CN103613671B - 一种Al‑18F标记融合肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Al‑18F标记融合肽及其制备方法，其包括连接在一起的胶质瘤特异性靶向多肽cRGDyK和A7R。其制备方法包括如下步骤：（1）制备NOTA‑PEG‑RGDyK‑Lys‑Ac‑A7R；（2）制备18F生理盐水溶液；（3）制备[Al18F]NOTA‑PEG‑RGDyK‑Lys‑Ac‑A7R；（4）纯化所制得的[Al18F]NOTA‑PEG‑RGDyK‑Lys‑Ac‑A7R，即得所述Al‑18F标记融合肽。本发明的Al‑18F标记融合肽包括连接在一起的胶质瘤特异性靶向多肽cRGDyK和A7R，利用其不同的靶向生物学特性进一步提高了融合肽对胶质瘤的特异性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种Al-18F标记融合肽及其应用。
背景技术
脑胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤，发病率约占全部颅内肿瘤的40-60%，具有复发率高、病死率高、治愈率低的特点。其主要原因之一是多数恶性胶质瘤呈浸润型生长，与周围脑组织边界不清，目前临床应用的影像技术难以精确确定其范围，对于治疗（手术及放化疗）复发的评价则更显不足，给临床诊断和治疗增加了困难。脑胶质瘤的特异性显像技术方法的建立对诊断恶性胶质瘤、指导恶性胶质瘤的临床治疗策略、评估治疗效果和改善预后都具有十分重要的意义。
目前，临床常用的脑胶质瘤正电子显像剂为18F-FDG。但由于正常脑组织也大量浓聚18F-FDG，在恶性程度相对较低的胶质瘤或胶质瘤病灶的部分组织放射性浓聚程度较低时，高本底的18F-FDG的图像上就很难将瘤灶与正常脑组织精确区分。此外，单发转移瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、淋巴瘤、脑膜瘤、脑挫伤，脑炎等非胶质瘤疾病同样可以摄取18F-FDG而造成病灶的浓聚，从而对胶质瘤与这些疾病的鉴别诊断造成了困难。
11C-MET是目前最常用于脑肿瘤PET显像的氨基酸类示踪剂。11C-MET与18F-FDG相比，其本底低，在区分肿瘤组织与非肿瘤组织，勾勒肿瘤界限与范围，早期评价治疗效果等方面具有优势。但11C-MET在鉴别脑胶质瘤病理分级、评价预后等方面并不比18F-FDG更好。另外，11C同位素的半衰期 较短，造成制药、运输等环节的不方便，增加了使用成本，广泛的临床应用受到一定的阻碍。因此，急需研制一种高效的脑胶质瘤PET显像剂，这种显像剂需具有以下特征：1、必须能与脑胶质瘤细胞特异性结合；2、必须能够产生足够高的靶/非靶比，能够清楚的显示病灶的微小细节，指导临床医生对脑胶质瘤划分等级、制定治疗计划、评价术后及放化疗效果和鉴别肿瘤复发。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种Al-18F标记融合肽。
本发明的另一目的在于提供上述Al-18F标记融合肽的制备方法。
本发明的技术方案如下：
一种Al-18F标记融合肽，包括连接在一起的胶质瘤特异性靶向多肽cRGDyK和A7R，其结构式如下：
其中，n=1～5。
关于上述RGDyK：
整合素在肿瘤的侵袭和转移中发挥着重要的作用。迄今为止，已发现18种不同的α亚基和8种不同的β基，组成20种以上的整合素，其中以αvβ3最为重要。αvβ3仅表达于肿瘤细胞，能特异性识别细胞外基质（ECM）中含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arg-gly-asp,RGD)序列的小分子多肽。RGDyK（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸）是通过噬菌体技术筛选出来的对整合素αvβ3有较高亲和力的环状RGD多肽。在过去的十年间，多种放射性核素标记的RGD多肽作为PET分子探针已被评价（Sun X,Yan Y,Liu S,et al.18F-FPPRGD2and18F-FDG PET of response to Abraxane therapy.J Nucl Med,2011,52(1):140-146.；Liu Z,Jia B,Shi J,et al.Tumor Uptake of the RGD Dimeric Probe(99m)Tc-G（3）-2P（4）-RGD2is Correlated with Integrin alpha(v)beta（3）Expressed on both Tumor Cellsand Neovasculature.Bioconjug Chem,2010.；Wang L,Shi J,Kim YS,et al.Improvingtumor-targeting capability and pharmacokinetics of(99m)Tc-labeled cyclic RGDdimers with PEG（4）linkers.Mol Pharm,2009,6(1):231-245.；Liu Z,Yan Y,Liu S,etal.(18)F,(64)Cu,and(68)Ga labeled RGD-bombesin heterodimeric peptides for PETimaging of breast cancer.Bioconjug Chem,2009,20(5):1016-1025.；Chen X,Park R,Tohme M,et al.MicroPET and autoradiographic imaging of breast cancer alpha v-integrin expression using18F-and64Cu-labeled RGD peptide.Bioconjug Chem,2004,15(1):41-49.）
