个特点：一方面在肿瘤微酸性的环境下，纳米内核的电荷发生逆转，从负电荷变成正电荷，有利于纳米内核从仿生递送体系中释放；另一方面电荷逆转的纳米内核释放后进入肿瘤细胞后，载体的硫辛酸交联形成的的二硫键会在肿瘤细胞内高谷胱甘肽的还原性条件下发生断裂，实现进一步的药物的细胞内释放，实现肿瘤细胞内药物的逐级递送。因此，所构建的仿生递送体系不仅仅具有靶向性强，免疫原性低，而且其内核的电荷逆转赋予递送体系具有肿瘤部位微环境敏感逐级递送的特点。
本发明的第一方面，提供一种硫辛酸修饰的多肽，所述多肽的氨基酸序列如下所示：
TH：AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL，(Aib：2-氨基异丁酸)(SEQ ID NO：1)；氨基酸之间以肽键相连，多肽缩写为TH。
所述硫辛酸修饰，是指硫辛酸的羧基与第一个组氨酸的氨基以酰胺基连接。所述硫辛酸修饰的多肽简写为：LA-TH，其中LA为硫辛酸，TH为上述多肽。
本发明的第二方面，提供一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体(英文缩写为 LA-THss)，所述的纳米多肽载体为上述的硫辛酸修饰的多肽的聚合物，所述的聚合物是通过硫辛酸二硫键经半胱氨酸进行交联形成的。
所述的硫辛酸形成的二硫键可以在肿瘤细胞内高谷胱甘肽的还原性条件下发生断裂解体，有利于药物从多肽载体中释放。
所述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体为硫辛酸修饰的肿瘤微酸性环境电荷逆转的多肽类纳米载体，可以实现肿瘤微酸性环境下电荷发生逆转，由负电荷变成正电荷，可以有效的促进药物的递送和释放。
所述的聚合物的单体的化学结构式如式(I)所示，所述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体的化学结构如式(II)所示：
Figure RE-GDA0002365550910000041
Figure RE-GDA0002365550910000051
本发明的多肽TH：序列为AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL；其中A： Ala，丙氨酸，G：Gly，甘氨酸，Y：Tyr，酪氨酸，L：Leu，亮氨酸，H：His，组氨酸，I：Ile，异亮氨酸，N：Asn，天门冬酰胺，Aib：2-氨基异丁酸，氨基酸之间以肽键连接形成21肽。
进一步的，所述的聚合物的分子量为2800-30000Da。
进一步的，所述的聚合物中半胱氨酸的摩尔量为硫辛酸修饰的多肽的10％。
进一步的所述的聚合物形成的纳米胶束在pH＝7.4溶液条件下电位在 -10～-15mv左右，在pH＝6.5溶液条件下电位在20-30mv左右。
进一步的所述的纳米胶束包裹在细胞膜中形成仿生递送体系后，电位与仿生细胞膜的电荷一致，在-20～-30mv左右，电位前后变化在4-8nm。
本发明的第三方面，提供一种靶向高表达VCAM-1肿瘤的肿瘤微环境电荷逆转的仿生纳米递送系统，其纳米内核为上述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体 (LA-THss)，高表达整合素α4β1的成骨细胞膜包裹在上述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体(LA-THss)表面。
本发明的仿生纳米递送系统是一种成骨细胞膜介导的肿瘤微环境敏感仿生纳米递送体系，可以实现前列腺癌骨转移细胞的精准靶向。
进一步的，所述的成骨细胞膜，是指通过与前列腺癌骨微环境相互作用之后高表达整合素α4β1的成骨细胞的细胞膜，具有靶向骨转移高表达VCAM-1 的前列腺癌癌细胞的功能。
进一步的，所述的高表达整合素α4β1的成骨细胞膜是通过分离C4-2前列腺癌细胞的生长培养基，然后作用于成骨细胞获得。
更进一步的，通过分离提取前列腺癌细胞培养液作用于成骨细胞，然后检测成骨细胞表面血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)的表达水平，高表达整合素α4β1的成骨细胞膜包裹在纳米多肽载体表面，使得纳米递送系统具有靶向骨转移前列腺癌细胞的特点，其表面高表达血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)。
更进一步的，用前列腺癌C4-2条件培养基去培养成骨细胞(培养基体积占比为5-15％)。所述的C4-2条件培养基的获得过程为：将呈对数生长期的C4-2 细胞消化计数后以2×106的密度铺板在100mm培养皿中，放在孵箱中过夜培养后，第二天将培养基换成不含血清的培养基，两天后，收集上层培养基，-70℃保存。
