CN113274509B - 一种多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种多肽药物纳米靶向给药系统HTPP‑Exo‑M1‑8及其制备方法和应用,所述HTPP‑Exo‑M1‑8主要由M1‑8多肽、HTPP多肽和DSPE‑PEG2000‑MAL制备而成,所述的M1‑8多肽的氨基酸序列为:GWLKKIGK。通过将HTPP多肽修饰人骨髓间充质干细胞来源外泌体后作为M1‑8多肽的载体,而得到HTPP‑Exo‑M1‑8。本发明制备的HTPP‑Exo‑M1‑8的实验技术简单,对获得的HTPP‑Exo‑M1‑8进行抗肝癌活性检测和靶向性研究,发现HTPP‑Exo‑M1‑8与M1‑8多肽相比,具有更显著的抗肝癌活性和靶向性。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及一种多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8及其制备方法和应用。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的高度恶性肿瘤,全球每年HCC新发患者高达55.1万例,我国为肝癌高发区域,每年新发病例数占全球新发病例数的54%,且发病年龄趋于年轻。多数患者就诊时已属晚期,既往传统化疗药对晚期肝癌疗效差,全身毒副作用大。近年来,随着分子生物学的深入研究,分子靶向药物的临床应用为肝癌的治疗带来了新突破,因此探索并研发新型肝靶向药物将有望带来巨大的社会效益和经济效益。
M1-8多肽(氨基酸序列为:GWLKKIGK,具体如SEQ ID NO.1所示)是广东药科大学/广东省生物活性药物研究重点实验室从家蝇幼虫脂肪体cDNA文库中克隆的一种昆虫抗菌肽Musca domestica cecropin的衍生肽,由Musca domestica cecropin的第1~8位而得,与天然Musca domestica cecropin相比,具有明显简单的结构,因此更易进入细胞,生产成本更少。但目前还没有公开文献报道M1-8多肽具有抗肝癌活性。
HTPP多肽(氨基酸序列为:CNSRSLGENDDGNNEDNEKLR,具体如SEQ ID NO.2所示)是课题组前期实验工作中从疟原虫CSP中发现的具有肝靶向穿膜作用的小分子肽,位于CSP保守I区上游,不仅与人肝癌细胞HepG2具有高亲和力,可特异性结合到肝细胞表面HSPG,并能够有效穿透细胞膜,介导CSP进入胞内。肝癌组织中HSPG表达高,与正常肝组织有显著差异。
人骨髓间充质干细胞(Human Bone mesenchymal stem cells,hMSCs)是一类来源于中胚层的具有多向分化潜能的多能干细胞,被认为是产生外泌体能力最强的细胞,并且hMSCs来源外泌体具有低免疫原性、免疫调节能力、体外易培养扩增以及向肿瘤或炎症部位迁移的能力,因此已广泛应用于炎症、肿瘤疾病的实验及临床研究。目前尚未发现有将HTPP多肽修饰后的hMSCs来源外泌体作为多肽药物的载体,制备出多肽药物纳米靶向给药系统,以达到提高多肽药物的生物利用度,延长作用时间以及增加靶向性的作用效果。
专利文献CN110934851A公开了靶向细胞膜的多肽药物外泌体纳米载药系统及其制备方法,构建了一个具有主动靶向性能的纳米传递系统(CTNF-α-exosome-SPION)。通过基因工程融合多肽分布到外泌体表面,并通过转铁蛋白与外泌体上的转铁蛋白受体的结合将SPION连接到外泌体上。在外加磁场的帮助下,SPION的主动靶向性使负载药物获得了更高的局部浓度。另外融合蛋白的亲脂性,通过外泌体的递送,更多与分布在细胞表面的受体结合,增强激活活性。该载药系统能够将多肽药物递送病灶部位细胞表面多肽受体所在位置,进而提高多肽药物靶向性和激活活性,但其在血液循环中的存在时间较短,不能够长时间作用。
专利文献CN106916211A公开了一种MACC1基因的多肽抑制剂及应用,该多肽包含如下氨基酸序列:ETLGQPDAK(Xa)PCFQEDPMA(Xb)GTDELGCMIWN;其中,Xa和Xb选自M,Y,L,V,W或E。本发明提供的多肽抑制剂可以从转录和翻译水平抑制MACC1基因在HepG2细胞中的表达,为MACC1基因的有效抑制剂;同时,该MACC1基因的有效抑制剂可以显著抑制HepG2细胞的增殖和侵袭,该MACC1基因的有效抑制剂可以用于制备成抗肝细胞癌侵袭的药物,但其在血液循环中的存在时间较短,不能够长时间作用。