关于上述A7R：
VEGF是迄今发现的最重要的促血管生成因子之一，是内皮细胞特异的强效有丝分裂原,在肿瘤生长、侵袭、转移中发挥着重要的作用。血管内皮生长因子受体VEGFR有4种:VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（KDR/Flk-1）、VEGFR-3（Flt-4）和VEGFR-4（neu-ropilin-1,NP-1），通过阻断VEGF与VEGFR-2信号通路可以达到抑制肿瘤的血管生成的作用。2000年，Binetury-Tournaire（Binetruy-Tournaire R,Demangel C,Malavaud B,etal.Identification of a peptide blocking vascular endothelial growth factor(VEGF)-mediated angiogenesis.EMBO J,2000,19(7):1525-1533.）以VEGF单克隆抗体为靶标，应用噬菌体肽库与随机7肽库进行交叉筛选出ATWLPPR七肽（丙氨酸-苏氨酸-色氨酸-亮氨酸-亮氨酸-精氨酸，Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，简称A7R)。体外研究证明，ATWLPPR（A7R）与VEGFR有着较高的亲和力，可有效抑制VEGF诱导人血管内皮细胞增殖，在体内则可完全消除大鼠角膜模型中 VEGF诱导的血管新生，是一种有效的VEGF结合竞争拮抗剂。
本发明的另一技术方案如下：
一种上述Al-18F标记融合肽的制备方法，包括如下步骤：
（1）制备NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R；
（2）制备18F生理盐水溶液；
（3）制备[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R；
（4）纯化所制得的[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R，即得所述Al-18F标记融合肽。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（1）的反应式如下：
进一步优选的，所述步骤（1）具体为：将[2-[2-(芴甲氧羰基-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸溶于1mL DMF（二甲基甲酰胺）中，加入NHS（N-羟基琥珀酰亚胺，也称为HOSU）和DCC（二环已基本碳二亚胺），室温下搅拌反应2小时；将RGDyK-Lys-Ac-A7R加入上述反应液中，用DIEA（N,N-二异丙基乙胺）将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜；向反应液中加入3mL0.5MpH=7.0的NH4OAc缓冲液并过滤，滤液经HPLC分离纯化，收集目标产物的馏分，合并后冻干，产物芴甲氧羰基-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R加入20%哌啶于常温下反应30min，脱去芴甲氧羰基，然后加入1，4-二乙酸-1,4,7-三氮杂环壬烷-7-乙酸-N-羟基琥柏酰亚胺（2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic acid，又名NOTA-NHS ester）中反应24h，经HPLC分离纯化，收集目标馏分，合并后冻干，得目标产物NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（2）具体为：在回旋加速器上用核反应18O(p,n)18F制得[18F]F-，然后富集在Sep-Park light QMA柱上，用去离子水淋洗以除去吸附在QMA柱上的金属杂质离子，用0.2～1mL生理盐水洗脱得到18F生理盐水溶液。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（3）具体为：向反应容器中加入3～10μL2nmol/L的AlCl3，10～30μL0.1mol/L pH=4.0的醋酸钠缓冲液，然后加入100～300μL925～1850MBq(25～150mCi)18F-的生理盐水溶液混合物3min，再加入300～600μL1mg/mL的NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R的去离子水溶液。混合物摇匀后在80～110℃反应10～30min，冷却至常温，用HPLC测定其标记率。