进一步的，所述的肿瘤微环境敏感仿生纳米递送体系能够将治疗药物包裹在一种可以响应肿瘤微环境的纳米递送体系里，该纳米递送体系具备肿瘤微环境谷胱甘肽敏感和肿瘤微酸性触发电荷逆转的特点，谷胱甘肽敏感可以实现药物从纳米内核中释放，纳米多肽内核电荷逆转可以实现药物从仿生膜中释放。
本发明的第四方面，提供一种如上所述的靶向高表达VCAM-1肿瘤的肿瘤微环境电荷逆转的仿生纳米递送系统的制备方法，包括以下步骤：制备能够包载疏水性药物的上述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体(LA-THss)，然后将高表达整合素α4β1的成骨细胞膜包裹在上述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体(LA-THss) 表面，即得。
进一步的，是将高表达整合素α4β1的成骨细胞膜与硫辛酸修饰的纳米多肽载体(LA-THss)以质量比1:1的比例水浴超声2min，即得。
进一步的，所述的疏水性药物，为疏水性化疗药，也可以是疏水性小分子药物。例如，阿霉素，1-甲基色氨酸(1-MT)等。
更进一步的，所述的制备方法，包括如下步骤：
(A)将培养瓶中处于对数生长期的MC3T3-E1细胞，用含有5-15％的C4-2 条件培养基培养24h，然后用细胞刮子刮下细胞，并用吸管吹打下细胞；离心收集细胞，取细胞沉淀备用；
(B)将1ml(添加PMSF)的膜蛋白抽提试剂A加入至密度为2-5×107的细胞中，重悬细胞，冰浴放置10-15min；
(C)采用液氮冻融法反复冻融三次来破碎细胞，然后于4℃，700g条件下离心10min，小心收集上清液至一新的离心管中以去除细胞核和未破碎的细胞；
(D)最后在4℃，14000g条件下离心30min，以得到细胞膜碎片；
(E)将合成好的硫辛酸修饰的多肽LA-TH与半胱氨酸盐酸盐(10％)溶解于甲醇中，搅拌12h，氮气吹干，得硫辛酸修饰的纳米多肽载体LA-THss，-20℃保存；
(F)将步骤E制备好的LA-THss通过超声乳化法制备载疏水性化疗药的胶束；
(G)然后将高表达整合素α4β1的成骨细胞膜与步骤F所得胶束超声2min 即得载疏水性化疗药的仿生纳米递送系统。
本发明的第五方面，提供一种如上所述的硫辛酸修饰的多肽在制备药物递送系统中的应用。
本发明的第六方面，提供一种如上所述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体 (LA-THss)在制备药物递送系统中的应用。
本发明的第七方面，提供一种如上所述的仿生纳米递送系统在制备治疗高表达VCAM-1肿瘤的靶向药物中的应用。
进一步的，所述的高表达VCAM-1肿瘤为表面高表达VCAM-1细胞的肿瘤，例如乳腺癌，骨转移前列腺癌等。
进一步的，所述的仿生纳米递送系统在制备携载化疗药靶向至前列腺癌骨转移部位的药物中的应用。
进一步的，所述的靶向药物是采用上述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体 (LA-THss)包载疏水性药物，LA-THss疏水端用来携载疏水性药物，然后将高表达整合素α4β1的成骨细胞膜包裹在上述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体 (LA-THss)表面。
所述的仿生膜(高表达整合素α4β1的成骨细胞膜)可以包裹带负电的纳米内核，纳米内核可以包载疏水性药物，仿生膜可以避免纳米载体在体内被清除，实现成功递送药物至肿瘤部位。
进一步的，所述的疏水性药物，为疏水性化疗药，也可以是疏水性小分子药物。例如，阿霉素，1-甲基色氨酸(1-MT)等。
本发明所述的仿生纳米递送系统具备肿瘤微环境触发释放的特点，在肿瘤微酸性条件下，纳米内核中的多肽载体的电荷发生逆转，由负电变成正电，外层包裹的功能化的成骨细胞膜会由于内部纳米多肽载体的电荷翻转而有利于药物释放。
本发明的仿生纳米递送体系采用前列腺癌骨转移微环境中成骨细胞膜包裹在纳米载体上，可以赋予所修饰的纳米载药体系靶向骨转移前列腺癌的功能。所包裹的纳米载体为硫辛酸修饰的肿瘤微酸性环境电荷逆转的多肽类纳米载体，可以实现肿瘤微酸性环境下电荷发生逆转，由负电荷变成正电荷，可以有效在胞内促进药物的递送和释放。本发明的成骨细胞膜修饰的仿生纳米递送系统可以递送化疗药，具有靶向性好，稳定性高，免疫原性低的特点，为前列腺癌骨转移治疗中的疏水性治疗药物递送提供一种有效的手段。
本发明优点在于：
1、本发明所得到的仿生膜可以在体内外实现前列腺癌骨转移的骨靶向，同时将包载有治疗药物的纳米内核进行“伪装”，并且通过肿瘤微环境敏感，实现治疗药物的肿瘤微环境敏感触发释放。本发明的肿瘤微环境敏感的仿生纳米递送体系能通过整合素α4β1与VCAM-1靶向实现前列腺癌骨转移靶向治疗。有希望成为前列腺癌骨转移肿瘤治疗的一种靶向、低毒、生物相容性好的仿生纳米级递送系统；