发明内容
本发明旨在提供一种多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8,通过将HTPP多肽修饰的外泌体作为M1-8的载体,形成HTPP-Exo-M1-8,该HTPP-Exo-M1-8具有显著的抗肝癌活性和靶向性,能够有效地延长其在血液循环中的存在时间。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案:一种多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8,主要由M1-8多肽、HTPP多肽和DSPE-PEG2000-MAL制备而成。
优选地,所述M1-8多肽的氨基酸序列为:GWLKKIGK。
优选地,所述HTPP多肽的氨基酸序列为:CNSRSLGENDDGNNEDNEKLR。
一种多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8的制备方法,包括以下步骤:
S1、将HTPP多肽与DSPE-PEG2000-MAL结合,得到连接DSPE-PEG2000-MAL的HTPP多肽;
S2、外泌体修饰:将步骤S1制备得到的连接DSPE-PEG2000-MAL的HTPP多肽嵌合到人骨髓间充质干细胞来源的外泌体膜表面,得到HTPP-Exo载体;
S3、将M1-8多肽包载入步骤S2制备得到的HTPP-Exo载体中得到HTPP-Exo-M1-8。
优选地,所述步骤S1中HTPP多肽与DSPE-PEG2000-MAL结合的制备方法为:
S11、用适量N,N-二甲基甲酰胺溶解DSPE-PEG2000-MAL,于30~50℃减压干燥0.5~2h得到干燥脂膜;
S12、将步骤S11制备得到的脂膜用磷酸缓冲盐溶液10~30mL水化,涡旋,于30~50℃水浴超声10~30min,得到脂材胶束体系;
S13、另取多肽HTPP溶于10~30mL磷酸缓冲盐溶液中得到多肽溶液,之后将步骤S12制备的脂材胶束溶液缓慢滴加到多肽溶液中,充氮保护,室温避光反应6~10h,反应结束后,所得体系以双蒸水避光透析12~36h,所述双蒸水避光透析的分子量为3500。
优选地,所述步骤S13中多肽与脂材的物质的量之比为1:(1.2~2)。
优选地,所述步骤S2外泌体修饰是将提取的外泌体混旋于磷酸缓冲盐溶液中,然后加入连接DSPE-PEG2000-MAL的HTPP多肽,室温避光缓慢搅拌6~10h,反应得到HTPP-Exo载体。
优选地,所述步骤S3中将M1-8多肽包载入HTPP-Exo载体上是将M1-8多肽加入磷酸缓冲盐溶液混旋的HTPP-Exo载体中,缓慢搅拌12~36h,超速离心除去未包载的M1-8多肽,即得HTPP-Exo-M1-8。
本发明还请求保护多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8在制备靶向抗肝癌药物中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
通过本方法制备的多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8的实验技术简单,对获得的HTPP-Exo-M1-8进行抗肝癌活性检测和靶向性研究,发现HTPP-Exo-M1-8与M1-8多肽相比,具有更显著的抗肝癌活性和靶向性,同时能够有效地延长其在血液循环中的存在时间,进一步增强对肝癌细胞的抑制作用。
附图说明
图1为M1-8多肽的高效液相色谱图示意图。
图2为M1-8多肽的质谱图示意图。
图3为Exosomes、HTPP-Exo及HTPP-Exo-M1-8的TEM图示意图。
图4为显示Exosomes、HTPP-Exo、HTPP-Exo-M1-8的粒径和zeta电位测量结果示意图。
图5为显示荧光显微镜下Exosomes、HTPP-Exo、HTPP-Exo-M1-8对HepG2肿瘤细胞靶向性示意图。