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤（4）具体为：将以上反应液缓慢注入事先活化过的Sep-Pak C18柱，再用10～20mL蒸馏水淋洗除去水溶性杂质，吹干后用200～600μL75%的盐酸乙醇淋洗，淋洗液用生理盐水稀释至乙醇含量小于10%，用HPLC测定其保留时间和放化纯，观察其外观性状是否为无色澄清透明液体。
本发明的有益效果是：
1、本发明的Al-18F标记融合肽包括连接在一起的胶质瘤特异性靶向多肽cRGDyK和A7R，利用其不同的靶向生物学特性进一步提高了融合肽对胶质瘤的特异性；
2、本发明的Al-18F标记融合肽利用cRGDyK和A7R对胶质瘤细胞表面相应受体的高亲和力，进一步提高结合区的探针浓聚度，提高靶/非靶比；
3、本发明的Al-18F标记融合肽采用Al-18F的标记方法对其进行标记，标记产率高，不需要纯化。
附图说明
图1为本发明实施例1的实验结果图；
图2为本发明实施例2的实验结果图；
图3为本发明实施例3的实验结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
（1）制备NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R：
反应式如下：
具体为：RGDyK-Lys-Ac-A7R可从国内外购买获得（杭州中肽生化有限公司）。将[2-[2-(芴甲氧羰基-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸溶于1mL DMF（二甲基甲酰胺）中，加入NHS（N-羟基琥珀酰亚胺，也称为HOSU）和DCC（二环已基本碳二亚胺），室温下搅拌反应2小时。将RGDyK-Lys-Ac-A7R加入上述反应液中，用DIEA（N,N-二异丙基乙胺）将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL0.5M NH4OAc缓冲液（pH=7.0）并过滤，滤液经HPLC分离纯化，收集目标产物的馏分，合并后冻干，产物芴甲氧羰基-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R加入20%哌啶于常温下反应30min，脱去芴甲氧羰基，然后加入1，4-二乙酸-1,4,7-三氮杂环壬烷-7-乙酸-N-羟基琥柏酰亚胺（2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)diacetic acid，又名NOTA-NHS ester，购买于CheMatech公司）中反应24h，经HPLC分离纯化，收集目标馏分，合并后冻干，得目标产物NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R经质谱分析确认。
上述HPLC分离，流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙 酸乙腈，梯度洗脱条件，0～10min，95%A；10～25min，95%A～15%A；25～40min，15%A流速为5mL/min，检测波长为220nm.
上述HPLC分析，流动相A为0.1%三氟乙酸水溶液，B为0.1%三氟乙酸乙腈，梯度洗脱条件，0～10min，95%A；10～25min，95%A～15%A；25～40min，15%A流速为1mL/min，检测波长为220nm
MS,m/z:1044.4([M+2H]2+)
（2）制备18F生理盐水溶液：在回旋加速器上用核反应18O(p,n)18F制得[18F]F-，然后富集在Sep-Park light QMA柱（美国waters/沃特世公司）上，用5mL去离子水淋洗以除去吸附在ＱＭＡ柱上的金属杂质离子，用0.2～1mL生理盐水洗脱得到生理盐水溶液。
（3）制备[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R：向1.5mL的EP管中加入3～10μL2nmol/L的AlCl3，10～30μL0.1mol/L pH=4.0的醋酸钠缓冲液，然后加入100～300μL925～1850MBq(25～150mCi)18F-的生理盐水溶液混合物3min，再加入300～600μL1mg/mL的NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R的去离子水溶液。混合物摇匀后在80～110℃反应10～30min，冷却至常温，用HPLC测定其标记率。
（4）纯化所制得的[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R，即得所述Al-18F标记融合肽：将以上反应液缓慢注入事先活化过的Sep-Pak C18柱（美国waters/沃特世公司），再用10～20mL蒸馏水淋洗除去水溶性杂质，吹干后用200～600μL75%的盐酸乙醇淋洗，淋洗液用生理盐水稀释至乙醇含量小于10%，用HPLC测定其保留时间和放化纯，观察其外观性状是否为无色澄清透明液体。经衰变校正的放化产率约40-65%，放化纯度＞95%。
