CN101830984A - 肿瘤诊断和治疗用的双靶向杂合多肽 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了肿瘤诊断和/或治疗用的双靶向杂合多肽。所述双靶向杂合多肽含有氨基酸序列：Seq.No.1：ARYCRGDCFDGYIGSR、Seq.No.2：ARYCRGDCFDATWLPPR、Seq.No.3：ARYCRGDCFDALNGREESP之一。其与肿瘤细胞和血管内皮细胞的结合的特异性和敏感性均优于单氨基酸基序的靶向多肽。细胞学和动物学实验已证实上述多肽与肿瘤细胞有很强的亲和力，可用于生物医药领域。

Description

肿瘤诊断和治疗用的双靶向杂合多肽

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及蛋白质多肽，具体涉及一种可作肿瘤诊断和治疗用的双靶向杂合多肽。

背景技术

在肿瘤的诊断和治疗中，存在着如何将成像药物和治疗药物分子专一性地导入肿瘤细胞或肿瘤组织中的问题，靶向药物载体是解决这一问题的有效途径之一。靶向药物载体中起到靶向作用的是其表面的靶向分子。靶向分子对肿瘤细胞的靶向性能是靶向药物载体发挥作用的主要机制。生物靶向是指通过组织专一性导向配体同组织细胞的特异结合达到定向运载药物的目的。与磁靶向相比，生物靶向脂质体具有靶向特异性好，使用方便，自定位，无须外部定位等特点，作为肿瘤早期成像诊断和治疗的药物载体具有巨大的优势。

目前所采用的生物靶向分子主要包括叶酸、转铁蛋白、靶向肽等。中国专利(200310108850.5)“叶酸受体靶向脂质体药物载体及其制备方法和应用”，其脂质体表面修饰叶酸，达到对叶酸受体的靶向功能。中国专利(200510024656.8)“含精-甘-天冬氨酸序列环肽及其主动靶向脂质体”，其脂质体中包封的是干扰素，用于肝纤维化的治疗。

由于高通量生物配体筛选技术的发展，如噬菌体肽库，核酸适配子库，抗体库等的不断进步，人们可以获得大量的同种组织细胞表面受体有特异性结合作用的配体分子。通过噬菌体肽库技术获得的配体肽，其中大多数配体肽的亲和常数仅在105～107，远低于单克隆抗体1011～1013水平，且特异性不够理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种肿瘤诊断和治疗用的双靶向杂合多肽。

本发明的技术方案是：肿瘤诊断和治疗用的双靶向杂合多肽，所述双靶向杂合多肽含有氨基酸序列：Seq.No.1：ARYCRGDCFDGYIGSR、Seq.No.2：ARYCRGDCFDATWLPPR、Seq.No.3：ARYCRGDCFDALNGREESP之一。

所述肿瘤组织有特异性结合能力的双靶向杂合多肽包括至少两个特征氨基酸基序，其可与至少两个不同的肿瘤及新生血管特异性表面受体结合，其中Seq.No.1含有RGD和YIGSR序列基序，可分别与整合素αVβ3、层粘连蛋白结合；Seq.No.2含有RGD和ATWLPPR序列基序，可分别与整合素αVβ3、血管内皮细胞生长因子受体结合；Seq.No.3含有RGD和NGR序列基序，可分别与整合素αVβ3、氨肽酶N结合。与单个motif靶向多肽相比，该类双靶向杂合多肽与肿瘤细胞和血管内皮细胞的结合具有更好的特异性和敏感性。细胞学和动物学实验已证实上述多肽与肿瘤细胞有很强的亲和力。

在此基础上又研发了双靶向杂合多肽的接枝物，即将某种功能分子与多肽相连，其作为连接臂可以连接多肽与药物载体脂质体，从而合成肿瘤靶向脂质体。细胞学实验证实与无靶向的脂质体相比，肿瘤靶向脂质体与肿瘤细胞的结合能力明显增强。此肿瘤靶向脂质体可被广泛用于多种药物的包被，如磁共振造影剂钆双胺、钆喷酸葡胺等，治疗药物紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素、顺铂等，进而用于肿瘤的诊断和治疗。

本发明的有益效果是：所述肿瘤诊断和治疗用的双靶向杂合多肽包括至少两个特征氨基酸基序，其可与至少两个不同的肿瘤及新生血管特异性表面受体结合，所以该多肽与肿瘤细胞和血管内皮细胞的结合的特异性和敏感性均优于单基序的靶向多肽；本发明双靶向杂合多肽的接枝物，可用于肿瘤成像诊断和肿瘤治疗。

具体实施方式

肿瘤诊断和治疗用的双靶向杂合多肽，所述双靶向杂合多肽含有氨基酸序列：Seq.No.1：ARYCRGDCFDGYIGSR、Seq.No.2：ARYCRGDCFDATWLPPR、Seq.No.3：ARYCRGDCFDALNGREESP中的至少一个。