图6为显示MTT结果HTPP-Exo-M1-8与Exo-M1-8的抗肝癌活性示意图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述,所述实施例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明,均为常规方法;所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,为可从商业途径得到的试剂和材料。
所述人骨髓间充质干细胞,购自通派(上海)生物科技有限公司,货号为:HMSC。
实施例1、固相化学合成法合成抗菌肽M1-8
M1-8的制备从C端到N端逐一进行,通过多肽合成仪来完成,具体步骤为:
(1)首先将Fmoc-X(X是抗菌肽MDC C端的第一个氨基酸)接入到Wang树脂,然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂;再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y,Y为M1-8多肽C端第二个氨基酸)接入到X-Wang树脂;按照这个程序依次从C端合成到N端,直至合成完毕,得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂;
(2)在上述得到的肽树脂中,加入切割试剂,20℃避光下反应2h,过滤;沉淀用三氟乙酸(TFA)洗涤,将洗液与上述滤液混合,旋转蒸发仪浓缩,再加入10倍体积的预冷无水乙醚,于-20℃沉淀3h,析出白色粉末物,以2500g离心10min,收集沉淀,再用无水乙醚洗涤沉淀,真空干燥,得到多肽,其中切割试剂由三氟乙酸、水和三异丙基氯硅烷按照质量比95:2.5:2.5混合而成;
(3)使用0.2mol/L硫酸钠,用磷酸调节至pH7.5,进行柱平衡30min,用90%乙腈水溶液溶解多肽,过滤,C18反相常压柱,采用梯度洗脱,流速为1mL/min,检测波为220nm,收集主峰,冻干;
(4)再利用反相C18柱进一步纯化,洗脱液A为0.05%TFA/2%CH3CN;洗脱液B为0.05%TFA/90%CH3CN,洗脱浓度为12-37%B,洗脱时间为25min,流速为1mL/min,再同上收集主峰,冻干,即得精制的M1-8多肽;
(5)将上述得到精制M1-8多肽经过反相高效液相色谱和电喷雾质谱法分析,反相高效液相色谱图如图1所示,质谱图如图2所示,结果显示,M1-8多肽的纯度大于95%,分子量为992.70,与理论分子量基本一致。
实施例2、一种HTPP-Exo-M1-8及其制备方法
制备方法:S1、HTPP多肽与DSPE-PEG2000-MAL结合;
S11、用适量DMF溶解10mg DSPE-PEG2000-MAL,于30℃减压干燥0.5h得干燥脂膜;
S12、将步骤S11制备得到的脂膜用磷酸缓冲盐溶液20mL水化,涡旋,30℃水浴超声10min,得到脂材胶束体系;
S13、另取10mg多肽HTPP溶于20mL磷酸缓冲盐溶液中,之后将步骤S12制备的脂材胶束溶液缓慢滴加到多肽溶液中,充氮保护,室温避光反应6h,反应结束后,所得体系以双蒸水避光透析12h,所述双蒸水避光透析的分子量为3500,所述多肽与脂材的物质的量之比为1:1.2;
S2、外泌体修饰:将提取的人骨髓间充质干细胞来源的外泌体溶于磷酸缓冲盐溶液中,然后加入连接介质的HTPP多肽,室温避光缓慢搅拌6h,反应得到HTPP-Exo载体;
S3、M1-8多肽包载入HTPP-Exo载体:将M1-8多肽加入磷酸缓冲盐溶液混旋的HTPP-Exo载体中,缓慢搅拌12h,超速离心除去未包载的M1-8多肽,得到HTPP-Exo-M1-8。
实施例3、一种HTPP-Exo-M1-8及其制备方法
制备方法:S1、HTPP多肽与DSPE-PEG2000-MAL结合;
S11、用适量DMF溶解10mg DSPE-PEG2000-MAL,于40℃减压干燥1h得干燥脂膜;
S12、将步骤S11制备得到的脂膜用磷酸缓冲盐溶液10mL水化,涡旋,40℃水浴超声10min,得到脂材胶束体系;
S13、另取10mg多肽HTPP溶于10mL磷酸缓冲盐溶液中,之后将步骤S12制备的脂材胶束溶液缓慢滴加到多肽溶液中,充氮保护,室温避光反应8h,反应结束后,所得体系以双蒸水避光透析24h,所述双蒸水避光透析的分子量为3500,所述多肽与脂材的物质的量之比为1:1.25;