（5）荷U87MG肿瘤裸鼠MicroPET显像：U87MG荷瘤裸鼠麻醉状态下经 尾静脉分别注射0.1ml[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R（7.4MBq）并于注射后1h采集5min静态图像（如图1所示）。图像通过二维有序子集最大期望值法(ordered subset expectationmaximization，OSEM)进行空间重构。在衰变校正的冠状面显像图中，用ASI Pro5.2.4.0软件圈出肿瘤、正常组织和器官的感兴趣区域(region of interest，ROI)，计算肿瘤模型中肿瘤/非肿瘤（T/NT）的放射性比值，肿瘤/肌肉=4.91±0.63。
实施例2
该实施例为对比实施例，对比物为[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK，结构式如下：
其制备方法如下：
（1）RGDyK可从国内外购买获得。将[2-[2-(芴甲氧羰基-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸溶于1mL DMF（二甲基甲酰胺）中，加入NHS（N-羟基琥珀酰亚胺，也称为HOSU）和DCC（二环已基本碳二亚胺），室温下搅拌反应2小时。将RGDyK加入上述反应液中，用DIEA（N,N-二异丙基乙胺）将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL0.5M NH4OAc缓冲液（pH=7.0）并过滤，滤液经HPLC分离纯化，收集目标产物的馏分，合并后冻干，产物芴甲氧羰基-PEG-RGDyK加入20%哌啶于常温下反应30min，脱 去芴甲氧羰基，然后加入2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)d iaceticacid（购买于CheMatech公司）中反应24h，经HPLC分离纯化，收集目标馏分，合并后冻干，得目标产物NOTA-PEG-RGDyK经质谱分析确认。
（2）18F-生理盐水溶液的制备：在回旋加速器上用核反应18O(p,n)18F制得[18F]F-，然后富集在Sep-Park light QMA柱上，用5mL去离子水淋洗以除去吸附在QMA柱上的金属杂质离子，用0.2～1mL生理盐水洗脱得到生理盐水溶液。
（3）[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK的制备：向1.5mL的EP管中加入3～10μL2nmol/L的AlCl3，10～30μL0.1mol/L pH=4.0的醋酸钠缓冲液，然后加入100～300μL925～1850MBq(25～150mCi)18F-的生理盐水溶液混合物3min，再加入300～600μL1mg/mL的NOTA-PEG-RGDyK的去离子水溶液。混合物摇匀后在80～110℃反应10～30min，冷却至常温，用HPLC测定其标记率。
（4）产品的纯化：将以上反应液缓慢注入事先活化过的Sep-Pak C18柱，再用10～20mL蒸馏水淋洗除去水溶性杂质，吹干后用200～600μL75%的盐酸乙醇淋洗，淋洗液用生理盐水稀释至乙醇含量小于10%，用HPLC测定其保留时间和放化纯，观察其外观性状是否为无色澄清透明液体，经衰变校正的放化产率约40-65%，放化纯度＞95%
（5）荷U87MG肿瘤裸鼠MicroPET显像：U87MG荷瘤裸鼠麻醉状态下经尾静脉分别注射0.1ml[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK（7.4MBq）并于注射后1h采集5min静态图像（如图2所示）。图像通过二维有序子集最大期望值法(ordered subset expectation maximization，OSEM)进行空间重构。在衰变校正的冠状面显像图中，用ASI Pro5.2.4.0软件圈出肿瘤、正常组织和器官 的感兴趣区域(region of interest，ROI)，计算肿瘤模型中肿瘤/非肿瘤（T/NT）的放射性比值，肿瘤/肌肉=4.21±0.33。
实施例3
该实施例为对比实施例，对比物为[Al18F]NOTA-PEG3-A7R，结构式如下：
（1）A7R可从国内外购买获得。将[2-[2-(芴甲氧羰基-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸溶于1mL DMF（二甲基甲酰胺）中，加入NHS（N-羟基琥珀酰亚胺，也称为HOSU）和DCC（二环已基本碳二亚胺），室温下搅拌反应2小时。将ATWLPPR加入上述反应液中，用DIEA（N,N-二异丙基乙胺）将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL0.5M NH4OAc缓冲液（pH=7.0）并过滤，滤液经HPLC分离纯化，收集目标产物的馏分，合并后冻干，产物芴甲氧羰基-PEG-A7R加入20%哌啶于常温下反应30min，脱去芴甲氧羰基，然后加入2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)d iaceticacid（购买于CheMatech公司）中反应24h，经HPLC分离纯化，收集目标馏分，合并后冻干，得目标产物NOTA-PEG-A7R经质谱分析确认。
（2）18F-生理盐水溶液的制备：:在回旋加速器上用核反应18O(p,n)18F制得[18F]F-，然后富集在Sep-Park light QMA柱上，用5mL去离子水淋洗以除去 吸附在ＱＭＡ柱上的金属杂质离子，用0.2～1mL生理盐水洗脱得到生理盐水溶液。