在上述的杂合多肽含有至少两个以上的特征氨基酸基序(motif)，可与至少两个不同的肿瘤及新生血管特异性表面受体结合。其中Seq.No.1含有RGD和YIGSR序列基序，可分别与整合素αVβ3、层粘连蛋白结合；Seq.No.2含有RGD和ATWLPPR序列基序，可分别与整合素αVβ3、血管内皮细胞生长因子受体结合；Seq.No.3含有RGD和NGR序列基序，可分别与整合素αVβ3、氨肽酶N结合。与单个motif靶向多肽相比，该类双靶向杂合多肽与肿瘤细胞和血管内皮细胞的结合具有更好的特异性和敏感性。

实施例1.双靶向杂合多肽的合成

采用固相多肽合成法合成多肽，合成的固相支持物为Fmoc-Tyr-Wang-Resin树脂，该树脂溶涨和脱保护后，采用Fmoc保护氨基酸，依照标准的HBTU+NMM或DIC+HOBT缩合法进行耦联，缩合完成后切割洗涤。合成所需肽链后进行氧化环化，SHIMADZU高效液相色谱仪进行纯化，质谱分析确认分子结构，样品密封后-20℃保存。

实施例2.双靶向杂合多肽接枝物的合成

接枝物指多肽和脂肪酸通过连接臂连接形成的化合物。连接臂包括碳链类、聚乙二醇类、聚乙烯亚胺类、氨基酸类、多元醇类化合物。

碳链类化合物，以6-氨基己酸(ε-amino hexanoic acid，EACA)连接臂为例说明双靶向杂合多肽接枝物的合成：

在实施例1中缩合洗涤完成后，加入6-氨基己酸进行缩合、洗涤，然后加入棕榈酸的DMF溶液进行缩合，切割洗涤后，高效液相色谱纯化，质谱仪鉴定，得到双靶向杂合多肽的接枝物。

聚乙二醇类化合物，以Fmoc-NH-PEG(11)-COOH(Fmoc聚乙二醇(11)酸)连接臂为例说明双靶向杂合多肽接枝物的合成：

在实施例1中缩合洗涤完成后，加入Fmoc-NH-PEG(11)-COOH进行缩合、洗涤，然后加入棕榈酸的二甲基甲酰胺溶液进行缩合，切割洗涤后，高效液相色谱纯化，质谱仪鉴定，得到双靶向杂合多肽接枝物。

氨基酸类，以KGG(lys-gly-gly，赖酰甘酰甘氨酸)连接臂为例说明双靶向杂合多肽接枝物的合成：

分别在GG12，HL12，WG12的N末端添加KGG氨基酸序列，在固相多肽合成仪上依照实施例1所述方法进行合成，缩合、脱保护完成后，再加入棕榈酸的DMF溶液进行缩合，切割洗涤后。高效液相色谱纯化，质谱仪鉴定，得到双靶向杂合多肽接枝物。

实施例3.靶向顺磁性造影剂纳米脂质体的制备(以钆喷酸葡胺为例)

利用薄膜超声法制备靶向钆喷酸葡胺纳米脂质体，以期达到早期诊断恶性肿瘤的目的。

(1)靶向磁共振造影剂纳米脂质体的成分包括：磷脂50～60％，胆固醇35～45％，PEG修饰磷脂5～10％，双靶向杂合多肽接枝物0.3～0.6％，钆喷酸葡胺0.01mol/L～0.25mol/L；

(2)将上述脂质体成分加入适量甲醇/氯仿＝1∶3中溶解，旋转蒸发器上蒸发成膜，真空干燥后加入钆喷酸葡胺PBS溶液，充分旋转水合形成脂质体悬浮液；

(3)脂质体混悬液经超声或高压乳匀形成均匀的小单室的纳米脂质体，采用分子筛层析或超滤法对纳米脂质体进行浓缩并除去未结合的多肽配体-脂肪酸联结化合物及未成膜的脂类，至此得到靶向磁共振造影剂纳米脂质体。4℃冰箱保存待用。

(4)激光散射粒度分布分析仪测定脂质体的粒径分布，表明制备的脂质体粒径范围在80～100纳米，平均粒径95纳米。偶氮氯膦法测定脂质体钆含量在1570～2380mg/l。

实施例4.靶向抗肿瘤药物纳米脂质体的制备(以包封紫杉醇为例)

(1)双靶向杂合多肽的纳米脂质体肿瘤治疗药物的成分包括：磷脂(详细型号)40～100％、胆固醇2～30％、PEG修饰磷脂(来源，生产厂家)10～30％、双靶向杂合多肽接枝物1～10‰、紫杉醇0.5～15％；

(2)将上述比例的脂质和药物溶于适量氯仿，置旋转蒸发仪中55℃水浴旋转成膜，蒸除氯仿后加入蔗糖溶液1.5～9％继续旋转，充分溶胀至薄膜脱落，所得白色混悬液即为靶向长循环紫杉醇脂质体。

(3)超声细胞粉碎仪间歇超声至溶液略带乳光，经0.2μm PTFE滤膜滤过后分装于西林瓶，-20℃预冻2小时，-40℃真空冷冻干燥10小时，干燥完全后缓慢升温至0℃5.5小时、10℃5.5小时，真空封盖后取出，即得紫杉醇脂质体冻干品。