S2、外泌体修饰:将提取的人骨髓间充质干细胞来源的外泌体溶于磷酸缓冲盐溶液中,然后加入连接介质的HTPP多肽,室温避光缓慢搅拌8h,反应得到HTPP-Exo载体;
S3、M1-8多肽包载入HTPP-Exo载体:将M1-8多肽加入磷酸缓冲盐溶液混旋的HTPP-Exo载体中,缓慢搅拌24h,超速离心除去未包载的M1-8多肽,得到HTPP-Exo-M1-8。
实施例4、一种HTPP-Exo-M1-8及其制备方法
制备方法:S1、HTPP多肽与DSPE-PEG2000-MAL结合;
S11、用适量DMF溶解10mg DSPE-PEG2000-MAL,于50℃减压干燥5h得干燥脂膜;
S12、将步骤S11制备得到的脂膜用磷酸缓冲盐溶液30mL水化,涡旋,50℃水浴超声20min,得到脂材胶束体系;
S13、另取10mg多肽HTPP溶于30mL磷酸缓冲盐溶液中,之后将步骤S12制备的脂材胶束溶液缓慢滴加到多肽溶液中,充氮保护,室温避光反应10h,反应结束后,所得体系以双蒸水避光透析36h,所述双蒸水避光透析的分子量为3500,所述多肽与脂材的物质的量之比为1:2;
S2、外泌体修饰:将提取的人骨髓间充质干细胞来源的外泌体溶于磷酸缓冲盐溶液中,然后加入连接介质的HTPP多肽,室温避光缓慢搅拌10h,反应得到HTPP-Exo载体;
S3、M1-8多肽包载入HTPP-Exo载体:将M1-8多肽加入磷酸缓冲盐溶液混旋的HTPP-Exo载体中,缓慢搅拌36h,超速离心除去未包载的M1-8多肽,得到HTPP-Exo-M1-8。
试验例一、Exosomes、HTPP-Exo及HTPP-Exo-M1-8透射电子显微镜实验
将样品游离外泌体(Exosomes)、HTPP-Exo和本发明HTPP-Exo-M1-8小心的滴落在100目的铜网上,5min后待外泌体吸附在铜网上时,将1%的醋酸双氧铀滴加在铜网上,染色5min,用PBS洗两遍,然后将铜网放至50℃烘箱内烘干3h,制得后的样品存放至铜网储存盒内,透射电镜下,100kv成像,观察外泌体的形态结构。
结果如图3所示,外泌体的形态较好,为较规则的圆球形,可分辨出完整的双层膜结构。HTPP-Exo-M1-8相比于游离外泌体和HTPP-Exo具有的边缘较模糊,表明HTPP集中分布于外泌体表面。从图中还可以看出游离外泌体的直径在100nm左右,HTPP-Exo、HTPP-Exo-M1-8相较于游离外泌体,粒径稍大仍保持在合适的粒径范围。
试验例二、Exosomes、HTPP-Exo、HTPP-Exo-M1-8的粒径和zeta电位测量实验
分别取200μL新制的外泌体(Exosomes)、HTPP-Exo、HTPP-Exo-M1-8的纳米粒于微量测量皿中,使用粒度分析仪检测其粒径大小分布和zeta电位,检测温度为25℃。
结果如图4所示,Exosomes的直径在100nm左右,HTPP-Exo、HTPP-Exo-M1-8相较于Exosomes,粒径稍大但仍保持在合适的粒径范围。Exosomes电位最高,为-1.0mV,当外泌体经靶向肽HTPP修饰后电位明显减小,为-5.29mV,这可能与带负电荷的PEG富集于外泌体表面所致,负载M1-8后电位略有增加。PEG的引入一方面可以降低纳米微粒的电位,另一方面可以使纳米颗粒在体循环中减少外泌体与血清蛋白的相互作用,使其避免被体内的网状内皮系统过早的清除,延长其在血液循环中的存在时间。
试验例三、荧光显微镜观察靶向性实验
制备HepG2细胞爬片,加入Dil标记的Exosomes、HTPP-Exo和HTPP-Exo-M1-8,室温孵育1h后,DAPI染色,用PBS洗涤4次,封片后用荧光倒置显微镜观察Exosomes、HTPP-Exo和HTPP-Exo-M1-8的细胞荧光情况。
结果如图5所示,HTPP-Exo和HTPP-Exo-M1-8作用后细胞内充满红色荧光,比Exosomes作用后细胞内荧光多,提示HTPP-Exo及HTPP-Exo-M1-8对HepG2肿瘤细胞的靶向性好。
试验例四、MTT法评价HTPP-Exo-M1-8对HepG2肿瘤细胞增殖的影响
采用MTT法分别评价Exo-M1-8、HTPP-Exo-M1-8对HepG2细胞增殖的影响,具体方法如下:
HepG2细胞于5%CO2、37℃饱和湿度的恒温箱中传代培养,培养基为含10%胎牛血清,100U/mL氨苄青霉素和100U/mL链霉素的DMEM,当细胞生长接近80%融合度时,用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液,准确计数。
调整细胞浓度为1×105个/mL,接种于96孔细胞培养板(分3组,每组4个复孔),培养24小时待细胞贴壁后,弃培养液,分别加入含M1-8 200μg/mL Exo-M1-8多肽及相同摩尔浓度HTPP-Exo-M1-8的培养液100μL,阴性对照组加空白培养液。
第3天弃培养基,用PBS洗板后,每孔加入10μL的5mg/mL MTT溶液和100μL培养基置于恒温培养箱内继续培养4h。取出培养板,弃去上清,每孔加入100μLDMSO,将培养板振摇30min。待MTT氧化产生的结晶完全溶解之后使用酶标仪测定OD值,测定波长为570nm,实验重复3次,取平均值。
结果如图6所示,MTT结果显示Exo-M1-8、HTPP-Exo-M1-8均具有抗HepG2肿瘤细胞增殖活性,但HTPP-Exo-M1-8活性明显强于Exo-M1-8。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (5)
1.一种抗肝癌多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8,其特征在于,由M1-8多肽、HTPP多肽和DSPE-PEG2000-MAL制备而成;
所述M1-8多肽的氨基酸序列为:GWLKKIGK;
所述HTPP多肽的氨基酸序列为:CNSRSLGENDDGNNEDNEKLR;
所述的抗肝癌多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8的制备方法,包括以下步骤:
S1、将HTPP多肽与DSPE-PEG2000-MAL结合,得到连接DSPE-PEG2000-MAL的HTPP多肽;
S2、外泌体修饰:将步骤S1制备得到的连接DSPE-PEG2000-MAL的HTPP多肽嵌合到人骨髓间充质干细胞来源的外泌体膜表面,得到HTPP-Exo载体;
S3、将M1-8多肽包载入步骤S2制备得到的HTPP-Exo载体中得到HTPP-Exo-M1-8。
2.根据权利要求1所述的抗肝癌多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8,其特征在于,所述步骤S1中HTPP多肽与DSPE-PEG2000-MAL结合的制备方法为:
S11、用适量N,N-二甲基甲酰胺溶解DSPE-PEG2000-MAL,于30~50℃减压干燥0.5~2 h得到干燥脂膜;
S12、将步骤S11制备得到的脂膜用磷酸缓冲盐溶液10~30 mL水化,涡旋,于30~50℃水浴超声10~30 min,得到脂材胶束体系;
S13、另取多肽HTPP溶于10~30 mL磷酸缓冲盐溶液中得到多肽溶液,之后将步骤S12制备的脂材胶束溶液缓慢滴加到多肽溶液中,充氮保护,室温避光反应6~10 h,反应结束后,所得体系以双蒸水避光透析12~36 h。
3.根据权利要求2所述的抗肝癌多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8,其特征在于,所述步骤S13中多肽与脂材的物质的量之比为1:(1.2~2)。
4.根据权利要求1所述的抗肝癌多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8,其特征在于,所述步骤S2外泌体修饰是将提取的外泌体混旋于磷酸缓冲盐溶液中,然后加入步骤S1制备得到的连接DSPE-PEG2000-MAL的HTPP多肽,室温避光缓慢搅拌6~10 h,反应得到HTPP-Exo载体。
5.根据权利要求1所述的抗肝癌多肽药物纳米靶向给药系统HTPP-Exo-M1-8,其特征在于,所述步骤S3中将M1-8多肽包载入HTPP-Exo载体上是将M1-8多肽加入磷酸缓冲盐溶液混旋的HTPP-Exo载体中,缓慢搅拌12~36 h,超速离心除去未包载的M1-8多肽,即得HTPP-Exo-M1-8。
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