2、本发明的仿生纳米递送体系为一种通过纳米内核的肿瘤微环境响应特点，可以实现肿瘤微环境触发释放的功能，因此非常适合于体内外的肿瘤靶向治疗的研究与应用。
3、本发明的制备方法操作简单，不会对环境产生污染，反应条件温和，具有靶向功能的仿生细胞膜来源容易，载药纳米内核载体制备简单，所得到的仿生纳米载体，靶向性好、免疫原性低、安全性好，易于装载药物，有利于大规模推广于研究和应用领域。
附图说明
图1为LA-THss的核磁氢谱图；
图2为硫辛酸修饰的多肽纳米载体LA-THss载药胶束的制备及透射电镜图；
图3为硫辛酸修饰的多肽纳米载体LA-THss载药胶束的粒径图；
图4为pH＝7.4条件下硫辛酸修饰的多肽纳米载体LA-THss载药胶束的电位图；
图5为pH＝6.5条件下硫辛酸修饰的多肽纳米载体LA-THss载药胶束的电位图；
图6为具有靶向功能的成骨细胞膜仿生纳米复合物的制备及粒径图；
图7为功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物的电位观察；
图8为功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物的免疫胶体金透射电镜考察；
图9为功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物的体外释放考察；
图10为功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物的体外靶向性考察；图11 为pH＝7.4条件下功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物抗增殖效应考察；
图12为pH＝6.5条件下功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物抗增殖效应考察；
图13为小动物活体成像实验-体内前列腺癌骨转移靶向实验。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：硫辛酸修饰的电荷逆转多肽载体的合成
硫辛酸(LA)修饰的多肽氨基酸序列：AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL (Ala：丙氨酸，Gly：甘氨酸，Tyr：酪氨酸，Leu：亮氨酸，His：组氨酸，Ile：异亮氨酸，Asn：天门冬酰胺，Aib：2-氨基异丁酸)(SEQ ID NO：1)，LA-TH，由浙江鸿拓生物技术有限公司采用多肽固相合成法合成并命名为LA-TH，利用制备高效液相色谱纯化合成的LA-CL，使其纯度达到95％以上。LA-为硫辛酸， TH：序列为AGYLLGHINLHHLAHL(Aib)HHIL；其中A：Ala，丙氨酸，G： Gly，甘氨酸，Y：Tyr，酪氨酸，L：Leu，亮氨酸，H：His，组氨酸，I：Ile，异亮氨酸，N：Asn，天门冬酰胺，Aib：2-氨基异丁酸，氨基酸之间以肽键连接形成21肽。
实施例2：硫辛酸修饰的多肽纳米载体LA-THss载药胶束的制备及透射电镜图
取20mg硫辛酸修饰的多肽LA-TH与10％的半胱氨酸盐酸盐溶于1ml甲醇中，搅拌反应12小时，反应温度为10～30℃，反应结束后氮气吹干甲醇，得到半胱氨酸交联后的载体LA-THss，加入1ml二氯甲烷中，再加入1mg阿霉素，加入4ml水，混合后冰浴条件下超声，5s，超声2次，功率为400w，然后迅速转移至10ml纯水中，搅拌挥发溶剂，得到载药胶束LA-THss/Dox，计算包封率和载药量。透射电镜下观察纳米复合物形态并测定其粒径和电位。阿霉素的浓度通过生物发光仪检测，计算得到包封率为82％，载药率为4.3％。透射电镜图结果如图2所示，胶束呈球形，结构完整。粒径如图3，结果在152nm左右， PDI为0.213。进一步测定其电荷翻转的化学性质，分别于pH＝6.5和pH＝7.4条件下测定其电位情况，如图4和图5，分别为pH＝7.4和pH＝6.5溶液条件下电位情况，pH＝6.5时电位在-11.7mv，pH＝7.4条件下，电位变成正值25.2mv。
实施例3：具有靶向功能的成骨细胞膜仿生纳米复合物的制备及表征
高表达整合素-α4β1的成骨细胞膜是通过分离C4-2前列腺癌细胞的生长培养基(培养基体积占比为15％)。C4-2条件培养基的获得过程为：将呈对数生长期的C4-2细胞消化计数后以2×106的密度铺板在100mm培养皿中，放在孵箱中过夜培养后，第二天将培养基换成不含血清的培养基，两天后，收集上层培养基，-70℃保存。将收集培养后的成骨细胞，按照膜蛋白提取试剂盒说明书提取成骨细胞膜，将高表达整合素-α4β1的成骨细胞膜与所制备载药胶束超声 2min即得功能化的成骨细胞膜包裹纳米载药体系，然后对其粒径电位进行考察。结果如图6所示，成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物Ost@LA-THss/Dox的粒径结果见图在159nm左右，电位结果见图7，呈负值，为-24.9mv。