(4)冻干品可采用注射用水、生理盐水或PBS液复溶，复溶液体在漩涡混合器上混合10秒后得复溶后的靶向长循环紫杉醇脂质体，4℃保存备用。

实施例5.荧光长循环脂质体和靶向荧光长循环脂质体制备

荧光长循环脂质体的配方按摩尔比组成为：蛋黄卵磷脂∶胆固醇∶Mpeg-DSPE为9∶1∶0.5，荧光磷脂(Rho-DHPE)与总脂摩尔比为0.1％；

靶向荧光长循环脂质体的配方按摩尔比组成为：蛋黄卵磷脂∶胆固醇∶Mpeg-DSPE为9∶1∶0.5，荧光磷脂(Rho-DHPE)与总脂摩尔比为0.1％，靶向多肽与总脂摩尔比为1∶542。

合成步骤：脂质、靶向多肽溶于适量氯仿，置旋转蒸发仪中避光55℃水浴旋转成膜，氯仿蒸除后加入等量生理盐水溶液继续旋转，充分溶胀至薄膜脱落，所得粉色混悬液即为靶向长循环紫杉醇脂质体。超声细胞粉碎仪间歇超声至溶液略带乳光，再经PTFE 0.20μm针式滤器滤过后4℃保存备用。

实施例6.荧光长循环脂质体和靶向荧光长循环脂质体细胞结合试验，用于验证靶向脂质体与与血管内皮细胞、肿瘤细胞的特异性结合能力

A549肺癌细胞、HUVEC细胞接种于6孔细胞培养板(2×104/孔)，37℃、5％CO2培养箱中过夜；更换培养液2ml；每孔分别加200μl无荧光普通脂质体、荧光脂质体和各靶向荧光脂质体，培养箱中孵育2小时；倾去培养液，生理盐水洗涤2次，每孔加0.2％胰酶100μl消化细胞；吸去胰酶，加Coulter Isoton III Diluent液0.5ml；将细胞悬液移入试管，2000rpm离心5分，倾去上清；加Coulter Isoton III Diluent液0.5ml后上流式细胞仪(Coulter Epics XL)采用通道2检测细胞荧光相对强度。

本试验结果如下：

*与荧光脂质体组比较，组间差异有统计学意义(P＜0.05)。

上述实验证实，双靶向杂合多肽-接枝物与脂质体相连后可增强脂质体载体的靶向运转能力，对肿瘤细胞的特异性结合能力尤为突出。靶向长循环脂质体可作为一种新型有效的给药载体。

实施例7.靶向和非靶向钆喷酸葡胺脂质体与血管内皮细胞的体外结合试验，用于验证双靶向钆喷酸葡胺脂质体与细胞特异性结合能力

HUVEC细胞消化后接种于6cm细胞培养板，37℃、5％CO2培养箱中过夜。更换新鲜培养液2ml，每板分别加200μl钆喷酸葡胺、非靶向钆喷酸葡胺脂质体(调零)、靶向顺磁性脂质体，培养箱中孵育4小时。倾去培养液，生理盐水洗涤4次，每板加入细胞裂解液500μl裂解5分钟，将细胞裂解悬液移入试管，偶氮氯膦法测定其钆含量。

本实验结果如下：

*与钆喷酸葡胺和非靶向钆喷酸葡胺脂质体组间差异有统计学意义(P＜0.05)。上述实验证实，双靶向杂合多肽-接枝物与脂质体相连后能增强脂质体载体的靶向运转能力，靶向顺磁性长循环脂质体可作为一种新型有效的磁共振造影剂载体。

氨基酸序列表：

Seq.No.1：ARYCRGDCFDGYIGSR(C-C环化)

Seq.No.2：ARYCRGDCFDATWLPPR(C-C环化)

Seq.No.3：ARYCRGDCFDALNGREESP(C-C环化)。

Claims (6)

1.一种肿瘤诊断和/或治疗用的双靶向杂合多肽，其特征是所述双靶向杂合多肽含有氨基酸序列Seq.No.1：ARYCRGDCFDGYIGSR、Seq.No.2：ARYCRGDCFDATWLPPR、Seq.No.3：ARYCRGDCFDALNGREESP之一。

2.权利要求1所述的肿瘤诊断和/或治疗用的双靶向杂合多肽，其特征是所述双靶向杂合多肽含有氨基酸序列Seq.No.1：ARYCRGDCFDGYIGSR。

3.权利要求1所述的肿瘤诊断和/或治疗用的双靶向杂合多肽，其特征是所述双靶向杂合多肽含有氨基酸序列Seq.No.2：ARYCRGDCFDATWLPPR。

4.权利要求1所述的肿瘤诊断和/或治疗用的双靶向杂合多肽，其特征是所述双靶向杂合多肽含有氨基酸序列Seq.No.3：ARYCRGDCFDALNGREESP。

5.权利要求1～4任一所述的肿瘤诊断和/或治疗用的双靶向杂合多肽的用途，其特征在于所述的肿瘤为肺癌。

6.权利要求1～4任一所述的肿瘤诊断和/或治疗用的双靶向杂合多肽的用途，其特征在于可利用此双靶向杂合多肽制备肿瘤靶向脂质体。