（3）[Al18F]NOTA-PEG-A7R的制备：向1.5mL的EP管中加入3～10μL2nmol/L的AlCl3，10～30μL0.1mol/L pH=4.0的醋酸钠缓冲液，然后加入100～300μL925～1850MBq(25～150mCi)18F-的生理盐水溶液混合物3min，再加入300～600μL1mg/mL的NOTA-PEG-A7R的去离子水溶液。混合物摇匀后在80～110℃反应10～30min，冷却至常温，用HPLC测定其标记率。
（4）产品的纯化：:将以上反应液缓慢注入事先活化过的Sep-Pak C18柱，再用10～20mL蒸馏水淋洗除去水溶性杂质，吹干后用200～600μL75%的盐酸乙醇淋洗，淋洗液用生理盐水稀释至乙醇含量小于10%，用HPLC测定其保留时间和放化纯，观察其外观性状是否为无色澄清透明液体。
经衰变校正的放化产率约40-65%，放化纯度＞95%
（5）荷U87MG肿瘤裸鼠MicroPET显像：U87MG荷瘤裸鼠麻醉状态下经尾静脉分别注射0.1ml[Al18F]NOTA-PEG-A7R（7.4MBq）并于注射后1h采集5min静态图像（如图3所示）。图像通过二维有序子集最大期望值法(ordered subset expectation maximization，OSEM)进行空间重构。在衰变校正的冠状面显像图中，用ASI Pro5.2.4.0软件圈出肿瘤、正常组织和器官的感兴趣区域(region of interest，ROI)，计算肿瘤模型中肿瘤/非肿瘤（T/NT）的放射性比值，肿瘤/肌肉=3.12±0.52.
实施例4
（1）制备NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R：RGDyK-Lys-Ac-A7R可从国内外购买获得。将[2-[2-(芴甲氧羰基-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸溶于1mL DMF（二甲基甲酰胺）中，加入NHS（N-羟基琥珀酰亚胺，也称为HOSU）和DCC（二环已基本碳二亚胺），室温下搅拌反应2小时。将RGDyK-Lys-Ac-A7R加入上述反应液中，用DIEA（N,N-二异丙基乙胺）将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL0.5M NH4OAc缓冲液（pH=7.0）并过滤，滤液经HPLC分离纯化，收集目标产物的馏分，合并后冻干，产物芴甲氧羰基-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R加入20%哌啶于常温下反应30min，脱去芴甲氧羰基，然后加入2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)d iaceticacid（购买于CheMatech公司）中反应24h，经HPLC分离纯化，收集目标馏分，合并后冻干，得目标产物NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R经质谱分析确认。
（2）制备18F生理盐水溶液：在回旋加速器上用核反应18O(p,n)18F制得[18F]F-，然后富集在Sep-Park light QMA柱上，用5mL去离子水淋洗以除去吸附在ＱＭＡ柱上的金属杂质离子，用0.2～1mL生理盐水洗脱得到生理盐水溶液。
（3）制备[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R：向1.5mL的EP管中加入3μL2nmol/L的AlCl3，30μL0.1mol/L pH=4.0的醋酸钠缓冲液，然后加入100μL925～1850MBq(25～150mCi)18F-的生理盐水溶液混合物3min，再加入300μL1mg/mL的NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R的去离子水溶液。混合物摇匀后在80℃反应10～30min，冷却至常温，用HPLC测定其标记率。
（4）纯化所制得的[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R，即得所述Al-18F标记融合肽：将以上反应液缓慢注入事先活化过的Sep-Pak C18柱，再用10mL蒸馏水淋洗除去水溶性杂质，吹干后用200～600μL75%的盐酸乙醇淋 洗，淋洗液用生理盐水稀释至乙醇含量小于10%，用HPLC测定其保留时间和放化纯，观察其外观性状是否为无色澄清透明液体。经衰变校正的放化产率约42%，放化纯度＞95%。
实施例5