实施例4：功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物的免疫胶体金透射电镜观察
将提取得到的成骨细胞膜包裹的纳米粒用与多聚甲醛固定后滴于200目碳支持膜上，20min后，干燥并洗涤，然后转移至50mM甘氨酸中猝灭游离醛基团，洗涤后用5％BSA封闭液中封闭，加入Integrin Alpha-4一抗(1:20稀释)，孵化30min，洗涤后，在适当的封闭溶液中加入稀释的二抗(1:20稀释，山羊抗兔IgG H&L 20nm Gold预吸附二抗)孵育30min，最后洗涤后用磷钨酸染液负染90s，于显微镜下观察并拍照。结果见图8，功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物结果完整，表面吸附有20nm金纳米吸附的抗体，说明功能化成骨细胞膜包裹的纳米粒制备成功。
实施例5：不同pH条件下功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物体外释放考察
采用透析袋法考察阿霉素在体外从功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物中的释放情况，选取截留分子量为3500的透析袋，透析介质pH分别为7.4、 6.5，37℃进行考察。按照实施例3制得Ost@LA-THss/Dox仿生纳米载体。将 1ml Ost@LA-THss/Dox仿生纳米载体溶液于透析袋中，放置于含50mlPBS的缓冲液中，100r/min，37℃，分别于1、2、4、6、8、10、12、20、24、48时间点取500μl外液，并补加500μl，利用阿霉素自带荧光测定其吸收。绘制体外释放曲线如图9所示。
由图9可知，pH6.5条件下阿霉素的释放速度明显快于pH7.4条件下，且其在48小时时，其累计释放率将近85％。结果表明所述电荷逆转多肽载体有利于阿霉素从功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物中释放出来，其为抗肿瘤药物在肿瘤微环境释放提供了条件。
实施例6：pH＝6.5条件下功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物的体外摄取考察
将对数生长期的C4-2细胞按照30w/孔分别接种于12孔板上，加入1ml含 10％FBS(Gibco公司，美国)的DMRM培养基(Gibco公司，美国)培养24 小时，使细胞汇合度达70-80％，将培养基更换为无血清的pH＝6.5的培养基。将Dox、LA-THss/Dox、Ost@LA-THss/Dox按Dox浓度为1μg/ml加入细胞孔中，孵育2小时，吸去培养基，PBS洗3遍后消化离心收集细胞，利用流式细胞仪检测细胞对Dox的摄取情况。
结果如图10所示，在pH＝6.5条件下，2h后C4-2细胞对Dox摄取差异不明显，而C4-2细胞对LA-THss/Dox、Ost@LA-THss/Dox的摄取明显增多。说明在pH＝6.5条件下多肽载体由于电荷逆转从负电荷变成正电荷，穿膜作用加强，并在成骨细胞膜的介导下，Ost@LA-THss/Dox的摄取阳性细胞百分数达到了 89％左右，且平均荧光密度值是LA-THss/Dox组的2.34倍，结果显示由于多肽载体的电荷逆转，以及成骨细胞膜的靶向作用下，Ost@LA-THss/Dox可以更多的进入细胞。
实施例7：不同pH条件下功能化成骨细胞膜包裹的仿生纳米复合物抗增殖效应考察
将对数生长期的C4-2细胞按照8×103/孔接种于96孔板中，培养24h，使细胞汇合度达到50％。吸去培养基，每孔加入100μl含不同阿霉素浓度的Dox、 LA-THss/Dox、Ost@LA-THss/Dox，分别加入不同pH的培养基继续培养24h， CCK-8法检测细胞毒性，统计细胞存活率。
结果如图11，12所示，对于C4-2细胞而言，LA-THss/Dox及 Ost@LA-THss/Dox组载pH＝7.4条件下对细胞存活率的影响明显小于pH＝6.5条件下，在阿霉素浓度为1μg/ml时，Dox组的细胞活力在80％以上，而LA-THss/Dox及Ost@LA-THss/Dox组的细胞活力在60％以下。这可能由于在 pH＝7.4条件下，Ost@LA-THss/Dox的释放缓慢导致，而在pH＝6.5条件下，多肽载体LA-THss可以发生电荷逆转，可以更快的进入细胞，进而发生作用。因此，将Dox包载在可发生电荷逆转的仿生纳米胶束中，一方面仿生细胞膜的包裹有利于增加纳米粒的靶向性，纳米内核可以在肿瘤微酸性条件下电荷发生逆转，可以促进纳米内核的药物释放，有利于抗肿瘤药物的靶向递送及释放。