（1）制备NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R：RGDyK-Lys-Ac-A7R可从国内外购买获得。将[2-[2-(芴甲氧羰基-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸溶于1mLDMF（二甲基甲酰胺）中，加入NHS（N-羟基琥珀酰亚胺，也称为HOSU）和DCC（二环已基本碳二亚胺），室温下搅拌反应2小时。将RGDyK-Lys-Ac-A7R加入上述反应液中，用DIEA（N,N-二异丙基乙胺）将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜。向反应液中加入3mL0.5M NH4OAc缓冲液（pH=7.0）并过滤，滤液经HPLC分离纯化，收集目标产物的馏分，合并后冻干，产物芴甲氧羰基-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R加入20%哌啶于常温下反应30min，脱去芴甲氧羰基，然后加入2,2'-(7-(2-((2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)oxy)-2-oxoethyl)-1,4,7-triazonane-1,4-diyl)d iacetic acid（购买于CheMatech公司）中反应24h，经HPLC分离纯化，收集目标馏分，合并后冻干，得目标产物NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R经质谱分析确认。
（2）制备18F生理盐水溶液：在回旋加速器上用核反应18O(p,n)18F制得[18F]F-，然后富集在Sep-Park light QMA柱上，用5mL去离子水淋洗以除去吸附在ＱＭＡ柱上的金属杂质离子，用0.2～1mL生理盐水洗脱得到生理盐水溶液。
（3）制备[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R：向1.5mL的EP管中 加入10μL2nmol/L的AlCl3，30μL0.1mol/L pH=4.0的醋酸钠缓冲液，然后加入200μL925～1850MBq(25～150mCi)18F-的生理盐水溶液混合物3min，再加入600μL1mg/mL的NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R的去离子水溶液。混合物摇匀后在110℃反应30min，冷却至常温，用HPLC测定其标记率。
（4）纯化所制得的[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R，即得所述Al-18F标记融合肽：将以上反应液缓慢注入事先活化过的Sep-Pak C18柱，再用10～20mL蒸馏水淋洗除去水溶性杂质，吹干后用600μL75%的盐酸乙醇淋洗，淋洗液用生理盐水稀释至乙醇含量小于10%，用HPLC测定其保留时间和放化纯，观察其外观性状是否为无色澄清透明液体。经衰变校正的放化产率约64%，放化纯度＞95%。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (1)
1.一种Al-18F标记融合肽的制备方法，其特征在于：该Al-18F标记融合肽包括连接在一起的胶质瘤特异性靶向多肽cRGDyK和A7R，其结构式如下：
其中，n＝1，该方法包括如下步骤：
(1)制备NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R：将[2-[2-(芴甲氧羰基-氨基)乙氧基]乙氧基]乙酸溶于1mL DMF中，加入NHS和DCC，室温下搅拌反应2小时；将RGDyK-Lys-Ac-A7R加入上述反应液中，用DIEA将pH调节到8.0-8.5，室温搅拌过夜；向反应液中加入3mL 0.5M pH＝7.0的NH4OAc缓冲液并过滤，滤液经HPLC分离纯化，收集目标产物的馏分，合并后冻干，产物芴甲氧羰基-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R加入20％哌啶于常温下反应30min，脱去芴甲氧羰基，然后加入1，4-二乙酸-1,4,7-三氮杂环壬烷-7-乙酸-N-羟基琥柏酰亚胺中反应24h，经HPLC分离纯化，收集目标馏分，合并后冻干，得目标产物NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R；
(2)制备18F生理盐水溶液：在回旋加速器上用核反应18O(p,n)18F制得[18F]F-，然后富集在Sep-Park light QMA柱上，用去离子水淋洗以除去吸附在QMA柱上的金属杂质离子，用0.2～1mL生理盐水洗脱得到18F生理盐水溶液；
(3)制备[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R：向反应容器中加入3～10μL 2nmol/L的AlCl3，10～30μL 0.1mol/L pH＝4.0的醋酸钠缓冲液，然后加入100～300μL 925～1850MBq的上述18F-生理盐水溶液混合3min，再加入300～600μL 1mg/mL的NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R的去离子水溶液，混合物摇匀后在80～110℃反应10～30min，冷却至常温，用HPLC测定其标记率；
(4)纯化所制得的[Al18F]NOTA-PEG-RGDyK-Lys-Ac-A7R，即得所述Al-18F标记融合肽：将步骤(3)所得物料缓慢注入事先活化过的Sep-Pak C18柱，再用10～20mL蒸馏水淋洗除去水溶性杂质，吹干后用200～600μL 75％的盐酸乙醇淋洗，淋洗液用生理盐水稀释至乙醇含量小于10％，用HPLC测定其保留时间和放化纯，观察其外观性状是否为无色澄清透明液体。
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