实施例8小动物活体成像实验-体内前列腺癌骨转移靶向实验
实验采用C4-2细胞胫骨髓腔中注射的方法构建前列腺癌骨转移模型，具体操作如下：消毒裸鼠右下肢的皮肤，然后于裸鼠右膝内侧纵切口约4mm处，看到胫骨上端，然后于胫骨结节内上方进行用26G的枕头进行穿刺，沿胫骨骨髓腔纵轴进针大约3-4mm，有阻力即停止进针，然后改用29G针头10μl C4-2细胞悬液(细胞个数为2×106个细胞)，然后用骨蜡对针眼进行封闭并缝合裸鼠皮肤，裸鼠继续饲养2周，选取肿瘤圆润且体积大于100mm3的裸鼠进行下一步实验。
制备载含有亲脂性羰花青染料DiR
(1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindotricarbocyanine iodide)的Ost@LA-THss/DiR纳米粒，于尾静脉注射前列腺癌骨转移小鼠体内，4h后使用小动物活体成像仪检测裸鼠体内的荧光分布，并拍照记录。
结果显示，4h后，Ost@LA-THss/DiR组可以有效的将DiR靶向至骨转移部位，见图13。
综合以上各项实施例，可见功能化的成骨细胞膜能有效地包载载药纳米粒递送至靶细胞，并可以通过电荷逆转作用，成功的实现肿瘤微酸性条件下的仿生纳米载体的药物释放，说明功能化成骨细胞膜适合作为纳米粒外层靶向包衣递送治疗药物，以及其纳米多肽内核的电荷逆转的性质有利于仿生纳米载体的药物的靶向释放。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
序列表
<110> 上海维洱生物医药科技有限公司
福建中医药大学
内蒙古医科大学
<120> 一种靶向前列腺癌骨转移的肿瘤微环境电荷逆转的仿生纳米递送系统及其制备方法与应用
<130> /
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
Ala Gly Tyr Leu Leu Gly His Ile Asn Leu His His Leu Ala His Leu
1 5 10 15
Ala Ile Asx His His Ile Leu
20

Claims (10)

1.一种硫辛酸修饰的多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述硫辛酸修饰，是指硫辛酸的羧基与第一个组氨酸的氨基以酰胺基连接。
2.一种硫辛酸修饰的纳米多肽载体，其特征在于，所述的纳米多肽载体为如权利要求1所述的硫辛酸修饰的多肽的聚合物，所述的聚合物是通过硫辛酸二硫键经半胱氨酸进行交联形成的。
3.一种靶向高表达VCAM-1肿瘤的肿瘤微环境电荷逆转的仿生纳米递送系统，其特征在于，其纳米内核为如权利要求2所述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体，高表达整合素α4β1的成骨细胞膜包裹在上述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体表面。
4.根据权利要求3所述的仿生纳米递送系统，其特征在于，所述的高表达整合素α4β1的成骨细胞膜是通过分离C4-2前列腺癌细胞的生长培养基，然后作用于成骨细胞获得。
5.一种靶向高表达VCAM-1肿瘤的肿瘤微环境电荷逆转的仿生纳米递送系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：制备能够包载疏水性药物的如权利要求2所述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体，然后将高表达整合素α4β1的成骨细胞膜包裹在所述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体表面，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，是将高表达整合素α4β1的成骨细胞膜与硫辛酸修饰的纳米多肽载体以质量比1:1的比例水浴超声2min，即得。
7.一种如权利要求1所述的硫辛酸修饰的多肽在制备药物递送系统中的应用。
8.一种如权利要求2所述的硫辛酸修饰的纳米多肽载体在制备药物递送系统中的应用。
9.一种如权利要求3或4所述的仿生纳米递送系统在制备治疗高表达VCAM-1肿瘤的靶向药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的高表达VCAM-1肿瘤为乳腺癌，骨转移前列腺癌。
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